免疫外科法分离牛卵巢颗粒细胞核

免疫外科法分离牛卵巢颗粒细胞核 免疫外科法分离牛卵巢颗粒细胞核 2009年7月 第40卷第4期 内蒙古大学(自然科学版) JournalofInnerMongoliaUniversity Ju1.2009 Vo1.40NO.4 文章编号:10oO一1638(2009)04—0455—05 免疫外科法分离牛卵巢颗粒细胞核 陈玉龙,杨利军,黄翔华,李云霞,赵宇航,李煜 (内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特010021) 摘要:实验旨在用制备的兔抗牛脾啶细胞免疫血清去除牛颗粒细胞膜,将得到的完整的细胞 核分离纯化以应用于核移植胞质内注射.首先用牛脾脏细胞免疫健康成年兔,注射五周后将兔 子放血,分离得到高效价的免疫血清,分装冷藏;然后,解冻适量血清,与牛颗粒细胞反应,观察 凝聚现象和破膜反应.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,免疫学方法可以批量破除细胞膜,该法为体细胞核移植方法 的改进提供了一条新的思路,值得为相关研究所借鉴. 关键词:免疫外科;抗体制备;细胞核分离 中图分类号:Q813;$823.3文献标识码:A 通过核移植途径制备体细胞克隆动物有两种基本方法,即细胞融合法和细胞核胞质内注射法.胞 质内注射法的一个关键环节是体细胞膜的裂解和细胞核的分离,若供体细胞未完全破膜就会导致注 入的细胞核不能进行发育重编程(reprogramming),进而使得卵裂率和囊胚发育率明显下降.有人尝 试用低渗溶液.或TritonX一100.短时处理裂解细胞膜,能够获取细胞核,但这种操作不易控制,且会 增加化学药品污染机会,因而有必要寻求一种简便可行的供体细胞处理方式. 免疫外科法是裂解细胞膜的有效方法之一,最初用于哺乳动物囊胚内细胞团(IcM)的分离.叫. 该方法能批量分离哺乳动物ICM,有效提高分离哺乳动物ICM的效率,广泛用于嵌合胚构建及干细 胞建系刀. 基于上述研究,本实验以牛的脾脏细胞为抗原,制备兔抗牛脾细胞多克隆抗体,旨在通过免疫外 '科法去除牛供体细胞膜,得到破膜后完整的细胞核,进而应用于胞质内注射,为体细胞核移植提供一 种新的思路,从而提高核移植效率. 1材料与方法 1.1材料 健康成年雄兔3只,体重2"-3kg;牛脾脏,牛卵巢颗粒细胞取自屠宰场;灭菌生理盐水,灭菌四蒸 水,消毒酒精;无菌手术器械(眼科手术剪,手术镊,手术刀等),10mL玻璃离心管,匀浆器,灭菌纱布, 10mL,20mL注射器,血球计数板;Sartorious电子天平,超净台,LD5—10B型台式离心机, NikonTE2000一U倒置显微镜. 1.2方法 1.2.1兔抗牛脾细胞免疫血清的制备将无菌摘取的牛脾脏剪碎,匀浆,无菌纱布过滤,滤液1000 r/min离心10min,弃上清,加入生理盐水,混匀后同样条件离心10min,弃上清,管底余约2mL生理 盐水和细胞沉淀物,吹打混匀,加入无菌的四蒸水至10mL,混匀后1000r/min离心10min,弃去上层 ? 收稿日期:2008一l1一l2;修回日期:2009—05—10 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30460054);国家基础科学人才培养基金项目(J0730648) 作者简介:陈玉龙(1984~),男,重庆人,2004级生物技术专业本科生. 通讯作者:李煜(1956~),男,河北省蔚县人,教授,博士.E—mail:liyu—cn@hotmail.com 456内蒙古大学(自然科学版) 红色悬液,加入生理盐水,制成10mL细胞悬液,自然沉降5min,取上清细胞悬液移到另一离心管中 用生理盐水离心洗涤,并进行细胞计数.每周一次对家兔耳静脉注射新鲜的牛脾白细胞悬液(每只兔 1O个细胞)进行免疫,连续注射5周.最后一次注射10d后采用颈动脉插管法采血,待血浆自然凝固 后收集血清.收集到的血清分装于血清瓶中,一20?冰箱冷藏以备后用. 1.2.2血清效价的测定取8只试管,各盛0.2mL生理盐水,向1号试管中补加0.2mL免疫血清, 混匀后吸出0.2mL混合液加在2号试管内,同样混匀后吸出0.2mL混合液加在3号试管内,其它各 管的血清稀释方法依次类推.由此构成1,7管的血清倍比稀释浓度梯度为:1:2,1:4,1:8,1:16, 1:32,1:64,1:128,第7管混匀后弃掉0.2mL混合液,使各管的容量一致.第8管为 盐 0.2mL生理 水对照,其操作方法见图1.向1,8试管中同时加入等量牛红细胞悬液,室温静置2h,观察溶血反应. 0.2mL血清(试管1) oooooooo 1/21/41/81/161/321/641/128对照 下排数字表示抗血清的稀释度 Thedigitsoflowrowindicatethedilutestrengthofantiserum 图1免疫血清效价 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 示意图 Fig.1Aflowchartofanalyzingtheantibodytiterofimmuneserum 1.2.3细胞凝集试验将兔抗牛脾细胞免疫血清在56?,30min条件下灭活补体,在洁净的载玻片 上分别滴加1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64稀释的免抗牛脾细胞免疫血清一滴,滴加生理盐水为对 照,然后在每滴中滴加牛卵巢颗粒细胞悬液一滴,室温条件下放在垫有湿纱布的手术器械盘中反应两 小时,显微镜下观察 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 细胞凝集形态. L2.4裂解颗粒细胞膜取1.5mL离心管1O个,编号,每管加100L新鲜洗净的牛卵巢颗粒细胞 悬液(细胞1O个/mL,其中电解质为0.9的生理盐水),在离心管中依次加入1O弘L,2OL……100 L未灭活解冻血清,吹打混匀,反应10rain后再次吹打,用移液器从各管中取出3OL混合液滴于干 净载玻片上,置于倒置显微镜下观察破膜情况. 2结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2.1血清制备与效价测定 采用红细胞溶解法测抗血清效价,免疫血清的溶血效果均很明显(图2),三只实验用兔的抗血清 的溶血稀释度均达到了1/64.结果表明:牛脾脏白细胞表面存在与其红细胞表面相同的抗原标记; 以牛脾白细胞为抗原制备免抗牛体细胞多克隆抗体,可以采用溶血法间接测定其抗血清效价. 2.2细胞凝集试验 经显微镜检验,牛卵巢颗粒细胞在滴加1/2,1/4,1/8,1/16稀释的兔抗牛脾细胞免疫 血清中均有 凝集反应.血清稀释度在1/8时,凝集反应较强.实验结果表明:牛卵巢颗粒细胞膜上具有牛脾白细胞 膜上相同的多克隆抗原;制备的血清可以用于牛卵巢颗粒细胞膜蛋白的检测及免疫反应(图3). 2.3颗粒细胞的破膜反应 用自制的血清与新鲜的牛颗粒细胞反应可成功破碎颗粒细胞膜,得到大量完整的细胞核.在反应 第4期陈玉龙等免疫外科法分离牛卵巢颗粒细胞核457 的第一阶段,供体细胞聚集成簇,接着出现破膜反应,破膜反应在10~20min内反应完毕,得到了去 膜完整的细胞核(图4).实验结果表明:利用多克隆抗体及免疫外科方法可以有效破坏细胞膜;经适当 处理可得到游离的核膜完整的细胞核. 1/21/41,81/161/3211641/128对照 血清稀释度 图2兔抗牛脾细胞免疫血清效价测定 Fig.2Titrationofimmuneserum(rabbitantibodytoOXspleencells) (a)示未加抗血清时未凝集的细胞(IOOX)(b)示加1/8稀释的抗血清后凝集的细胞(1OON) (a)Thestatusofnonagglutinatingcellswithoutthe(b)Thestatusofagglutinatingcellswiththe 1/8 antiserum(1O0×)图3\dilutedantiserum(IOOX) 抗血清对牛卵巢颗粒细胞的凝集作用 Fig.3Agglutinationofantiserumtotheovario—granuleceilsofthebovine (a)完整的牛卵巢颗粒细胞(200X) (a)Intactovario-granulecellsofbovine(200X) (b)颗粒细胞破膜后细胞核的释放(1OOL细胞悬液+ 100L抗血清200X);(b)Releasedcellnucleusafter themembranesweredestroyedbytheantiserum(100 iLLcellsuspension-/-100t*Lantiserum200×) 图4抗血清对牛卵巢颗粒细胞的破膜作用 Fig.4Ruptureeffectoftheantiserumtothemembranesofbovineovario-granulecells 458内蒙古大学(自然科学版) 3讨论 免疫外科法分离小鼠早期胚胎内细胞团的研究成果在制备小鼠嵌合体和胚胎干细胞建系中得到 广泛应用.吖,此种方法可有力提高内细胞团分离效率,同时也证实了小鼠脾脏白细胞的细胞膜上含 有小鼠早期胚胎细胞膜上出现的表面抗原,但未见小鼠卵巢颗粒细胞膜上也有相同抗原分布的报道. 免疫外科法在牛胚胎干细胞建系等研究中曾有过类似的报道叫?,但同样没有脾脏白细胞与颗粒细 胞表面抗原相关性研究.本研究结果表明:牛卵巢颗粒细胞表面含有与牛脾脏白细胞相同的表面抗 原,因此,抗牛脾白细胞多克隆抗体在补体存在的条件下,可以有效破碎卵巢颗粒细胞膜,有效释放其 细胞核,是卵巢颗粒细胞核分离,纯化的高效途径.这一技术在细胞核移植(动物克隆),细胞核特性分 析,核质互作等研究领域有实际应用价值. 以脾脏白细胞为颗粒性抗原制备兔抗牛多克隆抗体,其优点是细胞来源广泛,抗原纯化简单.牛 的脾脏较大,组织纤维较多,不能像小鼠那样采用整体灌流的方法得到较纯的细胞.因此,在抗血清制 备过程中采用了组织匀浆的方法制备脾细胞,采用低渗的方法去除其中的红细胞.实验中发现低渗完 毕后产生许多细胞碎片的聚集物和较小的细胞碎片,需对白细胞进一步纯化.此时采取限时自然沉降 的方法,首先沉到离心管底部的是大的细胞碎片聚集物和少量白细胞的混合物,上 层中是较纯的白细 胞和较小的细胞碎片.进一步将上层细胞悬液离心洗涤,可去除小的细胞碎片,从 而得到比较纯净的 白细胞. 在抗血清效价测定时利用了多克隆抗体的特性,采用红细胞溶血反应的方法,操作 简单,省时,省 力,并可通过卵巢颗粒细胞凝集反应加以印证.上述两种方法对于以完整细胞为抗 原的其它动物的多 克隆抗体制备和效价测定提供了有益的借鉴. 在细胞核分离的破膜过程中,涉及到血清最适浓度的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .当细胞与充足的抗体和 补体进行反应 时,破膜完毕后过剩的血清是否会对细胞核造成损坏,是细胞核分离过程中必须考 虑的问题.理论上 只要抗原纯化过程中自细胞的纯度较高,没有残留的游离的细胞核,就不会产生抗 核的抗体,因此就 不会造成核膜的破裂.这就需要在制备抗原细胞时充分注意细胞的纯度.至于核膜 上是否存在细胞表 面相同抗原的问题还需要进一步探讨. 参考文献: [1]RhoGJ,HahnelAC,BetteridgeKJ.Productionofbovineembryosbyintracytoplasmicinj ectionofnuclei isolationedfromprimordialgermcells[J1.Theriogenology,1999,51:213. 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(责任编委哈斯?阿古拉) SegregatingNucleusfromBovineOvario—granularCells byImmunosurgery CHENYu—long,YANGLi—jun,HUANGXiang—hua,LIYun—xia,ZHAOYu— hang,LIYu (TheKeyLaboratoryf.orMammalianReproductiveBiologyandBiotechnology, MinistryofEducation,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China) Abstract:Theexperimentisaimedtopreparerabbitanti—bovineserumwhichcouldbethe utilizedintheprocessingofdestructingthemembraneofbovinegranulosecells,thusintactnucleus w0uldbeobtained,extractedandpurified,finallythenucleuswouldbeappliedinintracytoplasmic nuclearinjection.Intheinitialstage,thepurifiedbovinespleencellswereinjectedinexuberant rabbitsonceaweekforfPceweeks,andthenexsanguinatedtheseexperimentalanimals.The harvestedserumwasbottledandrefrigeratedandthenreactedwithnewlyfetchedbovinegranulose cells.Intheprocessthereaction,agglomerationphenomenaanddestructionofmembraneswere observedrespectively.Intheend,abatchofdonornucleuseswereobtained.Themethodprovides somaticnucleartransferanewpathway,whichdeservesthereferenceofrelevantresearches. Keywords:immunosurgery;antibodypreparation;nuclearsegregation