使用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌

使用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌 使用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌 ?30?公共卫生与临床医学 20l06tPublicHealthandClinicalMedicineVolume6,Number1,Feb2010 使用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌 王宏萍,张继伦,吴文娟,姜婷,鲍依稀,周晓明 摘要:目的测试应用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌的适用性.方法用16SrDNA基因的扩 增引物,对从腹泻者,水产品和环境中分离获得的副溶血性弧菌(n=39)及临床分离的15种(n=181) 常见菌的基因组DNA进行聚合酶链反应,产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后直接测序序列通过blastn, 在GenBank中比对,确定细菌属种并与表型法结果进行比较.结果220株菌(220/220)扩增出870bp 的目的片段,平均测序长度752bp.36/39株副溶血性弧菌鉴定结果与生化培养法相符,3株菌株分别 鉴定为科氏葡萄球菌(Staph3lococcuscohnii),表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和 Oceanobacillusprofundus.181株其它临床分离菌无误判为副溶血性弧菌,其中123株与生化培养法结 果一致,58株有差异结论本文 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 的16SrDNA基因序列分析可用于准确鉴定副溶血性弧菌,并 可与15种临床常见分离菌区分. 关键词:16SrDNA分析;副溶血性弧菌,;临床菌株 中图分类号:R378.3文献标识码:A IdentificationofVibrioparahaemolyticusfromOtherClinicalIsolatedBacteriabyPartial 16SrDNASequencingWANGHong-ping,ZHANGJi—H,z.,wWenjuan,JIANGTing,BAO M—xi3,ZHOUXiao— minrDepartmentofepidemiology,Shanghaipublichealthclinicalcenteraffiliatedto FudanUniversity,Shanghai201508;2ShanghaiEntry— ExitInspectionAndQuarantineBureau,Shanghai 200335;3Departmentofimmunology,ChongqingmedicalUniversity,Chongqing40001~China) Abstract:ObjectiveToevaluatethefeasibilitytoemploy16SrDNAsequencingasatestforVibrio parahaemolyticusidentification.MethodsVibrioparahaemolyticusstrains(n=39)wereindividuallyisolated fromdiarrheapatients,fisheryproductsandenvironmentwatersamplesrespectively.Otherfifteenspeciesof clinicalbacteriaisolates(n=181)wereincludedascontrols.BacteriagenomeDNAswereamplifiedbyPCR withprimersdesignedforpartial16SrDNA.Then,amplifiedproductswerepurifiedfromagarose—gel electrophoresis,directlySequencedbyBigDye3.0kit.SequenceswerecomparedwithdatabaseinGenBank usingprogramblastnfortheidentificationofthebacterialspecies.Resultswerefurthercomparedwiththose identifiedbyroutinebiochemistrytests.ResultsAllof220bacteriaisolatesweresuccessfullyamplifiedby PCRwitha870bptargetfragment.The16SrDNAtestcanidentifythirty— sixoutof39Vibrioparahaemoly— ticusisolates(92-30%),inaccordancewiththeresultsdeterminedbyroutinebiochemistrytest.Noneof181 otherclinicalbacterialisolateswasclassifiedasVibrioparahaemolyticusby16SrDNAtest,although41of themwerenotconsistantwiththeresultsfrombiochemistrytest.ConclusionsThesedatasuggestedthat16S rDNAtestcanpreciselyidentifyVibrioparahaemolyticusfrommostofcommonclinicalisol ates. Keywords:Diagnosis;16SrDNAtest;Vibrioparahaemolyticus;Identification 收稿日期:2009-08.06;修回日期:2009—09.16 基金项目:上海市科委技术 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 专项资助(06DZ05029);上海申康医院发展管理中心科研共享平台资助 作者单位:1上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心流行病学部,上海201508;2上海市出入境检验检疫局,上海 200335;3重庆医科大学免疫学教研室,重庆400016 通讯作者:周晓明(1969.),男(汉族),江苏省苏州市人;南京大学生物化学系本科,学士学位;中科院上海细胞生物学 研究所获硕士学位;香港大学医学院获博士学位;副研究员,讲师,先后主持复旦大学青年基金课题1项,上海市科委课 题3项,国家自然科学基金和国家"863"重大课题各l项;获上海市科技进步一等,二等奖各1项.主要研究方向:分子流 行病学. 冰论着冰 公共卫生与幅床医学20106卷1划PublicHealthandClinicalMedicineVolume6.Number1.Feb2010?31? 副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)广泛 存在于近海岸海水和贝壳类,鱼虾类等海产品中, 是引起日本,美国,台湾等沿海地区细菌性食物中 毒的首要原因.上海的细菌性食物中毒事件中副溶 血性弧菌的分离率为63.7%_J'引.因此,准确鉴定水 产品中的副溶血性弧菌是食品卫生现场监督,维持 食品安全,保障社会消费水产品安全的重要工作. 核糖体RNA(rRNA)是细菌分型鉴定可用的 标志物之一,常使用16SrDNA的基因序列的差异 进行分型.该基因序列全长约1.5kp,由可变区和保 守区交替组成,包含一定的种问多态性.为建立副 溶血性弧菌检测的技术标准,我们测试使用16S rDNA分型对副溶血性弧菌进行鉴定,并测定其与 临床分离的常见其它菌株的区分度. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1菌株来源副溶血性弧菌:2006年11月到 2007年9月之问分别从上海市金山区和浦东新区的 腹泻患者,水产品和水样标本中分离得到,由上海 市出入境检验检疫局提供;临床分离菌株:2006年 l0月到2008年3月之间由上海市公共卫生临床中 心检验科分离的临床常见菌株,经生化培养法鉴定 为15种181株. 1.2生化培养鉴定法菌株经平板划线,37?培养 18-24h,革兰氏染色,观察细菌菌落形态以及显微 镜镜检下细菌形态;使用ATBTM鉴定条或VitekGNl, GPI鉴定卡(ATBExpression药敏分析系统和 VITEK32d~型全自动微生物鉴定系统,法国生物梅 里埃公司)确定菌种的生化培养型. 1.3细菌基因组DNA提取从血平板挑取适量菌 落混于200gLTE溶液(10mMTris'Cl,1mMEDTA, pH8.0),使用UNIQ.10柱式细菌基因组DN时由提试剂 盒(上海生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术服务有限公司)依照操作 说明提取细菌基因组DNA.简述为依次)JH/~.400pL 裂解液~D3gL蛋白酶K溶液,裂解细菌释放基因组 DNA,离心取上清加入UNIQ一10吸附柱,使用洗涤 液去除杂质,用ddH2O洗脱,获得30,50pL细菌基因 组DNA,浓度约为0.02—0.05gg/pL. 1.416SrDNA序列扩增使用16SrDNA的弓1物, 正向序歹0为:5'一cCAGcAGCCGCGGTAATACG一3' 表1J6SrDNA比对鉴定结果与生化培养法鉴定有显着差异的菌株 Table1Thestrainwithdifferentassessmentresultsbytwodifferentmethods 生化培养法鉴定结果数量16SrDNA鉴定结果比对相似度 覆盖度(%)(%) 大肠埃希菌 Escherichcoli 肺炎克雷伯菌 KlebsieUapneumoniae 铜绿假单胞菌 Pseudomonsaaeruginosa 嗜麦芽窄食单胞菌 Stenotrophomonasmaltophilia 金黄色葡萄球菌 Staph2,lococcusaureus 溶血性葡萄球菌 Staphylococcushaemolyticus 人葡萄球菌 Staphylococcushorninis 表皮葡萄球菌 StaphyloCOCCUSepidermidis 木糖葡萄球菌 Staphylococcusxylosus 星座链球菌 Streptococcusconstellatus 粪肠球菌 Enterococcusfaecalis 屎肠球菌Enterococcusfaecium 计 弗氏志贺菌肋igellaflexneri 志贺菌属Shigellasp. 普通变形杆菌Proteusvulgaris 赫氏埃希菌Escherichhermannii 产酸克雷伯菌Klebsiellaoxytoca KlPbiellavariicolla 产气肠杆菌Enterobacteraerogenes 阴沟肠杆菌把,口6nc把rcloacae 大肠埃希菌Escherichiacoli 膝状假单胞菌Pseudomonasgeniculata 膝状假单胞菌Pseudomonasgeniculata 不动杆菌属Acinetobactersp. 纹带棒状杆菌Corynebacteriumstriamm 里昂葡萄球菌Staphylococcuslugdunensis 马胃葡萄球菌Staphylococcusequorum 志贺菌属某个种鼬igellasp Lysinibacillussphaericus 金黄色葡萄球菌Staphy[ococcusaureus 溶血性葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus Lysinibacillussphaericus 粪肠球菌Enterococcus向ecalis Lysinibacillussphaericus 大肠埃希菌Escherichiacoli 中间链球菌Streptococcusintermedius 希氏肠球菌Enterococcushirae En~rocDccusdevriesei 唾液链球菌Streptococcussalivarius 鹑鸡肠球菌EnterococcusgaUinarum 屎肠球菌Enteroeoccusfaecium 粪肠球菌Enterococcusfaecalis 1oo 100 loo l0o 1oo 1O0 100 100 1o0 lo0 100 100 ???????????????鲫? ??????????????? 1,,,,,,}!l,,,1l11,,! l1ll121 公共卫生与临床医学2010年第6卷第1期 PublicHealthandClinicalMedicineVolume6.Number1.Feb2010.33. (参考序YlJGenBankaccessionnumber:X56580,位 置在528,547bp处)[31,反向序列为:5'-AGGCC CGGGAACGTATTCAC一3'(位置在1397,1378bp 处)l4J.聚合酶链反应(PCR)条件为50gL反应体 系,4细菌基因组DNA做 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,510x缓冲液(含 MgC12),4gL2.5mMdNTP,0.25儿5U/~LrTaq酶 (TaKaRaTaq,宝生物工程有限公司,大连), 20gM正反向引物各lbtL,ddH2O补足体系.扩增条 件为起始94~C变I~4min,接着反应30个循环(94~C 30s,58.C30s,72.Clmin),终末72?延~7min. 以ddH2O做空白对照.产物取5作琼脂糖凝胶电泳 (0.8%,5V/cm,40min). 1.5扩增产物测序PCR产物由上海生工生物工 程技术服务有限公司测序(测序试剂为BigDye~ Terminatorv3.1CycleSequencingKit),测序引物使 用正向扩增引物.测序结果用ChromasPro校正后, 在NCBI网站(WWW.ncbi.nlm.nih.gov)进行blastn比 对查询. 1.6判断标准Blastn中待测的细菌序列与参考序 列的相似性?99%的比对结果确定为相应属种. 2结果 16SrDNA保守区基因扩增,220株菌(220/220) 扩增出870bp的目的片段,空白对照为阴性.电泳 位置正确(图1). 16SrDNA测序比对结果,220株菌平均测序长 度为752bp(438,818bp).92.30%(36/39)株副溶 血性弧菌鉴定结果与生化培养法一致,不符合的3 株副溶血性弧菌分别鉴定为科氏葡萄球菌 (Staphylococcuscohnii),表皮葡萄球菌 (Staphyrlococcusepidermidis)和Oceanobacillus profundus.123株(67.96%)临床分离菌与生化培 养法鉴定结果一致,其中3株奇异变形杆菌,7株 图116SrDNA扩增片段 Fig.1Amplificationfragmentof16SrDNA 1:分子量标记D2000;2:空白对照{3—7:16SrDNA目的片段 鲍氏不动杆菌的鉴定结果均符合临床生化培养法; 41株(22.65%)与生化表型鉴定结果有差异(表1); 17株(9.39%)的最佳匹配菌属及次匹配菌属不能 相互区分于生化表型法. 3讨论 环境中约5%的副溶血性弧菌是致病的,95%是 不致病的.大肠埃希菌,志贺氏菌,普通变形杆菌, 葡萄球菌等也是食源性疾病相关的细菌,其腹泻患 者的炎症反应与副溶血性弧菌感染菌者相似.因此, 判断海产品的食用合格性需要准确鉴定5%的致病 菌并与上述混杂菌群相区分. 由于细菌生长条件的差异,株系之间的生化代 谢型差异较大,会产生不小于属种之问的距离.此 外,生化培养法鉴定细菌需时较长(3,7d).因此 用于细菌的最终鉴定效度会低于16SrDNA序列分 析方法. 我们对41株副溶血性弧菌及181株临床分离的 非副溶血性菌株比较了16SrDNA序列测定分型与 生化培养法的鉴定结果.实验数据显示92.30% (36/39)的副溶血性弧菌鉴定在两种方法中一致, 不相符的3株来源腹泻患者分离菌株,分别鉴定为 科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii),表皮葡萄球 菌(Staph)'lococcusepidermidis)和Oceanobacillus profundus.181/181株经生化代谢培养方法鉴定的 临床分离菌株在16SrDNA分型中无误判为副溶血 性弧菌的例证(图2). 181株临床分离菌株中,32%(58株)的16S rDNA鉴定结果与生化培养法有差异.具体差异类型 为4株(4/30)大肠埃希菌经16SrDNA基因鉴定为 志贺属菌(3例志贺菌属某种,1例弗氏志贺菌);2 株(2/30)鉴定为普通变形杆菌.大肠埃希菌与志 贺菌属的DNA相关性为80%90%_7J,但肠侵袭性大 肠埃希菌(EIEC)与志贺菌的生化性状几乎相同' ,因此只能通过16SrDNA基因区分. 5株(5/23)肺炎克雷伯菌经16SrDNA鉴定分 别为产气肠杆菌,阴沟肠杆菌,产酸克雷伯菌(2 株),Klebsiellavariicola.克雷伯菌与产气肠杆菌的 DNA同源性为50%,59%J,16SrDNA基因 (1290bp)相似性为97.5%,99.0%[】.'?].产气肠杆 菌会出现动力和鸟氨酸脱羧酶阳性延迟反应 (2,5d),因此标准的生化鉴定(24h)会将其误鉴 定为肺炎克雷伯菌【l?. 16SrDNA基因不能区分金黄色葡萄球菌与溶 血性葡萄球菌,粪肠球菌与屎肠球菌及铜绿假单胞 .34.公共卫生与临床医学20106卷1驯 PublicHealthandClinicalMedicineVolume6,Number1,Feb2010 (上接第14页) [25]VeazeyRS,DeMariaM,ChalifouxLV,eta1.Gastrointestinaltractas amajorsiteofCD4TcelldepletionandviralreplicationinSIV infection【J】.Science,1998,280(5362):427—431. 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