实验十六 氨基移换反应的定性鉴定及氨基酸的纸层析
实验十六 氨基移换反应的定性鉴定及氨基酸的纸层析 实验类型:验证型 目的和要求 1(学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。 2(进一步掌握纸层析的原理和操作技术。 3(了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。 原理 氨基移换酶也称转氨酶。它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮基的α-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。转氨酶的种类甚多，任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适PH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸-草酸乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶、GOT)及谷氨酸-丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶、GPT)活力最强。 上述两种酶均广泛存在于生物机体中。在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞等病变时，血清中转氨酶活力常显著增加，在临床上转氨酶活性的测定有重要意义。测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法、纸上层析法及光电比色法等。 本实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸以抑制酵解作用或氧化作用。 氨基酸的纸上层析属于分配层析。以滤纸及其结合水作为固定相，把欲分离的混合氨基酸样品加于滤纸上，使流动相(展开剂)经此移动，样品中各组分就在两相溶剂问发生分配现象，在固定相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就慢;在流动相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度就快。由于各种氨基酸的分配系数不同，就逐渐集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后，可用茚三酮乙醇液喷洒滤纸，使氨基酸显色形成斑点。组分的比移值(Rf)表示如下: ????????RrRf沿距离点样原点中心到溶剂前中心距离点样原点中心到层析点?? 各种氨基酸都有其特征的Rf值，因此可根据Rf值来鉴定被分离的氨基酸。 操作方法 一、酶液的制备 将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5克肝脏，放入匀浆器中，再加入 3毫升磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在2500转,分的条件下，离心5分钟，取上清液，即为制备的酶液。 二、体外氨基移换反应 取2支试管，编号。向1号试营中加入15三氯醋酸溶液10滴和酶液10滴，混匀，静置15分钟，做对照管。向2号试管中加入酶液10滴，然后向1、2号试管各备加入10谷氨酸溶液10滴、1丙酮酸溶液10滴、0.1碳酸氢钾溶液10滴和0.05碘乙酸溶液5滴，混匀，放入37?一40?恒温水浴中保温1.5—2小时。在保温过程中，将试管摇荡几次。保温完毕后取出试管，立即向第2号试管中加入15三氯醋酸溶液10滴以沉淀蛋白质终止酶反应。将2支试管的内容物分别离心，2500转,分，5分钟。将上清液转移到试管中，用塞塞紧，放置于低温处备用。 二、纸上层析法检查 取4根毛细管，再取10cm×15cm层析滤纸1张。分别将对照上清液(1号管)、样品上清液(2号管)，标准谷氨酸溶液和标准丙氨酸溶液点在层析滤纸的基线上。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2—3毫米的圆斑，两点间隔约1.5cm。为了有足够量样品点在滤纸上，每种溶液应重复点3—4次。待自然风干(或用吹风机吹干)，再点下一。点样量应力求均匀相等。 在洁净干燥的小培养皿中，加入约20毫升酚溶剂(展开剂)。将小培养皿放在层析缸底部，加盖密闭，保持10分钟，使缸中展开剂蒸气达到饱和。将滤纸点样端朝下悬挂于层析缸盖中心的挂钩上，放入层析缸，使点样端浸入展开剂中约0.5cm，不要使点样点直接与溶剂接触，加盖密闭，进行层析。待展开剂上升至滤纸上端2cm处时
(约需1小时)，取出滤纸，用铅笔划上溶剂前沿，室温干燥或吹干。用玻璃喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1茚三酮无水乙醇溶液，置60?一80?烤箱中烘烤5分钟，即出现被染成紫红色的氨基酸斑点。
分析
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比较层析图借，确定各点的氨基酸组成，并解释实验结果。 试剂和器材 一、试剂及材料 (1)实验动物—家兔 (2)1/15M磷酸缓冲液(PH7.4) (3)1谷氨酸溶液(用KOH中和至中性) (4)1丙酮酸溶液(用KOH中和至中性) (5)0.1碳酸氢钾溶液 (6)0.05碘乙酸溶液 (7)15三氯醋酸溶液 (8)标准丙氨酸溶液(0.1) 9标淮谷氨酸溶液0.1 100.1水合茚三酮乙醇溶液 11酚试剂:在大烧杯中加蒸馏水40毫升，再加入新蒸馏的无色的苯酚150克。在水浴中加热搅拌，混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有120毫升蒸馏水的500毫升分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静止7-10小时，乳状液变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶液(即酚溶液)，放出下层，贮存在棕色试剂瓶中备用。 二、器材 (1)层析缸 (2)培养皿 (3)解剖刀、剪及镊子 (4)表面化皿 (5)匀浆器 (6)离心机 (7)毛细管 (8)恒温水浴 (9)吹风机 (10)喷雾
11)层析滤纸 (12)针、线 思考题 1、 什么叫氨基移换作用,试说明该作器 (
用的特点及其在中间代谢中的意义。 2、 回顾你所做过的生化实验，你对于了解生物体组织代谢实验的特点有何认识和体会,
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