制备大豆抗氧化肽用酶的筛选

制备大豆抗氧化肽用酶的筛选 第4O卷第4期 2oo9年4月 东北农业大学学报 J0umalofNortheastAgri''ulIuraIUniversiy 4O(4):95,98 Apr.20o9 文章编号l005—9369(20o9)o4一o095一o4 制备大豆抗氧化肽用酶的筛选 曾婷,吴非 (东北农业大学食品学院,哈尔滨15oo30) 摘要:文章研究了由碱性蛋白酶,风味蛋白酶,木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶,胃蛋白酶,胰 蛋白酶等蛋白酶 水解制备的大豆抗氧化肽的水解度和A0v值.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,失豆抗氧化肽的A0v值大 小和水解度的大小与酶的种 类有关,以A0v值为指标,筛选出碱性蛋白酶为最佳用酶. 关键词:大豆抗氧化肽;水解度;A0V值 中图分类号:S565.1文献标识码:A 近年来研究发现,大豆肽在体外具有抗氧化 活性.chen等发现大豆蛋白酶解物具有抗亚油 酸脂质过氧化作用I".张学忠发现在邻苯三酚自 氧化反应体系中添加40mg?mL一大豆多肽,邻 苯三酚白氧化速率被抑制27%,这说明大豆蛋白 酶解物具有清除超氧阴离子作用l2l.陈美珍等研 究发现大豆分离蛋白酶解物具有清除羟自由基的 能力?.目前,制备大豆抗氧化肽用酶尚未明确, 所以筛选出制备大豆抗氧化肽最佳用酶具有重要 意义. 当机体代谢和外界刺激产生过多自由基时, 自由基会提供生物膜,破坏生命大分子,促进机 体衰老,并诱发肿瘤和动脉硬化的产生[4l.大豆蛋 白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽,这类 活性肽能抑制机体内自由基的大量积累,对提高 自由基清除机制起到一定功效.大豆抗氧化肽能在 一 定程度上消除机体内多种生理功能的障碍,延缓 机体的衰老;减少各种老年性疾病的发生『I'.同 时对亚油酸等不饱和脂肪酸,邻苯j酚等的自动 氧化具有一定的抑制作用l7l. 蛋白质经酸水解,酶解等 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 处理后都可得 到抗氧化肽,由于酶促反应条件温和,反应易于 控制,专一性较强,副产物少,因此利用酶解方 式最多吲,并且通过蛋白酶在温和条件下水解蛋白 收稿日期:2oo9一o3一lO 基金项目:国家"十一五"科技支撑 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(20o6BAD05A08) 作者简介:曾婷(1981一),女,山东人,硕士研究生,研究方向 为粮食油脂及植物蛋白工程. }通讯作者:教授,博士,E—rnail:wrneau@l63.c()Jn 质获得,食用安全性高. l材料与方法 1.1材料与设备 大豆分离蛋白,由黑龙江大豆研究中心提供; 胃蛋白酶(12563u?g),胰蛋白酶(9265u?g), 碱性蛋白酶(1ll92U?g),木瓜蛋白酶(23l06 u?g)均购自无锡杰能科生物有限公司;菠萝蛋白 酶(17338U?g)购自广州丰天化工有限公司;风味 复合酶(26316u?g)购自无锡杰能科生物有限公 司;1m0l?NaOH溶液,2mo1.Hcl溶液等. 1.2仪器 LD4—2A离心分离机,北京医用离心机厂; pHs一25型酸度计,上海伟业仪器厂;KDN—o4型 凯氏定氮仪,上海新嘉电子有限公司;79—2双向 磁力电动搅拌器,上海卓康生物科技有限公司;电 热恒温水浴锅,东方电工仪器厂. 1.3方法 1-3.1氮含量测定 采用凯式定氮法(GB仃'5009.5—2O03). 1_3.2大豆抗氧化肽溶液的制备 配制5%(w,v)的大豆分离蛋白溶液,迅速加 热至85?,经85?水浴保温热处理20min后冷 却至酶最佳水解温度,保持温度和搅拌速度不变, 同时用lmo卜L『'NaOH(HC1) 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液调节溶液pH 至酶解最佳pH.按比例称取蛋白酶加到大豆蛋白 溶液中,开始计时,在反应过程中及时加入NaOH (HC1)标准溶液维持pH不变,从2h开始,每隔l ? 96'东北农业大学学报第40卷 h提取20mL溶液,然后迅速升温到1O0?灭酶活 l0min,冷却后,5000r?min离心l0min,取上 清液. 1.3.3水解度(DH)的测定 采用pH—stat法,当蛋白质的酶解条件在pH 7.0以上进行时,释放的氨基酸使溶液pH明显下 降.,用稀碱液将其滴定回起始pH,可根据消耗 碱量计算水解度,称为pH—stat法(AdlerNissen, l986). 水解度=(水解的肽键数/总肽键数)×1o0% 水解度(DH%)=?oHx??0H/(×.×H)×1o0% 式中,一:消耗碱液的体积(mL);,v: 消耗碱液的的摩尔浓度(mo1.I『1);:氨基酸的解 离数;:参加水解的蛋白总量(g);日:每克原 料蛋白质中肽键的mmol数,对大豆分离蛋白,该 值取7.8. 1_3.4AOV值的测定 取样品0.5g溶解并定容到100mL,取1OmL 加入0.25mL,lmo1.L的硫酸和5mL,0.25 m0卜L的H0,室温反应10min,加入10%KI 溶液20mL,暗处反应5min,用0.05mo1.L., NaSO滴定,用l%,2%的淀粉指示剂作空白. A0V值=(空一样)×34/0.1 式中,空为空白所消耗的Na2sO,体积;样 为样品所消耗的NaS:O体积;为Na2SO的摩 尔质量. 1.3.5制备大豆抗氧化肽的最佳酶的筛选 配制5%大豆分离蛋白溶液6份,在85?水浴 加热20min,分别用6000u?酶活单位的木瓜蛋 白酶,菠萝蛋白酶,碱性蛋白酶,风味蛋白酶,胃 蛋白酶,胰蛋白酶进行水解,通过预试验和资料查 询,确定各种蛋白酶的最佳pH和水解温度(见表 1).水解2,8h,水解结束后,于100?15rnin灭 酶,40o0r?min离心15min,取上清液于旋转蒸 发器中浓缩,将浓缩液进行冷冻干燥,取1g干燥 粉末溶解定容到10mL,测定其AOV值和水解度. 表l各种蛋白酶的最佳水解温度和最佳pH TablelThebesthydroIysistimeandthebestpHvaIueofdifferentproteaseenzymes 2结果与分析 2.1大豆分离蛋白常规指标 以大豆分离蛋白为原料,对原料进行物性测 定,蛋白含量为84.33%,水分含量为3.72%,灰 分含量为3.04%. 2.2不同水解酶在不同水解时间下的水解度 结果见表2. 由表2可知,大豆分离蛋白在各种蛋白酶的酶 解条件下,随着酶作用时间的延长,水解度逐渐升 高,至5h后基本不再变化;所以大豆分离蛋白在 各种蛋白酶作用下的最佳酶解时间是5h,2—4h 水解度不断提高.4,5h水解度继续提高,但差异 不显着,6,8h水解度基本不变.大豆分离蛋白在 碱性蛋白酶的水解作用下,28h水解度均高于其 他5种蛋白酶. 2.3不同水解酶在不同水解时间下的AoV值 结果见表3. 由表3可知,大豆分离蛋白在各种单一蛋白酶 (胃蛋白酶,胰蛋白酶,风味蛋白酶,碱性蛋白酶, 木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶)的酶解条件下,随着酶 作用时间的延长,抗氧化性迅速升高,至5h达到 最高值;之后开始下降,此时其产物的抗氧化能力 最强.在相同酶解时间不同蛋白酶作用下,胃蛋白 酶作用的酶解产物的A0V值最小,菠萝蛋白酶次 之,而碱性蛋白酶作用的酶解产物的A0V值最大. 水解时间决定了水解程度,水解度的大小对肽段长 度,游离氨基酸的相对含量是至关重要的.如肽段 第4期曾婷等:制备大豆抗氧化肽用酶的筛选 过长,则其有抗氧化活性;如水解程度过高,游离 氨基酸的相对含量增加,具有抗氧化活性的肽被进 一 步水解,破坏了维持其抗氧化活性的结构上的完 整特征,肽作为阻止脂质体中脂氧化的物理屏障能 力减弱.很显然,为了得到更强的抗氧化水解物, 大豆蛋白主要部分的水解程度必须有一定的极限. 大豆分离蛋白在碱性蛋白酶的水解作用下,AOV 值最大. 表2不同蛋白酶在不同水解时间下的水解度 TabIe2ThedegreeOfhydr0lysis.mdi仃erenthydrolysistimesanddirentprOteases 表3不同蛋白酶在不同水解时间下的AOv值 Table3TheAOVValueinmff色renthydrOlysistimesandmfferentprOteases 黄纪念等研究了由碱性蛋白酶,风味蛋白酶, 复合蛋白酶,木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶,胃蛋白 酶,胰蛋白酶等制备的大豆肽的相对抗氧化值,表 明大豆肽溶液的水解度大小与酶的种类有关,碱性 蛋白酶所水解的大豆肽溶液相对抗氧化值最大?, 这与本研究结果基本相似. 3结论 a.大豆分离蛋白在蛋白酶的水解作用下生产 的大豆多肽具有抗氧化性,不同的蛋白酶所制备的 大豆肽的抗氧化能力不同. b.在所研究的6种蛋白酶中,碱性蛋白酶的 水解能力最强.碱性蛋白酶所制备的大豆抗氧化肽 AOV值最大,所以碱性蛋白酶为最佳酶选. [参考文献] 【1]ChenHM,Muram0t0KY,AmauchiF,etaI.Anti0xidativepm— perties0fhistidinecontaini"gpeplidesdesingedfr0mpeptide fra"gn1entsf0undinthedigestsofasoybea"pr0tein[J】.JAgric F0odChem,l998.46:49—53. 【2】张学忠.大豆肽加工技术原理与应用【M].北京:科学技术文献 {版社,l999:l81—20H0. [3】陈美珍.大豆分离蛋白酶解物清除羟自由基的研究【J】.食品科 学,2o02,2343_47. [4】邹远东.引起世界关注的肽的生理特性『J1.当代经济,20o4(9】: ? 98?东北农业大学学报第40卷 39. 【5】ChenH,Mumm0t0K,YamauchiF.stnIcturalanalysis0fanti一 0】【idatiVpeptidesflr0ms0ybean卢一conglycinin【J】.JAgricFb0d Chem,l995,43:574—578. 【6】刘文辉,张兰威.大豆分离蛋白酶法水解制备多肽及应用的研 究旧.东北农业大学学报,20o3(1):40 【7】徐萍.大豆肽抗氧化性测定方法研究【JJ.大豆通报,2oo5(5):24一 ZO. 【8】丁晓雯.抗氧化肽研究进展【J].食品研究与开发,2003(3):36— 38. 【9】方允中,杨胜,武国耀.自由基,抗氧化剂,营养素与健康的关 系『J].营养学报,20o3,25(4):337—342. 【l0】黄纪念,豆康宁,郑学龄.制备抗氧化大豆肽用酶的筛选叨.中 国食物与营养,20o7(4):539—54O. Enzymeselecti0nf10rpreparings0ybean anti一0xidantpeptjdeantl一0XlnantDeDtjde ZENGTing,WUFei (F_o0dCoJlege,N0rthe丑s,Acullura】unjve,y,Hin150O3o'cbina) Abstract:Inthispaper,thedegreeofhydr0lysisandtheA0VValueofthepreparation0fthes0y beananti— oxidantpeptidebythealkalineprotease,naVorpIl0tease,papain,bI.0melain,pepsin,trypsin pI.0teasewerestudie_d. TheIlesultsshow_edthattheA0VValueandthedegreeofhydmlysjsofthesoybeananti一 0xidatpeptideI?lated tothetype0fenzyme.ThealkalineproteaseenzymewasthebestenzymewithA0Vvalueastheindex. 1ywOrds:soybeananti—oxidantpeptide;degreeofhydrolysis;AOVvalue