紫杉醇脂质体的研究进展

赵晓晓 � 蔡 � 宇 : 暨南大学药学院 � 广东广州 � 510632 紫杉醇脂质体的研究进展 赵晓晓 � 蔡 � 宇 EVOLVEMENT OF RESEARCH ON PACLITAXEL LIPOSOME ZHAO X iaox iao, CAI Yu � � �关键词 � 紫杉醇 � 脂质体 � 研究进展 � � do:i 10. 3969 /.j issn. 1671- 332X. 2010. 09. 002 � � 紫杉醇最初从红豆杉的树皮中提取得到, 1971年 W an i 等获得了纯品并确证了其结构, 为二萜类化合物,并具有抗 肿瘤作用。其作用机理为: 通过对微管蛋白稳定化作用而抑 制其分解, 同时阻断细胞分裂周期中的 G2和 M 期, 导致细 胞死亡, 从而抑制肿瘤的生长 [ 1- 2]。 1983年开始了紫杉醇 !期临床试验, 1992年被 FDA批准上市用于治疗卵巢癌和 转移性乳腺癌, 商品名为 taxo l。由于其特殊的作用机理以 及较好的疗效, 紫杉醇备受关注,临床上主要用于卵巢癌、乳 腺癌、非小细胞癌等 [ 3]。大部分抗癌新药在最初的研究中 都是静脉注射给药, 然而,紫杉醇在水中的溶解度很低,制备 成注射剂有一定的困难。在早期的研究中,为了解决这一难 题, 人们常常在注射剂中加入聚氧乙烯蓖麻油 ( CrEL ), 现在 临床上经常使用的紫杉醇注射液 ( T axo l )中的紫杉醇就是 靠聚氧乙烯蓖麻油与脱水乙醇以 1∀1的比例组成的混合液 来稳定和溶解的 [ 4]。但是由于治疗需要较大量的紫杉醇, 因而需要较大量的 C rEL。 CrEL不是惰性载体, 有一定的生 物活性, 较大量的 CrEL会产生过敏性反应、高血脂症、脂蛋 白的异常、红细胞的聚合、周围神经病变等 [5]。因此, 开发 研究紫杉醇新剂型, 如注射用微乳、聚合物微粒 (微囊、微球 等 )、毫微粒、纳米胶束、环糊精包合、脂质体、磁性微球制剂 等已成为一个热点。其中脂质体具有两亲性,毒性低, 理论 上是一种较为理想的药物载体。 1� 紫杉醇脂质体 脂质体是由磷脂和胆固醇组成的具有类似生物膜的双 分子层结构。 1971年 Rymen等人开始将其作为药物载体。 相比于其他载体, 脂质体具有以下优点: # 细胞亲合性和靶 向性; ∃ 缓释性; % 降低药物毒性; &提高药物稳定性。脂质 体可分为普通脂质体和特殊性能脂质体。 1. 1� 普通脂质体 普通脂质体就是不经过任何修饰的脂质体,容易被网状 内皮系统 (RES)吸收,因此用普通脂质体包裹的药物对 RES较 为有效。但由于其靶向性较差,以及可能会存在一些稳定性问 题,所以通常对普通脂质体进行修饰得到特殊性能的脂质体。 1. 2� 特殊性能脂质体 1. 2. 1� 长循环脂质体 � 通常在脂质体的表面用聚乙二醇 ( PEG )修饰, 这样 PEG增强了脂质体的亲水性, 可避免被 RES吞噬,延长了在体内的循环时间, 因此被称为长循环脂 质体,又被称为空间稳定脂质体 ( Ste rically Stabilized L ipo� som es, SSL )或隐形脂质体 ( S tealth L iposom es, SL )。由于其 在体内的循环时间延长, 有利于疗效的提高, 因此是一种较 为常用的药物载体。HUANG Y[ 6]等以大豆磷脂 ( Soybean phosphatidy lcho line, S100- PC)、胆固醇、甲氧基聚乙二醇二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺 ( 1, 2 - D istearoy l- sn - g lycero- 3- phosphoethano lam ine[ m ethoxy ( polyethy lene g lyco l) - 2000 ] ( mPEG2000- DSPE ) )为膜材, 比例为 90∀10∀5, 通过薄膜分 散法制备得到紫杉醇空间稳定脂质体 ( SSL- PTX )。通过透 析的方法观察 SSL- PTX中紫杉醇的释放情况, 并考察了其 在体外对上皮细胞增殖和迁移的影响, 以及对异种嫁接 MDA - MB- 231肿瘤的 BALB / c裸鼠抗肿瘤和抗血管生成 作用。结果发现, SSL- PTX中的紫杉醇释放较缓慢, 延长了 紫杉醇在体内的时间; 体外试验表明, 其能够有效抑制上皮 细胞增殖和迁移;体内试验表明, 其可以通过抗血管生成作 用抑制肿瘤生长。研究结果表明, 不含 C rEL的 SSL - PTX 用于化疗是可行的、有效的。 1. 2. 2� 免疫脂质体 � 在脂质体表面接上某种抗体, 使其具 有对靶细胞分子水平上的识别能力, 提高脂质体的靶向性。 YANG T [ 7]等在 PEG修饰的紫杉醇脂质体接上抗体后形成 的免疫脂质体,能够有效靶向地将紫杉醇送至人表皮生长受 体 2(H um an Ep iderm a l g row th factor receptor- 2, H ER2)过度 表达的乳腺癌细胞中,这说明这种免疫脂质体对 HER2过度 表达的乳腺癌的治疗是很有希望的。 1. 2. 3� 磁性脂质体 � 磁性脂质体 ( M agnetic liposom es)是在 脂质体中加入一些对人体无害的极小铁磁性物质, 一般为超 微磁粉 Fe 3 O 4 , 然后利用外加磁场将其定位于体内的靶部 位。这样既提高了疗效, 也减轻了药物对其他器官的损 害 [ 8]。ZHANG J Q[ 9]等通过逆相蒸发法制备得到紫杉醇磁 性脂质体,并将其置于一定条件下得到低压冻干的磁性脂质 体。以患有 EMT - 6乳腺癌的小鼠为模型, 对其药物代谢动 力学特征进行考察。结果发现, 相比于含有 C rEL脂质体而 言,这种磁性脂质体的半衰期延长,血浆清除率降低, 体内药 物浓度较高。通过异种嫁接模型研究表明, 磁性脂质体能够 有效地将药物送至肿瘤细胞,并具有显著的抗癌活性以及较 少的不良反应。 1. 2. 4� 阳离子脂质体 � 有人研究发现 ,阳离子脂质体对肿 瘤血管生成上皮细胞具有选择性靶向作用 [ 10]。这能够使阳 现代医院 2010年 9月第 10卷第 9期 � 专业技术篇 � Modern H osp ita lS ep 2010 Vol 10 No 9 离子脂质体包裹的抗癌药物选择性地到达肿瘤血管上皮细 胞, 抑制血管生成,肿瘤细胞因此失去了营养来源,并且还会 受到代谢物的蓄积作用, 从而起到抗癌作用。MARCUS [ 11] 等研究发现, 在患有黑素瘤的雄性叙利亚金仓鼠中, 经过静 脉注射紫杉醇阳离子脂质体的那组肿瘤生长速度比其他组 显著缓慢, 而且局部淋巴结的转移也比较缓慢。实验数据显 示, 阳离子脂质体能够有效选择肿瘤微血管, 并提高紫杉醇 的抗癌功效, 这也为阳离子脂质体的肿瘤新血管靶向治疗提 供了理论依据。 2� 紫杉醇脂质体面临的问题 2. 1� 紫杉醇的来源 紫杉醇主要来源于红豆杉的树皮,红豆杉为常绿灌木或 乔木, 属浅根植物,是第四纪冰川遗留下来的古老树种,在地 球上已有 250万年的历史。由于红豆杉生长缓慢, 再生能力 差, 地理分布局限,加上近年来人们对紫杉醇的热门研究导 致其过度砍伐, 成为了世界公认的濒临灭绝的天然珍稀植 物, 中国已将其列为一级珍稀濒危保护植物。因此, 紫杉醇 的来源减少了。另外, 紫杉醇在红豆杉中的含量较低, 这就 更加使得紫杉醇长期稳定的大量供应面临着严峻的挑战。 如何增加紫杉醇的来源,已成为一个亟需解决的问题。 2. 1. 1� 人工栽培红豆杉 � 由于天然红豆杉资源稀少, 面临 着巨大的市场需求, 可以进行人工栽培。红豆杉是一种典型 的荫性树种, 对温度、水分、光照等要求特别严格, 对森林类 型的选择以及层间植物种类也有着严格的要求。红豆杉幼 树喜荫湿, 贺利中 [ 12]等采取不同遮荫强度及时间, 对南方红 豆杉苗木进行培育试验。结果发现, 1年生苗遮荫 70% ~ 90% 13 h生长较好, 2年生苗遮荫 70% 13 h, 而 3~ 4年生 苗遮荫 50%且需遮荫 6 h为宜。同时, 还要注意种子的处 理、播种季节、水肥草的管理以及病害虫的防治等 [ 13]。 2. 1. 2� 紫杉醇的化学合成 � 2000年, KUSAMA [ 14]等通过一 种线性合成方法, 依次合成了 A环、B环、C环、D环,这样全 合成了紫杉醇。DO I[15]等采用了一种会聚的方法, 从 A环 和 C环开始合成紫杉醇。但这两种合成方法都比较复杂, 用于工业化生产有一定的难度。 由于紫杉醇结构复杂, 其全合成路线长, 产率低。而半 合成则相对容易一些,与全合成不同的是,半合成以植物中 的天然产物为起始原料合成最终的产物,一般已具备最终产 物的基本骨架及其多数官能团,甚至已具备最终产物所需构 型。 10-去乙酰浆果赤霉素∋ ( 10- deacety lbaccatin- ∋ , 10 -去乙酰巴卡亭 ∋ )和巴卡亭 ∋是用于半合成紫杉醇较多 的起始原料, 10-去乙酰巴卡亭∋通常转化为巴卡亭 ∋ , 再 经过半合成得到紫杉醇。巴卡亭∋在红豆杉中的含量高于 紫杉醇, 并且可以从红豆杉叶中提取。另外,半合成紫杉醇 可使其侧链具有很大的变化性,有利于发现更有活性的紫杉 醇衍生物。MANDAI[ 16]等以巴卡亭∋为原料, 通过半合成方 法得到紫杉醇。紫杉醇半合成的关键是前体巴卡亭 ∋的获 得和生产。巴卡亭∋可以从红豆杉中提取,但这样一方面会 造成对红豆杉资源的破坏, 另一方面成本较高。除了从植物 中提取外, 还可以利用微生物和酶法获得巴卡亭∋。 LON� CAR IC [ 17]等利用产生内源性乙酰 CoA, 以及表达 10 -去乙 酰浆果赤霉素∋ - 10�- O乙酰转移酶 ( DBAT )基因的大肠 杆菌,将去 10-乙酰浆果赤霉素 ∋转变为巴卡亭∋。这种 方法不会造成对红豆杉资源的破坏, 并且产量较高。 2. 1. 3� 利用生物技术生产紫杉醇 2. 1. 3. 1� 细胞培养法制备紫杉醇 � 细胞培养法是商业化生 产紫杉醇的有效途径,这种方法不会造成对珍稀红豆杉资源 的破坏,还能增加紫杉醇的来源,适合大规模生产, 易于实现 产业化。细胞培养的步骤一般为: # 形成愈伤组织; ∃ 继代 培养; % 悬浮培养; &大规模培养, 营养条件以及空气组分是 很重要的影响因素 [ 18]。用该方法得到的紫杉醇的产量高低 与细胞的培养条件有关, 改善培养条件, 可以使紫杉醇的产 量提高。陈勇琴 [ 19]等研究发现, 培养基的种类,不同的植物 激素以及氮源的不同等都会对红豆杉愈伤组织的生长产生 影响,进而对紫杉醇的产量产生影响。 2. 1. 3. 2� 利用真菌合成紫杉醇 � 1993年, Strobel等从短叶 红豆杉中分离得到一种能够产生紫杉醇的真菌。随后的几 年中,寻找其他能够产生紫杉醇的真菌成为了一个热点。目 前,主要发现了三种菌种: HQD33, HQD48, HQD54。其中, HQD33菌种的芽孢可以经过一系列的诱变作用得到 NCEU - 1菌种, 该菌种可以用来培养紫杉醇 [ 20]。 此外,还可以利用生物合成、发酵等方法生产紫杉醇。 生物合成中有很多酶参与的反应, 应对关键酶提取、分离、纯 化,最终克隆到关键基因, 并通过基因工程手段实现紫杉醇 的工业化生产。 2. 2� 脂质体的稳定性 脂质体作为一种药物载体, 具有许多优点, 因此成为研 究热点。目前,脂质体存在的主要问题是稳定性差, 包括药 物易泄露、磷脂易氧化等。脂质体的稳定性问题主要包括以 下几个方面。 2. 2. 1� 化学稳定性 � 天然磷脂是构成脂质体的主要成分,其 分子中含有不饱和脂肪酸链,易被氧化水解, 导致药物泄露, 产生毒性。金属离子、辐射、高温、pH、酶的存在均会影响磷脂 的氧化水解,从而影响双分子膜的流动性,进一步影响脂质体 的稳定 [21]。因此,选择饱和磷脂作为脂质体的膜材, 并加入 一定的抗氧化剂,可在一定程度上提高脂质体的稳定性。同 时还应注意脂质体的储存条件。另外, 脂质体的电性对其包 封率、稳定性、靶器官分布及对靶细胞的作用均有影响。 2. 2. 2� 物理稳定性 [ 22] � 脂质体的粒径大小、组成、温度以 及所载药物的性质等均会影响其物理稳定性。不同粒径大 小的脂质体受外界因素或体内因素影响会发生不同的理化 性质变化。小于 150 nm的脂质体可减少肝、脾的摄取程度。 脂质体粒径大小可用光学显微镜或电镜测定, 也可用 Cou lter 计数器、粒度分布光度测定仪等测定。脂质体的组成对其稳 定性有直接影响。不同性能的脂质体 (如长循环脂质体, pH 敏感脂质体等 )由不同的膜材组成, 因而具有不同的稳定 性,具有不同的用途。脂质体的物理性质与介质温度有密切 关系。当温度高于相变温度时,脂质体双分子层中酰基侧键 可以从有序排列变为无序排列, 从而引起一系列变化, 如由 胶晶态变为液晶态,膜的流动性增加等;反之, 会引起膜减少 有序排列, 流动性减少。另外, 所载药物的性质 (脂溶性或 水溶性 ), 其辛醇 /水的分配系数会影响脂质体的稳定性。 2. 2. 3� 生物稳定性 � 脂质体在血液中保持稳定是其发挥药 4 现代医院 2010年 9月第 10卷第 9期 � 专业技术篇 � M odernH osp ital Sep 2010 Vol 10 No 9 物载体作用的关键, 也是药物到达靶细胞的关键。血液中含 有很多破坏脂质体的成分, 如磷脂酶可以水解磷脂; 高密度 脂蛋白和血清白蛋白会与磷脂结合形成复合物,使脂质体的 稳定性降低。同时, 脂质体还容易被网状内皮系统 ( RES)吞 噬, 这样可能会使其靶向性降低。 3� 结语 紫杉醇自发现以来由于其特殊的作用机理以及较好的 疗效而备受关注, 然而由于其具有水不溶性的缺点, 传统的 紫杉醇注射液溶剂毒性较大,所以近年来人们一直在研究紫 杉醇新剂型, 其中脂质体是研究的比较热门的一种剂型。脂 质体具有许多优点, 理论上是非常理想的药物载体。但是, 目前国内外上市的紫杉醇脂质体产品较少, 究其原因, 本人 认为有以下几点: 首先, 紫杉醇需求的不断增加在一定程度 上限制了其扩大生产。目前紫杉醇的来源主要有两种途径: 一是直接从红豆杉树皮中提取, 这种方法会造成资源的破 坏, 而且产率较低;另一种途径则是通过半合成的方法制备 得到紫杉醇, 而这两种途径似乎仍不能满足市场需求。近年 来, 国内外就如何增加紫杉醇的来源研究较多, 如人工栽培、 化学合成、组织细胞培养、真菌培养等。由于红豆杉生长比 较缓慢, 利用人工栽培的方法获得紫杉醇需要较长的时间。 紫杉醇化学结构复杂,全合成的方法比较复杂, 合成路线较 长, 并且产率低;细胞培养法等则因为发酵周期长且新的高 产细胞株选育耗时长,目前主要还在实验室研究阶段, 用于 工业化大生产还有待进一步研究。 其次, 脂质体的稳定性、包封率等因素也限制了其工业 化大生产。构成脂质体的主要成分磷脂含不饱和脂肪酸, 易 被氧化水解, 造成药物渗露,产生毒性。脂质体的粒径大小、 表面电荷、温度等因素均会影响其稳定性和包封率, 并且在 血液中易被清除。另外, 在储存、运输期间, 双分子膜易相 变, 小粒径脂质体易相互聚集融合,包裹其中的药物因而发 生渗漏。目前, 通过研究各种具有特殊性能的脂质体, 其稳 定性在一定程度上得到了改善。但是脂质体的制备技术还 不是十分成熟, 在实验室中制备的脂质体可能有较好的稳定 性和包封率, 而这些在工业化大生产中是很难保证的。 第三, 紫杉醇脂质体的价格。生产脂质体需要一定的设 备和工艺, 以及贮藏、运输等要求也较高 ,加之脂质体的主要 膜材磷脂的价格较高。因此, 由传统的注射剂相比, 紫杉醇 脂质体的成本较高, 加重了病人的经济负担。 第四, 其他新剂型与紫杉醇脂质体的竞争。 总起来说, 紫杉醇脂质体应用的限制因素主要是原料和 工业化大生产。增加紫杉醇的来源, 降低其成本, 避免对稀 有资源的破坏, 应成为紫杉醇脂质体今后发展重点解决的问 题。同时, 脂质体及其稳定性的研究涉及多个领域, 应在多 学科结合的基础上, 建立完整成熟的脂质体理论和工艺体 系, 找到适合工业化大生产的先进的制备方法, 并注意储存、 运输等条件, 使紫杉醇能够更好的减轻病人的痛苦, 给癌症 这一医学难题带来希望和突破。 参考文献 [ 1] � SCH IFF P B, FANT J, HORW ITZ S B. 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