蛋白质剪接在蛋白质研究和蛋白质工程中的应用

蛋白质剪接在蛋白质研究和蛋白质工程中的应用 ,,,:,,:,,,,,,,,,,:,,,,,:,,,:,,,:,,::, ), 蛋白质剪接在蛋白质研究和蛋白质工程中的应用 ???戴 旭 东孟刘 相 钦清 博 士 研 究 生 ，教 授 ，东华大学生物科学与技术研究所 ，上 海 ,教 授 ， ,:,,,:,,,,,,,,,:,,,:,,,,,,,,, ,:,,,,,,,,,? ? ? ),,，，，，，:,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,::,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 关 键 词 蛋 白 质 剪 接 断裂蛋白质内含子 蛋 白 质 研 究 蛋 白 质 工 程 ,,。 ,蛋 白 质 剪 接 是由蛋白质内含子介导 的在蛋白质水平上翻译后 加的 工 过 程 蛋 白 质 内 含 子 ,:,,,,,,,,,,,, ),,, ，，，,是指前体蛋白中的一段插入序列它在蛋白质翻译后的成熟过程中能自我催 化使 自 身 从 前体蛋白中切除 并 将 ,,,, ，。 其两侧的多肽片段以肽键连接 形成成熟的蛋白质 蛋白质内含子的发现丰富了基因表达 和蛋白质翻译成熟过程的 ，。 、理 论 而且在蛋白质研究和蛋白质工程中有广泛的应 用本 文试图综述蛋白质剪接在蛋白质特异位点标 记蛋 白 质 、、、。片段化标记同位素 蛋 白 质 环 化 蛋 白 质 芯 片 基因治疗等研究中的应用 ,,,:“”，,,,内含子两端的序列称为 即 外 显 子图 蛋 白 质 内 含 子 是 指 前 体 蛋白中的一段插入 ,,,,,,,,,,,,,。 ,，，序 列 它在蛋白质翻译后 的 成熟过程中能自我催化 使 自 ，蛋 白 质 内 含 子 不 同 于 内 含 子 前 者 存 在 于 ,:, ，,身从前体蛋白中切除 并将其两侧称为蛋白质外显子,,,) ，。 ，蛋 白 质 后 者 则 存 在 于 前 体 然 而 蛋 白 质 内 ,,:, ,的多肽片段以正常的 肽 键 连 接形成有功能的成熟蛋 ,,,,,,,),,。 ，含 子 与 内 含 子 也 有 相 似 之 处 首 先 它 ,:, ,,,,:,。，白 质截 至 到 年 月 已 经 有 多 种 蛋 白 质 内 ,:,,,,:: 们 都 插 ,,,，,,,,, 含 子被 发 现 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,，， 入 到 基 因 中 通过自身剪接从前体中剪接下来 将 两 边,。、、它 们 分布在单细胞真核生物 细 菌 古 ,,,,,,,,,,,, 。 ，，的 前 体 连 接 另 外 二者都包含核酸内切 酶 结 构 域 可 、，细 菌 噬菌体和病毒的基 因 组 中 但是在多细胞生物中尚 。以通过类似的归巢机制在基因中转移 ，未 发 现 蛋 白 质 内 含 子 而且它们主要分布在与 复 ,:, 、、，制 转 录 翻译有关的蛋白酶或转移因子上 这 可 能 有 利 ,,,,,。 于蛋白质内含子 的 归 巢 和 生 存由 于 蛋 白 质 ,:,,,, ,,， 剪 接 能 把 两 个多肽以一个天然肽键相连 形 成 ,,,,,,,,,,,图 蛋白质剪接示意图 ,，成 熟 的 有 活 性 的 蛋 白 质 为蛋白质合成和翻译后修饰提 ，供 了 新 的 途 径 因而蛋白质剪接已经被广泛的应用到蛋 蛋白质内含子的结构 ,,, 。 ，白质 研 究 和蛋白质工程中 例 如 这项技术可以应用到 每 一 个 蛋 白 质内含子都包含 端剪接结构域和 : , 、、蛋白质特异位点标记 蛋 白 质片段化标记同位素 蛋 白 质 。端 剪 接 结 构 域 端剪接结构包含两个序列模 块即 : , ,,,:)、、。环 化 基 因 治 疗 蛋白质芯片等研究中 ，。和 端剪接结构包 含两个序列模块即 除 此 和 ,, , , ，之 外 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白质内含子在 端剪接结构域和 端 剪 接 : , ，，结构域之间还存在归巢核酸内切 酶 结 构 域 由 模 块 ,, 蛋白质内含子的生物学特性 , , ，,。和 组 成 图 模 块 端 其位于蛋白质内含子的 , ,, : ，,端 的 第 一个氨基酸残基非常保守 一 般 是 或 : ,,,,, ,蛋 白 质 内 含 子 ,,, ，模 块 位 于 蛋 白 质 内 含 子 的 端 其 端 的 第 一 个 , , , 氨 ，年 分 别 由 和 领 导 的 研 究 小 组 同 ,,,: ,,,,,,,,,,，，基酸残基非常保守 一 般 是 第二个氨基酸残基也非 ,,,,,,,),,。时 在 酵 母 中 发 现 蛋 白 质 剪 接 ,:,,,,,,,,,, ,,,，,常 保 守 一 般 是 模 块 序 列 的 中 ,,,, ,,,,,,,,,,, )))，“”“年 将 插 入 片 段 正 式 命 名 为 ,,,, ,,,,,,,,,,,，,，和 非 常 保 守 是任何氨基酸残基 另 外 端 蛋 白,,,, , ，”即 蛋 。 ,,白 质 内 含 子 并 将 其 定 义 为 在蛋白质成熟，，质 外 显 子 的第一个氨基酸残基非常 保 守 一 般 是 ,, , 过程中被剪 ，。或 越 来 越 多 的 证 据 特别是突变分析和一些 ,,,,,, ， 接掉的一段框内融合于 前 体蛋白的氨基酸序列 蛋 白 质 。 蛋 白 质 内 含 子晶体结构的解析表明这些保守的氨基 酸 端 外 显 子的第一个氨基酸有关 内含子可以不依赖 , 。其他任何因素催化蛋白质就可以剪 接 ，，残 基参与了蛋白质的剪接 如果它们发生突变 将 会 影 ,,,,。,,响蛋白质剪接活性 蛋 白 质 顺 式 剪 接 包 括 应步 亲 核 反 ,,,,,,,,,, ),, ,,,,),,,。 ， ,图 第 一 步 蛋 白 质 内 含 子 端的第一个保守 ,:) ,氨 基 酸 或 引起酰基化重排 ,, ,,, ,,,,,,,,,,,) ,,, ,，端 蛋 白 质外显子与蛋白质内含 子 之 间 的 肽 键 ,,,,:) ，。 ，被 打 开 形 成硫酯键或酯键 第 二 步 端 蛋 白 质 外 显 ,),,,。 标准蛋白质内含 子 结 构 示 意 图 两 端 分 别 是 蛋 图 ,，子 的 第 一 位 氨 基 酸 或 的巯基或羟基攻击 ,,,,,,,,,，白质内含子的剪 接 结 构 域 中间部分是归 巢 核 酸 内 切 酶 ，第一步反应形成的硫酯键或酯键 导 致 端 蛋 白 质 外 显 结 构 域 。，，，，，，是蛋白质内含子的保守模块 。:),,,,,,, 子以硫酯键或 酯 键 连 接 到 端蛋白质外显子的第一位 ,) ,,蛋 白 质 的 顺 式 剪 接 与 反 式 剪 接,,, ,,,,,,,,, )。 ,,氨基酸残基的 侧 链 上 蛋白质内含子的 端 剪 接 点 被 :),, ，,,。 ,,,,,,,,,,,切 断 形 成 分 支 中 间 体 第 三),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ，,步 蛋 白 质 内 含 子 端 的 或 侧链上的酰胺基攻 蛋白质内含子根据 其 结构特征可分为三类 标 准 蛋 ,,,,,,,) ，。 ，,,，,击 端 剪 接 点 的 肽 键 导致该剪接点断裂 至 此 蛋 白 白 质 内 含 子 微小蛋白质内含子 ,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,)), ,,,, ,。和 断 裂 蛋 白 质 内 含 子 图 标 准 。 ，质 内含子与两侧的蛋 白质外显子分开 第 四 步 通 过 自 ,,,,,,,,,,,,,,,,, 蛋 白内含子含有大约 个氨基酸并包括一个归巢核 ，发 的 之间的酰基化重排 两个蛋白质外显子 或 ,:: ,: :: )) ，酸内切酶结构域 而 微 小 蛋白质内含子只有大约 个 ,,: 。 ，之 间的硫酯键或酯键 转变成正常的肽键 这 样 就 完 成 ，氨基酸不包含归巢核酸 内 切 酶 结 构 域 只有蛋白剪切的 。了标准的蛋白质剪接反应 。 ，功 能 虽然很多蛋白内 含 子在序列上没有同源性 但 是 ,断 裂蛋白质内含子介导的反式剪 接 ,,,,,,,,)) ,。 它 们 的 晶 体结构非常接近 微小蛋白质内含子的晶体 ,起始于断裂蛋白质内含子 和 的 相 互 识 别 和 ,,,,,: , ,，结 构 包 括 个 折 叠 它们形成一个圆盘状的蛋白,, β，。结 合 和 紧 密 结 合 后 断裂蛋白质内含子 正 确 折 ,,: , ,,,,,,)。 ， 质 其 剪 切 活 性 中 心 位 于 圆 盘 的 中 央对 于 标 准 ，叠而重建活性中心 之 后 按 照标准蛋白质剪接途径完成 ，蛋 白 质内含子和微小蛋白质 内 含 子 来 说 蛋白质内含子,,,,),: 。蛋白质外显子的连接 ，和蛋 白质外显子位于同一多 肽 链 上 这时发生的蛋白剪 , ,。为 顺 式 剪 接 断裂蛋白质内含 子 是 蛋 接称 ,,,,,,,,,),, 白 质 ，内含子中部区域特定位 点 发 生 断 裂 被分裂成两部 ,,,,，分即 端 区 域 和 端 区 域 分别由不同的开放: ,, ,: , ,,。 阅读 框 编 码 断裂蛋白质内含子的和在 剪 :,,,,: , ，，接 时 相 互 识 别 然后重建催化活性中心 进而发生蛋白 ,,。式 剪 接 质反 ,:,,,,,,,,,,,,,,, ),,, ,,,图 蛋白质的顺式剪接 与 反 式 剪 接 ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,))),,, ,。,,，蛋 白 质 内 含 子 端 剪 接 结 构 域 蛋 白 质 内 含 子 ,,,,: ,, : , , 端 剪 接 结 构 域 ，,归巢核酸内切酶结构域 。,: 蛋 白 质 内 含 子 的 剪 接 机 制 ,,, 蛋 白 质 内 含子介导的蛋白质剪接是一 个 自 我 催化 ,, ,,图 标准蛋白质内含子剪接机制 ,，过 程 只与蛋白质内含子 剪 接活性中心的保守氨基酸和 新型断裂蛋白质内 含 子 ,,, 天 然 断裂蛋白质内含 子 和 人 工 断 裂 , ，典型蛋白质内含子 去 除归巢核酸内切酶结构域后 蛋 白 质 内 含 子，。端 有 个 氨 基 酸 端 有 个 氨 基 酸 : ,,:,,: , ,,,: :: ，在蛋白质工程和蛋白质 研 究 中 蛋白质内含子可以被应 寻找天 然断裂蛋白质内含子 。 ,,,用 于 蛋 白 质 的 半 合 成 因为现有的多肽合成技术不能 ，合 成 多 于 的 多 肽 所 以 只 有 端可以通过化学方 ,::,,, ,,蛋白质反式剪接 是 基 于 断 裂 蛋 白 质 ,,,,,,,,,,,),, 。 , ，。内 含子的一种剪接方式 断裂蛋白质内含子分为两种 法 合 成 而 端不可以通过化学合成的方式获得 : ，一种是天然存在的 另 一 种 是通过基因工程的方法断裂 为 了 将 端合成多肽也能连接到与其互补的重 组: 。，，,,微 小蛋白质内含子的方式 获 得 年 实 验 表 达 蛋 白 上 实 验 室 首 先 在典型断裂位点 ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,: ,,，室 在 蓝 藻以外设计了一系列断裂位点 图 其 中 是 归 巢 核 酸 的 蛋白中首次发现了天 ,,,,,,,:, ,,,, ,,: , ，内 切 酶 的 位 置 其 余 大 部 分 断裂位点是在预测的 折 )β，，然 断裂蛋白质内含子 和 在不同的阅读框中表达 ,,: , ,,,,。 ，,,叠 之间的环状区域通过他们的测试 发 现 蛋 白 质 内 ,, 。二 者 在 基 因 组 中 相 距 这种两段蛋白组 :,,,,,, ,,，，,,,子 的 四 个 断 裂 位 点 具 有 蛋 白 质 反 和 ,,),:含 ,,,,,: ,,。成 的 断 裂蛋白质内含子在许多蓝藻中也 被 发 现 式 。 ，剪 接 活 性 其 中 型 的 只 有 个 氨 基 酸 有 ,, ,,, ,,: , ，天然断裂蛋白质内含子 的 发 现 暗示了标准蛋白质内含 。 ，个 氨 基 酸 随 后 实验室又验证了在微小,,,,,,, ,, ，子在进化中丢失了归巢 内 切 酶 结 构 域 导致两端的剪接 蛋白 质 内 含 子 中 断裂位点处有高剪,,,,, ,,, ，结构域在不同的阅读框 中 表 达 而且这两段蛋白可以重 , ,,,,,。性型断裂蛋白质内含子的 ，只 有 个 氨 基 酸 ,,, , ,接活 , ，新组装成为有活性的蛋 白 质 内 含 子 这为构建人工断裂 有 个 氨 基 酸 。,,,: 。: 蛋白质内含子提供了理论依据 新 型断裂蛋白质内 含 子 和 的构建拓宽了蛋 ,, ,,, 。 白 质 剪 接 在蛋白质研究和蛋白质工程中的应 用可 以 构 建 人 工 断 裂 蛋 白 质 内 含 子 ,,, 、把 荧 光 基 团 多 聚 物 等 化 学 修饰分子直接通过合成到化 归巢核酸内切酶结构域 的 作 用 是 使蛋白质内含子基 ，学 合 成 多 肽 上 通 过 反 式 剪 接把带有蛋白修饰分子的多 ，，因可以在基因组中自由 转 移 与蛋白质剪接功能无关 而 。 肽 连 接 到 重 组 蛋 白 上 新型断裂蛋白质内含子的构建 且科学家们还发现有些蛋 白 质 内 含子去除核酸内切酶结 ，，成 功 使断裂位点不再 局 限 于 位 点 为人们设计断裂 ,，，,,,,:,,,: ，构域 后 也 有 剪 接 活 性蛋白质内含子的晶体结构解 。 蛋 白 质 内 含子拓宽了思路 由于化学法合成多肽对氨 ，析也证明了核酸内切 酶 是独立的结构域不参与蛋白质剪 ，基 酸 数 目 有 限 制 所以蛋白质内含子 和 的 氨 基 酸 ,,,,,,: , 。接所以科学 家们通过基因工程的方法去除 标 准 蛋 白 ，数 目 越 少 那 么 与 或 一同合成的目的蛋白的氨基 ,,: , ，质内含子的归巢核酸 内 切 酶 结 构 域并以此为断裂位点将 ，酸 数 目 就 越 多 寻 找 更 小 的 或 仍然是蛋白质内含 ,,: , ，微小蛋白质内含 子 断 裂使 和 在不同的阅读框中表 ,,: , 。子研究的一个方向 ,，,,:,,,,)，。达构建了一系列人工断裂蛋白质内含子 。，图 断裂蛋白质内含子序列中的断裂位置 长的微小蛋白质内含子 每 隔个,,,,,, ,,,,,,,: , ,，,，位 置 空 一 格 排 列 选 出 的 用 箭 头 在 上 方 标 示 个 断 裂 位 点 是归巢核酸内切酶结构域 ,, ,,, ,,,:),,,,，。 ,,。 的 位 置 是典型的断裂位点 下 划 线 的 是 折 叠 ,,,))βββ ,,，，肽键相连为蛋白质合成和修饰提供了新的途径,,,,,, ,, 。因而在蛋白质工程及其他领域具有广泛的应用前景在蛋 蛋白质剪接的应用 , ，白质反式剪接中断裂 蛋 白质内含子的两个片段可以分别 ，，蛋白质剪接的独特性能是它能将两个多肽以一个天然 表达或合成每个片段自身不能发生剪接反应只有两个片 。，。白 只 含 有 一 个 把 要 标 记 的 化 学 分 子 标 或 段相互识别重新构建活性中心才能发生反式剪接蛋 白 ,, ,,,,记 、质剪接可以应用涉及 到 蛋白质化学修饰蛋白片段标记同 ，到 或 上 再通过蛋白质反式剪接将目 的 蛋 白 的 ,,,,,,、、、。位素蛋白质环化蛋白芯片基因治疗等领域 ,,,,,,), ,。两 个 片 段 连 接 在 一 起图 由 于 型 断 裂 蛋 白 ,,, ，质 内 含 子 的 端 仅 含 有 个 氨 基 酸 型 断 裂 蛋 蛋白 质剪接 在 蛋 白质化学修饰中的应用 ,,, : ,, ,,, 白 ，在蛋白质工程和蛋白 质 研 究 中 蛋白质的化学修饰 ，，质 内 含 子 的 端 仅 含 有 个 氨 基 酸 易 于 化 学 合 成 , , 。 技 术 是 非 常 重 要 的 对蛋白质进行化学修饰的分子可 使 。 重 组 蛋 白 质 的 末 端 或 末 端 标 记 更 加 方 便 可 :,))、、、、以 是 荧 光 基 团 多 聚 物 非 天 然 氨 基 酸 酶 的 辅 基 蛋 白 以 将 。 质 翻 译 后 修 饰 的 基 团 等 化学修饰过的蛋白质会拥有 要 标 记 的 分 子和目的蛋白的片段直接通过化学合成的 ,，一 些 新 的 性 质 用生物物理探针修饰蛋白质 可 以 研 究 ，方 法 合 成 到 或 上 通过反式剪接将合成的片段和重 ,,蛋 白 质 剪 接 在 中 的 应 用 : , ,,, :,, ,，蛋 白质的结构和功能 用多聚物修饰蛋白质药物 可 以 。 组表达的片段拼接到一起 ,，,核 磁 共 振 技 :,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,:,,,,,，。增加蛋白药物的稳定性 提高蛋白药物的利用度等 , 术 是 继 射线晶体衍射技术后研究蛋白 结 构 的 又 一 ，,,, 氨基修饰或巯基修饰 是常见的化学修饰方法 但 是 ，、重 大 进 步 这项技术在生命科学 生物医学和材料学中 。 ,标准的化学标记方法做不到特异位点标记 氨 基 端 : 。将 是 至 关 重 要 的 技术除了可以研究蛋白的 ,，氨 基 和 位 氨 基 在蛋白质中的频率较高 如 果 一 :,, ,, ,,ε, ，结 构 以 外 还可以对蛋白 的 构象变化以及蛋白间的相互 ，个蛋白质中的多个氨基 被 标 记 就会出现蛋白沉淀和荧 。 ，。 作 用 进 行 研 究 但 是 技术受限于被检测蛋白的 光 猝 灭 虽 然在蛋白质中低频率出现的 使 饱 和 修 :,, ,,, ，，，分 子 量 原因是分子量增大会造成谱峰重叠 横 向 弛 豫 饰 成 为 可 能 但 是 如 果 在 一种蛋白中出现多次或者 ,,, ,,。 时 间 减 少 线 宽 增 加 传 统 的 技术很难用于研究 ，。位于蛋白的活性中心 就不能做到位点特异性标记 :,, ,, , 。溶液和活细胞中 以 上 的 蛋 白 质 ,:,,, ， 有些新的化学方法可 以进行特异位点标记 但 是 这 对蛋白质进行片段化同位素标记使 技 术 得 到 :,, ，些 方 法 仅 限 于 端 氨 基 的 标 记 而 且 还 要 求 蛋 白 的 : ，。 进 一 步 的 改 善 可 以 检 测更大的蛋白质分子 蛋 白 质 片 : ，,,、端是暴露在外面的 也就是说能否被标记 还 要 依 赖 端 段化标记的方法有天然 化 学 连 接 表 达 蛋 白 连 接: :,, ,,,:,,)。 氨 基 酸 残 基 的 特 点有 些方法已经可以标记重组 ,,,,。 和 反 式 剪 接 等 几 种 方 法 天 然 化 学 连 接,,,,,, ,,,,，，和表达蛋白连接 反应中包含两个蛋白 这 ，蛋 白 但是这些方法存在不足之处 其中有一种方法是 :,,,,, ，两个蛋白分别含有 和 ，用一种配体与多肽标签 共 价 相 连 通过配体与重组蛋白 ,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,, ))),,,,,。 与 发生反应将两个蛋白片段连接在一起 ，，的 非共价结合达到标记的目的 这种方法很简便 但 是 ,,,,,,,), ,,，体 内 反式剪接简化了标记 步 骤 成 功 的 对，,,,,,: 非共价键标记不稳定 而 且 多肽标签对目的蛋白的结构 ,,,,,:,,,:,,))。 , ,。和 功 能 有 影 响蛋 白 质 反式剪接为蛋白质特异位 多 结构域蛋白进行片段同位素标记 图 在 这 种 : 。 ，，点 修饰提供了另一种 方 法 选择特定的位点 将 目 的 蛋 方 法 中 两个前体蛋白在 同 一细胞内两个不同的质粒中 ，。 白 断 裂 成 两 段 分 别 与 和 融 合 表 达 目 的 蛋 白 断 ,,: , ，裂位点的选择根据蛋白 的 不 同 而 不 同 其中一段目的蛋 ,,,,。 图 图 利用蛋白质反式剪接对蛋白质进行特异位点修饰第 利 用 蛋 白 质 反式剪接对蛋白质进行 片段化标记同位 :,,, ,:。，,，,，的质粒首先在普通培养基中 被 诱素 含 有 与 一步将目的蛋白断裂分别 与和,, ,,,,, ,:,,,,:,,,,,,,,,,:,, : , ,, ，。，导 表 达 。更 换 含有同位素的培 养 基 后 ，诱导表达目的蛋 融合表达与融合表达的片段只含有一个 第 二 步将 标 ,,,,,, , ,，,。。，白 与 在体内发生反 式 剪 记物选择性的标 记到半胱氨酸上第 三 步两段蛋白发生反式 ,,,,:,,,,:,,,,,,,,,,:,: , ，。接 。经 过 纯 化 ，得到有片段被标记的蛋白 。剪接形成带有标记物的蛋白 ,, ，。 ，，表 达 两个质粒的诱导 方 式 不 一 样 第一个质粒在含有 载 体 中 将两个载体共转到宿主细胞中 蛋 白 在 宿 主 细 ，，，同位素的培养基中进行 诱 导 然后把培养基换成不含同 胞 中 表 达 通过蛋白质反式剪接形成成熟的蛋 白行 使 。，。 基因治疗的功能 位 素 的 培 养 基 紧 接 着 诱导另一的前体蛋白 细 胞 内 出 ，。 现 两 种 前 体 之 后 会 自 发 剪 接 反 应 经过破碎细胞和纯 ，。化 得到片段标记的 蛋 白 质 研 究 组 利 用 这 ,,,,:,,,, 种 方 法 分 别 检 测 了 结 构 域 和 酵 母 中 ,,, ,:,:,:,, ,,,:,,)。蛋 白 的 结 构,,,,,, ,, 蛋白 质剪接 在 蛋 白质环化中的应用 ,,, 蛋白质环化是 指 将线性蛋白质的 端 和 端 连 接 : , ，形成环形蛋白质骨架 是 设 计新酶和新药以及研究蛋白 。 质 结 构 与 功 能 的 新 方 法 蛋白质环化之后限制了蛋白 ，，质 的 构 象 变 化 降 低 了 熵 值 环化后的蛋白质有更高的 ,,,,。生物活性和更长的药物半衰期 ，,通 常 利 用 化 学方法环化蛋 白 质 这 些 方 法 包 括 在 ,,,,、端 和 端氨基酸残基间形成 二 硫 键 肽键或是通过连 : , 图 蛋白质反式剪接在基因治疗中的应用 , 。 ，接内部氨基酸的侧链 但 是 这些化学方法一般只用于 ,,,:蛋白质剪接在其他 方 面的 应 用 ,,, ，。较 小 的 蛋 白 质 不易应用于较大的蛋白质环化 蛋 白 质 反 式剪接还可以应用到蛋白质 研 究 的 其他 和 实 验 室 利 用 蛋 白 质 反式 ,,,,,,,,,,,,, ,, ), 。 ,,，领 域 利 用 反 式剪接获得对宿主细胞有毒性的蛋白的 剪 接技术分别对麦芽糖结合蛋白 酰 基 载 体 蛋 ,,,,,,, ,,，,,,,全 长 序 列 例 如 和 核 酸 内 切 酶白 和绿色荧光蛋白 等蛋白进行了成功 ,,,,, ,,,,:,, ,,,,,:,,, )),,,,,,,),,,。 ,，的 环 化 图 在 这 种 方 法 中 ,,,, 和 , 分 别 与 目 的 : , , ,,，可以利用蛋白 质 反式剪接重构球蛋白的活性 ,,,,,:，蛋 白 质 的 末 端 和 末 端 融 合 表 达 经过蛋白质反式剪 ,, : 可 以 基 于 这个方法检测蛋白质 蛋白质相互作用利 ) ，，接 之 后 目 的 蛋 白 的 末 端 与 末端以肽键相连 形 成 ，用: , 反式剪接重新构建 蛋 白 活 性 确 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,),,,,。环 形 蛋 白 质 ,保转基因植物的环境安全性 利 用 蛋 白 质 反 式 剪 接 把 ,,,,，。目的蛋白固定到芯片上 应用于蛋白质组学研究 ,,,,。图 利 用 蛋 白 质反式剪接技术环化蛋白质 小 结 与 展 望和 分 , , ,: , , ,，,别 与 目 的 蛋 白的 末 端 和 末 端 融, : ,:,,,,:,,,,,,,,,,:,,蛋 白 质 剪 接技术为蛋白质研究和蛋白 质 工 程 提供 合 表 达 。经 过 蛋 白 质 反 式 剪 接 之 后 ，目 的 蛋 白 的 末 端 与 : ,，、了 新 工 具 在蛋白质特异位点标记 蛋白质片段化同位 ，。末端以肽键相连 形成环形蛋白质 、素 标 记 蛋白质环化和基因治疗等方面取得了一些 成 。 ，果 另 外 蛋 白 质 剪接技术可以应用在毒性蛋白的表 蛋白 质剪接 在 基 因治疗中的应用 ,,, 、、。 达 蛋 白 质 相 互 作 用 蛋白固定等方面 新 型 断 裂 蛋白 ，在基因治疗研究中 由 于有些基因治疗载体对外源 质 内 含 子 在 此基础上扩大了断裂蛋白质内含子的应用 ，基因的大小有限制 导 致 分 子量大的外源基因不能应用 ，范 围 提供了在目的蛋白质的 末 端 或 末 端 标 记 任 :,))。到 基 因 治 疗 中 实 验 室利用蛋白质反式剪接成 ,,,,,,, 。 ，意化学基团的潜力 随 着 蛋白质剪接技术的日趋完善 ，功的解决了这个问题 为 基 因治疗中蛋白表达提供了新 。蛋白质剪接还会应用在蛋白质研究的其他领 域 ,,,,,。 ,，的 方 法 图 在 实 验 中 选择分子量比较大的肌营 ,，。 ，然 而 蛋 白 质 剪 接技术还存在一些限制 例 如 蛋 , ,养 不 良 蛋 白 基 因 和 腺 病 毒 载 体,,,,:,,, ,,,,,,，白质内含子剪接活性受 外 显 子 的 影 响 所以会在目的蛋 ,,。,的肌营养不良蛋白基因 ,,,,,,,, ,,,,:,,, ,,， 白的断裂位点插入一些 外 源 氨 基 酸 这些氨基酸可能会 ,,。,不能被腺病毒载体 带 入 宿 主 细 胞 肌 营 养 ,,,,,,,。 对 目 的 蛋 白的结构与功能产生影响 所以在设计目的 ，不 良 蛋 白 基 因 被 断 裂 成 两 段 并分别与断裂内含 ,,:, 。 ，蛋 白的断裂位点时要 充分考虑到这一点 另 外 有 些 人 ， 子 的 和 的 基 因 融 合 表 达 将两段基因克隆到两个 ,,: , ， 工构建的蛋白质内含子 与 有些蛋白融合表达时 会 得 到 ,,,,,:,:,,:,,,, ,,,,,,,,,:,,,,:,,:,,,,,,,,,:, ，, ,,,很少的可溶性蛋白 要 经 过 变复性才能使蛋白质内含子 ,,,,，，,,,,,,:, )) ,,,,,,,,,,,,。 ，有 活 性 尽管有这些限制 蛋白质剪接技术还是应用到 ,,，,,,,, , ,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,:,,, ,,,,,。了蛋白质研究与蛋白质工程的很多领 域 ,,，,,,,,,,, ,,,,,:,,,,,,, ,,,,,,,,, :,: ,,:, ,,,,, ，,,, ,::,,:,,,,,,,,,,,,,,,,)年 月 日 收 到 ,:,,, ,: ,,，，，,,:,,,,,:,,,,,,,,,,,:,,, :,,,,,,,,,,,,,,,:,:, ,，，,,,,，，,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,:,,,,,:,,,, ,,,, , ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,:,,:,,,,,:,,:,,::,) ,,,,,,,,,，，,,,, ,,,,,:,,,,:, :,,:,,,,,,,,,,,,,,:::,,,,,:,,,,,,,::,)),,，，,,， ,,,,,:,,,,,,,,, ,:,,:,,,,,,,,, ,,,:,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，，,,, ,:,,,,, ,,,,::,,,,,,,,,,)),,,,,,,,:,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,:,, ,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,)),,,,，，,,,,,，，,,, ,,,,::,,:,,,,),,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,::,,,:),,,,,,,,，，，,,，，，,,,,,,,,:,,,,,,,,:: ,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, , ,,:,,,, : ,,:,:, , ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,:,,,,:,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,, ,,,,,:,,),,,:,:,,,,,,,:,,,,,:,:,:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,, ,, ,,，，,,，，,,, ,,,,, 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