黄曲霉毒素g1长期灌胃对nih小鼠肺泡上皮细胞spc和pcna表达的影响

黄曲霉毒素g1长期灌胃对nih小鼠肺泡上皮细胞spc和pcna表达的影响 黄曲霉毒素G1长期灌胃对NIH小鼠肺泡上 皮细胞SP C和PCNA表达的影响         &nb sp;   作者:申海涛～张祥宏～黄向华～李月红～邢凌霄～严霞～王俊灵  【摘要】  目的 探讨黄曲霉毒素G1长期灌胃对NIH小鼠肺泡上皮细胞SP C和PCNA蛋白表达的影响。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 将60只NIH小鼠随机分为3组:AFG1小剂量组,3μg/kg 组,、AFG1大剂量组30μg/kg 组和对照组。实验组经口灌胃NIH小鼠AFG1～对照组灌胃同等容量生理盐水～3次/周～连续灌胃24周。实验第58周处死实验动物～光镜下观察肺组织病理学改变～采用免疫组化染色方法检测?型肺泡上皮细胞特异分化标志物SP C蛋白和细胞增殖活性相关抗原PCNA的表达情况。结果 小剂量AFG1组和大剂量AFG1组肺泡上皮细胞SP C标记指数分别为(31.63〒5.51)%和(33.58〒4.84)% 明显高于对照组,19.72〒1.92)%～P<0.01。小剂量AFG1组和大剂量AFG1组肺组织PCNA标记指数分别为(27.64〒9.22)% 和(30.08〒9.35)% 也明显高于对照组(7.91〒1.89)%～P<0.01。结论 黄曲霉毒素G1长期灌胃NIH小鼠可以促进肺泡上皮细胞中?型肺泡上皮细胞特异分 化标志物SP C和细胞增殖活性相关抗原PCNA的表达。 【关键词】  黄曲霉毒素; 肺泡上皮细胞,肺表面 活性蛋白 C    Abstract:Objective   To explore the effects of oral administration of aflatoxin G1 on SP C and PCNA expression of alveolar epithelial cells in NIH mice.Methods  NIH mice were randomly divided into three groups. Two experimental groups were treated intragastrically by gavage with AFG1 3g/kg and AFG1 30g/kg respectively, 3 times a week for 24 weeks. The mice in control group were correspondently treated with normal saline. All mice were fed with food that was free of AFGs as confirmed by HPLC analysis and then sacrificed and examined pathologically at the 58 weeks. The expression of SP C and PCNA alveolar epithelial cells were determined by immunohistochemical staining.Results  The immunohistochemical labelling index of SP C of alveolar epithelial cells in AFG1 3g/kg and AFG1 30g/kg group were (31.63〒 5.51)%  and (33.58〒4.84)%  respectively, which were significantly higher than that in control group(19.72〒1.92)%～P<0.01. The labelling index of PCNA of alveolar epithelial cells in AFG1 3μg/kg and AFG1 30μg/kg group were significantly higher than that in control group (27.64〒9.22)%    and (30.08〒9.35)%  vs (7.91〒1.89)%～ P<0.01.Conclusion  Oral administration of AFG1 can significantly increase the expression of SP C and PCNA of alveolar epithelial cells in NIH mice. Key words:Aflatoxins; Alveolar epithelial cells; Surfactant protein C 0  引言     黄曲霉毒素(Aflatoxins, AF)是黄曲霉菌 (Aspergillus flavus)等真菌产生的具有致癌作用的真菌毒 素～包括AFB1、B2、G1、G2和M1等。既往研究表明～AFG1 在我国胃癌、食管癌高发区居民饮食中的检出率很高～是粮 食中常见的污染真菌毒素之一[1 3]。动物实验发现AFG1 可诱发实验动物肺癌发生[4],诱发小鼠肺腺癌组织中?型 肺泡上皮细胞的特异分化标志物—表面分泌蛋白 C (Surfactant protein C, SP C)表达阳性～判断其组织可能来源于?型肺泡上皮细胞(Alveolar type ?cell, AT ?) [5,6]。目前有关AFG1对肺泡上皮细胞SP C表达影响的研究未见报道。为进一步探讨AFG1长期作用对肺泡上皮细胞SP C表达及细胞增殖的影响～本研究采用病理形态学和免疫组化方法 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了长期灌胃AFG1后NIH小鼠肺组织SP C和反映细胞增殖活性PCNA抗原的表达情况。 1  材料与方法 1.1  实验动物及分组     60只清洁级近交系NIH小鼠购自卫生部北京生物制品研究所动物中心～雌雄各半～鼠龄4周～体重16，18g～动物随机分为3组～小剂量AFG1组(3μg/kg )、大剂量AFG1组(30μg/kg)和对照组～每组20只～雌雄各半～分笼喂养。 1.2  实验动物处理     待动物适应环境后进行灌胃处理。将AFG1(美国Sigma公司)用1%乙醇溶解后用生理盐水稀释成所需浓度～实验组分别按(3μg/kg和3 10μg/kg body weight)剂量经口灌胃NIH小鼠AFG1～对照组灌胃同等容量生理盐水。每次灌胃容量0.5ml～3次/周～连续灌胃24周。采用新收获粮食认真淘洗、晾晒、按照 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 小鼠饲料配方配制动物饲料～经60Co辅照灭菌后～应用HPLC方法检测无黄曲霉毒素后～将饲料密闭保存用于动物饲养。饮用水为城市自来水～隔日刷瓶换水1次。室内温度控制在18?，24?～相对湿度40%，80%。密切观察动物情况～第58周股动脉放血处死动物～小鼠肺组织常规取材4%甲醛固定～石蜡包埋、常规切片～用于HE染色和免疫组化检测。实验间期死亡动物均进行解剖～全面仔细检查各脏器组织病理变化。 1.3  肺组织形态学观察及SP C和PCNA蛋白表达的免疫组化检测     肺组织石蜡包埋、组织块常规切片及HE染色～光镜下观察～按黄向华等的标准进行诊断,5,。山羊抗小鼠SP C单克隆抗体～由Santa Cruz公司提供,小鼠抗人PCNA多克隆抗体～由NEOMARKERS公司提供,SP检测试剂盒及DAB显色试剂盒均为北京中山生物制剂公司提供。免疫组化参照试剂盒 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 按SP法进行。免疫组织化学结果判定:SP C阳性反应产物为细胞浆出现棕黄色细颗粒状染色。PCNA阳 性染色为细胞核呈棕黄色染色。每例标本在高倍镜下随机选取10个有意义高倍视野(避开支气管、血管、肺组织边缘部和癌组织)～计数高倍视野细胞中SP C和PCNA阳性细胞百分数～取其平均值作为SP C和PCNA标记指数。 1.4  统计学方法    数据用〒s表示～采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析。 2  结果 2.1  实验动物一般状况     实验组灌胃AFG1动物的一般状况与对照组比较差异无显著性。实验开始阶段(8周内)由于灌胃意外原因～小剂量AFG1组死亡动物10只～大剂量AFG1组死亡动物6只～对照组死亡8只～病理检查未见明显特异性病变。58周后小剂量组可供分析小鼠10只,大剂量组14只,对照组12只。 2.2  肺组织病理学变化     病理形态学观察可见对照组动物肺泡结构清楚～支气管和肺泡上皮均无明显增生改变。小剂量AFG1组和大剂量AFG1组共24只给予AFG1实验动物肺组织中9例发生肺腺癌～发生率为37.5%～余15例标本肺组织肺泡上皮细胞和支气管粘膜上皮细胞出现程度不同的增生性病变,见图1。 2.3  AFG1对肺组织SP C蛋白表达的影响     免疫组化染色结果表明～SP C阳性免疫反应定位于细胞质～呈棕黄色颗粒状～对照组和实验组小鼠肺泡均有部分细胞呈阳性表达,见图2。AFG1小剂量组和大剂量组肺泡细胞SP C阳性标记指数分别为(31.63〒5.51)%和(33.58〒4.84)%～明显高于相应对照组(19.72〒1.92)%～P<0.01～见表1～表明AFG1长期灌胃NIH小鼠可诱发肺泡?型细胞数目增多～提高肺泡上皮细胞SP C蛋白的表达。 2.4  AFG1对肺泡上皮细胞PCNA蛋白表达的影响     免疫组化染色～PCNA阳性反应定位于细胞核～呈棕黄色颗粒状。对照组和实验组小鼠肺泡细胞均可见部分细胞胞 核呈阳性表达～见图3～AFG1小剂量组和大剂量组肺泡细胞PCNA标记指数明显高于对照组(P<0.01)～见表1。提示长期灌胃AFG1可明显增高NIH小鼠肺泡细胞的增殖活性。 表1  AFG1长期灌胃对小鼠肺泡上皮细胞SP C和PCNA表达的影响,略, ANOVA～*P<0.01～compare with control 3  讨论     国外研究发现外源性致癌因素诱发小鼠肺腺癌的发生往往先出现肺泡上皮的增生性病变[7,8]。本实验发现在24例AFG1长期灌胃NIH小鼠肺组织标本中～除9例诱发出肺腺癌外～其余15例肺组织标本全部出现程度不同的增生性病变～说明AFG1还有明显致肺组织增生性病变作用。AFG1长期作用后肺泡上皮形态学改变与肺腺癌的发生、发展有密切关系。同时由于肺泡结构改变而引发的肺泡上皮功能的改变可能在肺腺癌的发生过程中起到重要作用。     肺表面分泌蛋白分为SP A、SP B、SP C和SP D～主要由?型肺泡上皮细胞(AT ?)和支气管无纤毛上 皮细胞Clara细胞分泌～对降低肺泡表面张力～维持肺泡结构和功能起到重要作用[9]。近年来研究发现肺表面分泌蛋白在肺部非特异免疫反应方面有重要作用～是肺部抵抗外来病源的第一道防线。SP C蛋白是小分子量疏水蛋白～主要功能是促进磷脂吸附和分布到肺泡气,液交接面～促进磷脂单分子层的形成～降低肺泡表面张力。目前有文献报导AT ?特异分化标志物SP C在基因和蛋白水平表达异常可以引起肺脏功能异常～引发相关疾病[10 12]。Mason等[13]在用乌拉坦诱发的A J小鼠肺腺癌模型中～发现肺腺癌组织中SP C蛋白高表达。本实验室前期实验发现在AFG1长期灌胃NIH小鼠诱发肺腺癌组织中SP C蛋白高表达。说明SP C蛋白表达增高在外源性致癌因素诱发肺腺癌过程中可能与肿瘤的发生有密切关系。     本实验免疫组化检测发现～给予AFG1长期灌胃处理后～AFG1小剂量和大剂量组肺泡上皮细胞SP C表达明显增加～AFG1长期灌胃促进肺泡上皮细胞SP C的表达～表明AT ?对AFG1的生物作用敏感导致细胞功能发生改变～从而导致SP C蛋白高表达参与AFG1致肺组织病变过程中。说明AFG1长期灌胃实验动物诱导?型肺泡上皮细胞增生、分化、进而引起细胞功能发生改变～可能是AFG1诱发肺腺癌的重要前提。免疫组化检测发现AFG1小剂量和大剂量组 肺泡上皮细胞PCNA表达明显高于对照组～表明AFG1长期作用具有明显的促肺泡上皮细胞增殖作用～对肺泡上皮细胞具有致恶性转化生物效应～可能是AFG1致癌作用的可能机制之一。进一步说明在AFG1致肺组织发生恶性转化过程中SP C高表达可能是一个重要的分子信号～其在肺泡上皮细胞中表达增高可能参与AFG1诱发肺组织肿瘤过程中。     综合以上实验结果表明～长期经口给予NIH小鼠AFG1作用～可以增加小鼠肺泡上皮细胞SP C和PCNA蛋白的表达～提示AFG1对肺泡上皮细胞具有致癌变生物效应～长期作用引起的肺泡上皮细胞功能异常 改变可能在肺腺癌的发生中具有重要作用。 【参考文献】   [1] Zhang XH, Xie TX, Li SS, et al. 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