植物细胞融合实验
植物细胞融合
一、细胞融合(cell fusion)概念
在外力(诱导剂或促融合剂)作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。
通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。
二、细胞融合的目的和意义
细胞融合能实现远缘杂交。其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基因型，扩大了遗传物质的重组范围。
三、PEG诱导原生质体融合的机理:
带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生
2+2+2+质体最终融合。使用化学促融剂时，Ca是必需的。关于Ca的作用机理，有的认为是Ca
2+3-和PO形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca结合到4
带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。
四、实验材料、试剂和仪器
1、材料:菜薹、胡萝卜、韭菜、红花酢浆草、红辣椒、洋葱。
2、试剂:13%CPW洗液、酶液(1.0,的纤维素酶和0.8,的果胶酶，用13,的CPW配制)、20%蔗糖溶液、40%PEG液。
3、器材:显微镜(三台)、离心机(一台)、大小培养皿(六小，两大)、小烧杯(若干)、小滴管(六个)、刻度离心管(六个)、小漏斗(六个)、不锈钢网300目(六个)、培养箱。
五.实验步骤
1、酶解:将
表
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面灭菌的叶片撕去下表皮，放入盛有5毫升酶液的培养皿中，让去除下表皮的
一面接触酶液，铺满一层，放入25?培养箱酶解3- 4小时。
2、用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。
3、在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液，加入3,4ml13%CPW洗液，相同条件下离心 ，
弃上清液。加1ml13%CPW洗液悬浮。
4、蔗糖漂浮方法:
(1)用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心
加在蔗糖界面上。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有
明显界面)。
(2)1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活
细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处。
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3,4ml
13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW的CPW重新悬浮。
5、细胞融合:
(1)加原生质体0.3ml与带盖离心管中，另加入0.15ml 40% PEG液，30?水浴中温浴15min; (2)融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。 (3)用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察2-3个细胞靠近或融合的过程。( 观察时注意不
同程度的融合现象。通常分为五个阶段。?两细胞膜接触，粘连;?细胞膜形成穿孔;?
两细胞的细胞质连通;?通道扩大，两细胞连成一体;?细胞完全合并，形成一个含有两
个或多个核的圆形细胞。)
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