奶牛瘤胃中非离子型表面活性剂对发酵特性、微生物生长、酶活性以及消化能力的影响..

北京化工大学 环境 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 作业 专业英语 姓名：      袁玲莉        班级：      化研1316    学号：      2013210100    指导老师：    刘研萍      奶牛瘤胃中非离子型 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面活性剂对发酵特性、微生物生长、酶活性以及消化能力的影响 S.S.Leea,*, H.S.Kimb, Y.H.Moonc, N.J.Choid, J.K.Had 摘要： 通过对韩国本地奶牛瘤胃的消化研究表明，非离子型表面活性剂（NIS）具有影响瘤胃发酵特征、微生物生长、酶活性以及消化能力的作用。 在奶牛瘤胃中添加NIS溶液使得胃中的蛋白酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶（CMCase）和木聚糖酶的活性大大增强（P<0.01），并且加强了稻草原位消化速率，胃中的挥发性脂肪酸（VFA）和氨氮（NH3-N）得到了积累，瘤胃中的厌氧微生物数量也大大增加。 实验用尼龙袋内置于奶牛瘤胃中，每天向胃中注入200ml的NIS溶液，并且分别设置3组控制对照，分别注入NIS溶液36天，48天和72天，研究结果表明，稻草的消解量明显增加（P<0.01），和空白对照，分别增加了31.4%，30.0%和14.8%。添加NIS控制的实验组和空白组对照发现（P<0.01），总细菌数增加了4倍（从 胃中液体）。 研究结果表明，NIS的添加能够在不减少细胞生长的情况下，大大促进特定酶的释放，并且具有产生好氧菌的趋势。研究还表明，NIS可能还是一种能激发多种酶活性和促进微生物生长的一种特殊添加物。 1. 介绍 为了提高饲料中营养物质的利用率，和反刍动物产率，有大量的研究关于对瘤胃内环境的操作处理。这些研究得出，有大范围的饲料添加物具有影响瘤胃新陈代谢成分的能力。在过去十年里，对瘤胃内环境处理的研究涉及以下方面：甲烷抑制剂；蛋白质水解、抗生素和脱氨基抑制剂；除虫药剂；微生物酶；脂肪酸和脂质饲料；缓冲药剂和人造唾液；通过离子载体提高丙酸盐类；益生素和非细菌性直接饲喂的微生物（DFM），包括酵母菌培养物和霉菌发酵提取物。人们已知非离子型表面活性剂（NIS）具有高效刺激多种需氧微生物释放酶的能力(Deshpande et al., 1987; Hung et al., 1988; Yazdi et al., 1990; Long and Knapp, 1991)。这次试验提供了利用NIS作为饲料添加剂的可能性，因此可以减少抗生素和离子载体的使用。在之前的试验中，我们得出了这种特殊的饲料添加剂具有促进瘤胃内微生物群落的生长，并可提高多糖水解酶的活性的结论。在1L厌氧微生物生长介质中，NIS的浓度为0.5g，这种物质增加了瘤胃内细菌和真菌的增长速率，也增加了谷物和稻草的消化率以及多糖水解酶的活性（未公开资料）。接下来，将说明NIS作为反刍动物饲料添加剂的潜在可能性。 2. 材料和方法 2.1 动物以及实验设计 12只平均体重在450±37kg的韩国本地奶牛（Hanwoo），分别在瘤胃部设有可外取式的装置，用来评价NIS在瘤胃中添加对消化特征、微生物生长率和酶活性的影响。12只牛被随机地分配成两组，每组6只，分别作为控制组和NIS处理组。 控制对照组的动物用瘤胃上的套管加入100ml蒸馏水。NIS处理组的动物则用同样的方法每天注入200mlNIS溶液。试验时间持续10天，其中5天进行原位实验，5天对瘤胃中的液体进行收集，在实验时间开始之前，所有动物用各自的处理方法处理15天。 2.2 进食规律及饲料 每个动物每天喂食2次（0900和1700），将饲料和稻草以6:4的配比（按照饲喂的营养基础；表1），每天按照20g饲料/kg体重进行饲喂，这些动物被饲养在一边开放式的混凝土牛棚里。提供给它们一个矿物质含量丰富的盐块和添加了镥元素的水。 分别用AOAC（1990）中描述的官方方法930.01、976.05、920.39和927.02来测量饲料中的含水量、粗蛋白含量、醚提取物含量和粗灰分含量。中性和酸性的去污纤维（NDF和ADF）的含量用Van Soest等人（1991）的方法进行测量，没有使用亚硫酸钠和淀粉酶。饲料中的钙和磷元素用原子吸收分光光度计来检测（Shimadzu，AA6145F，日本） 表格1 饲料中的化学组分和含量 项目 混合饲料 稻草 混合组分含量（g/kg，作为饲料的基础成分） 玉米 588   小麦碎渣 50   麦麸 150   木薯 80   棉籽粉 40   菜籽粉 40   甘蔗废糖蜜 40   瘤胃脂肪 9   石灰 12   盐 10   维生素和矿物质混合物 29   总计 100   干物质（g/kg） 880.8   干物质的化学成分（g/kgDM） 粗蛋白 127.2 51.2 醚提取物 32.9 25.0 粗灰分 59.0 171.6 TDNa 816.3 426.3 NDFb 281.6 827.6 ADFc 81.7 575.2 钙 10.2 3.4 磷 3.4 1.1       a 总可消化的营养成分的计算参考韩国饲料含量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 （国家家畜研究机构，1988） b 中性去污纤维 c 酸性去污纤维 2.3 NIS和NIS溶液的准备 NIS的构成，由非离子型表面活性剂SOLFA-850，主要物质是水山梨糖醇三油酸酯{酸度最大14；皂化度，172-186；HLB（亲水-疏水平衡），1.8；外观，暗黄色液体}，由CO.Ltd/公司提供。非离子型表面活性剂溶液由NIS、苹果酸和高度离子化水配制而成（混合比率和准备方法正在申请专利）。 2.4 瘤胃内物质的采样和分析 瘤胃中的物质通过瘤胃上的套管取样，在上午喂食以后的0、3、6、9小时进行原位实验。样品用一分钟的时间混合，然后迅速用没有CO2气体的氧气，通过四层粗孔纱布进行抽滤，并进行pH的测量。过滤后的瘤胃液体被用来分析氨氮、挥发性脂肪酸（VFA），并且确定酶活性和微生物数量。氨氮浓度的测量方法参照Chaney和Marbeck（1962）的方法。VFA浓度根据Erwin等人（1961）用气液色谱法（Packard，439-GLC）进行测量。在瘤胃液体中的微生物细胞增长情况用分光光度计在吸光度650nm下进行分析，之后去除其中的杂质，将细胞用100mM的磷酸钠缓冲剂（pH6.5）洗涤3次。 纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶的活性用DNS（二硝基水杨酸）的方法进行化验。1.5毫升粗酶溶液的上清液和0.5ml/10g的羟甲基化纤维素（CMC）相混合，溶于0.05mol/L的柠檬酸缓冲液中（pH5.5）。反应在55摄氏度下静置进行一个小时，最后5分钟在沸腾状态下反应。煮沸后的样品在7000转下离心5min，上清液中减少糖量，用Miller（1959）的DNS比色法进行检验。一个单位的酶活性被定义为该单体的酶每分钟所减少的糖量所产生和1mmol葡萄糖对等的单糖的量。对于木聚糖酶和淀粉酶的活性研究则通过取20g/ml燕麦分别分解为木聚糖（w/v）和淀粉（w/v）并溶于0.5M/L磷酸钾缓冲液（pH6.5）中。减少的糖量按照上述的方法进行分析。 总水解蛋白酶的活性通过98摄氏度下含氮酪蛋白的水解量进行测量。反应混合溶液包含900μl的底物溶液（1g含氮酪蛋白溶于0.1M/L磷酸钠缓冲液中，pH7.5）和100μl酶样品。混合物在98摄氏度下反应30min，反应结束时，将样本放在冰上并且添加500μlTCA（三氯乙酰酸）溶液（15gTCA溶于100ml蒸馏水中）。之后将样品放置于Eppendorf微型离心机中进行离心（12,000转，3min）以去除沉淀物。用分光光度计在440nm处对上清液进行检测，用蒸馏水进行调零。一个单位的蛋白酶活性被定义为原材料蛋白酶每小时水解1毫克含氮酪蛋白的毫克数。 2.5 瘤胃中物质的微生物总数计数 活性细菌和真菌的总数分别用Holseman等人（1977）和Joblin（1981）的方法用厌氧菌滚动管进行统计。可分解纤维素的细菌也可以用大多数可能的数值（MPN；用10-6到10-9连续稀释）程序统计出来。MPN肉汤培养基用以计数可分解纤维素的细菌，这和Dehority等人（1989）的纤维素培养基包含可溶性碳水化合物（葡萄糖、纤维二塘、木糖各1g溶于100mL缓冲液中）和一条滤纸纤维素（70±100mm）类似。12天培养后，纤维素的数量用纤维条被水解掉的量进行评估。 在对瘤胃中的原生动物进行计数之前，运用Ogimoto和Imai（1981）的方法，将样品固定在MFS（甲基绿-甲醛-盐溶液）溶液中，溶液由900mL蒸馏水、100mL甲醛溶液（35g甲醛溶解在蒸馏水中）、0.6g甲基绿和8.0gNaCl。将固定在甲基绿甲醛盐溶液中的原生动物用同样的溶液进行稀释，并将稀释液滴于一个特殊的原生生物分析镜上，也就是一个有规律间隔细小沟槽的载玻片（Cat.No. 900, Hausser Scientific, Blue Bell, Pa.19422），并将此在显微镜下观察计数。对于用来计数瘤胃中的原生生物，沟槽的最佳间隔为0.5mm（Ogimoto和Imai， 1981） 2.6 DM原位降解率 为了检验在瘤胃中添加蒸馏水（空白组）和NIS溶液（NIS实验组）稻草DM的降解率，我们进行了一个原位实验。DM降解率的测定，通过将5g的稻草置于尼龙袋（25μm每个；80mm×130mm内径）中并悬挂在瘤胃里进行反应。这些袋子进行了清洗，在55摄氏度下干燥48h，并在装样品前和装之后都进行了称量。袋子在温水中浸泡了10min后置于瘤胃中30min在上午的喂食之后。袋子一式三份，分别在消化反应进行了6、12、24、36、48和72h以后取出。袋子取出以后，对其进行清洗，直到清洗液变得干净为止，然后再把它们放在55摄氏度的烘箱内干燥48h，用于测定其中的DM。DM的降解速率由?rskov和McDonald(1979)的指数方程进行计算： 其中，P是稻草DM的比率，t为降解时间，a为部分能快速溶解的DM，b为潜在可降解的DM，c为分数b消失的速率常数。常数a，b和c用NLIN进行估计，即一种反复迭代的最小二乘法（SAS, 1996）。而有效降解性则通过接下来的?rskov和McDonald(1979)的方程式进行计算： p是经过瘤胃消化的估计速率，假定，通过瘤胃的速率0.025h-1作为稻草有效降解性的估计量。 2.7 体外降解性 将稻草磨碎称取250mg，以同样操作得到完全相同的两份。将样品放于50ml的试管中，根据Maeten和Baenes（1980）所描述的试验方法，加入瘤胃液体，分别反应24、48和72h。12（2种处理方法*6个平行试验）个样本的瘤胃液体的来源，分别取自12只经过两种处理方法（添加蒸馏水和添加NIS液体）瘤胃上带有套管的奶牛。反应最后，在发酵管中对稻草DM的含量进行分析。和最初的量进行比较，计算出的最后的DM反应降解量即为DM体外降解性。这可作为空白的校准。 2.8 统计分析 对于差异性分析和方法分析，参考Duncan的多级实验，运用SAS（1996）的一般线性模型程序（GLM）分析。经仔细选择，将P<0.01作为评价各方法明显不同的指标。