酵母单细胞蛋白液体发酵

酵母单细胞蛋白液体发酵 综合实验讲义 主编 赵林 周林 广东药学院 生命科学与生物制药学院 2007.1 目 录 第一部分:实验背景知识 1 概述 2 发酵工业的发展史 3 发酵产品的类型 4 固体发酵和液体发酵 5 发酵过程的控制 6 发酵产物的分离提取 第二部分:酵母单细胞蛋白液体发酵 1 培养基制备与灭菌 2 酵母菌种活化与种子制备 3 液体接种与培养 4 酵母菌的形态观察 5 酵母细胞的分离提取 第三部分:发酵设备讲解与观摩 1 发酵设备概述 2 现场观摩 第一部分:实验背景知识 工业发酵是利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的一门现代工业，而现代发酵工程则是指直接把微生物(或动植物细胞)应用于工业生产的一种技术体系，是在化学工程中结合了微生物特点的一门学科。因而发酵工程有时也称作微生物工程。 一 概述 (一)基本概念 1 发酵一词的来源 发酵现象早巳被人们所认识，但了解它的本质却是近200年来的事。英语中发酵一词fermentation是从拉丁语fervere派生而来的，原意为“翻腾”，它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时的现象。沸腾现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。 2 发酵的定义 (1)狭义 “发酵”的定义 在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，更严格意义上，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳，同时获得能量。丙酮酸被还原为乳酸而获得能量等。它是生命体所进行的化学反应和生理变化，是多种多样的生物化学反应根据生命体本身所具有的遗传信息有序进行，以取得能量来维持生命活动的过程。发酵产物是指在反应过程当中或反应到达终点时所产生的能够调节代谢使之达到平衡的物质。实际上，发酵也是呼吸作用的一种，只不过呼吸作用最终生成CO和水，而发酵最终是获得各种不同的2 代谢产物。 (2)广义 “发酵”的定义 工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气(有氧)培养 1 的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产，还有利用兼性厌氧微生物进行的兼气发酵。产品既有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。 3 发酵工程(Fermentation Engineering)的定义 应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。 (二)发酵的特点 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下: 1，发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。 2，发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 3，发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物。 4，由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。 5，发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。 6，微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，因此可获得常规方法难以生产的产品。 7，工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，可以取得显著的经济效益。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。如除了使用微生物，还可以用 2 动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌’来进行反应;反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。 (三)发酵的类型 根据发酵的特点和微生物对氧的不同需求，可以将发酵分成若干类型: 1，按发酵原料分:糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。 2，按发酵产物分:氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵等。 3，按发酵形式分:固态发酵和深层液体发酵。 4，按发酵工艺流程分则有:分批发酵、连续发酵和流加发酵。 5，按发酵过程中对氧的不同需求分，一般可分为:厌氧发酵和通风发酵两大类型。 (四)发酵过程的组成部分 1 发酵过程的组成 除某些转化过程外，典型的发酵过程可以划分成六个基本组成部分: (1)繁殖种子和制备发酵培养基; (2)培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌; (3)菌种的活化、种子扩大培养和接种。发酵菌种一般保存在冷冻管或冰 箱中的斜面上，在使用前要先接种到新鲜斜面培养基上进行活化，活化后再 用于种子扩大培养。为了进行大规模的工业发酵生产，必须将活化的种子进 行逐级扩大。扩大的方法可根据需要采用固体培养或液体培养两种不同的方 法。固体法一般采用传统的制曲工艺，先用三角瓶扩大，再转接到曲盘扩大 培养。液体法要先在三角瓶摇瓶(好氧菌或兼性厌氧菌)或静置(厌氧菌)扩大 培养，然后再转接到种子罐中进一步扩大培养。种子扩大培养的阶段由发酵 规模决定，如一级、二级或三级等。 (4)微生物在最适合于产物合成的条件下，在发酵罐中生长; (5)产物萃取和精制; 3 (6)过程中排出的废弃物的处理。 六个部分之间的关系如图1-1所示。研究和发展工艺，总是围绕着就逐步改善发酵的全面效益而进行的。在建立发酵过程以前，首先要分离出产生菌，并改良菌种，使所产生的产物符合工业要求。然后测定培养的需求， 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 包括提取过程在内的工厂。以后的发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ，包括连续不断的改良菌种、培养基和提取过程。 图1-1 典型的发酵过程示意图 2 发酵生产的条件 (1)某种适宜的微生物; (2)控制微生物进行代谢的各种条件(培养基组成，温度，溶氧pH等); (3)微生物发酵的设备; (4)提取菌体或代谢产物，精制成产品的方法和设备。 二 发酵工业的发展史 发酵工业的发展史，可以划分成五个阶段。在19世纪以前是第一个阶段。当时只限于含酒精饮料和醋的生产。虽然在古埃及已经能酿造啤酒，但一直到17世纪才能在容量为1500桶(一桶相当于110升)的木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造。即使在早期的酿造中，也尝试对过程的控制。历史记载，在1757年已应用温度计;在1801年就有了原始的热交换器。在18世纪中期， 4 Cagniard-Latour, Schwann和Kutzing分别证实了酒精发酵中的酵母活动规律。Paster最终使科学界信服在发酵过程中酵母所遵循的规律。在18世纪后期，Hansen在Calsberg酿造厂中开始其开拓工作。他建立了酵母单细胞分离和繁殖，提供纯种培养技术，并为生产的初始培养形成一套复杂的技术。在英国麦酒酿造中并未运用纯种培养。确切地说，许多小型的传统麦酒酿造过程，至尽仍在使用混合酵母。 醋的生产，原先是在浅层容器中进行，或是在未充满啤酒的木桶中，将残留的酒经缓慢氧化而生产醋，并散发出一种天然香味。认识了空气在制醋过程中重要性后，终于发明了“发生器”。在发生器中，填充惰性物质(如焦碳、煤和各种木刨花)，酒从上面缓慢滴下。可以将醋发生器视作第一个需氧发生器。在18世纪末到19世纪初，基础培养基是用巴氏灭菌法处理，然后接种10%优质醋使呈酸性，可防治染菌污染。这样就成为一个良好的接种材料。在20世纪初，在酿酒和制醋工业中已建立起过程控制的概念。 在1900年到1940年间，主要的新产品是酵母、甘油、柠檬酸、乳酸、丁醇和丙酮。其中面包酵母和有机熔剂的发酵有重大进展。面包酵母的生产是需氧过程。酵母在丰富养料中快速生长，使培养液中的氧耗尽。在减少菌体生长的同时形成乙醇。限制营养物的初始浓度，以防止出现缺氧现象，这个技术现在成为分批补料培养法，广泛应用于发酵工业;早期使用的向酵母培养液中通入空气的方法，也改进为经由空气分布管进入培养液。空气分布管可以用蒸汽进行冲刷。 在一战期间，Weizmann开拓了丁醇丙酮发酵，并建立了真正的无杂菌发酵。所用的过程，至今还可以认为是一个在较少的染菌机会下提供良好接种材料和符合卫生 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的方法。虽然丁醇丙酮发酵是厌氧的，但在发酵早期还是容易受到需氧菌的污染;而在后期的厌氧条件下，也会受到产酸厌氧菌的污染。发酵器是由低碳钢制成的具有半圆形的顶和底的圆桶。它可以在压力下进行蒸汽灭菌而使杂 3菌污染减少到最低限度。但是，使用200M容积的发酵器，使得在接种物的扩大和保持无杂菌状态都带来困难。有机溶剂发酵技术的发展，是发酵技术的重要进展，为无杂菌需氧发酵工艺的建立铺平了道路。 第三阶段发酵工业的进展在二战期间，由于战争的需要，在纯种培养技术下，以深层培养生产青霉素。青霉素的生产是在需氧过程中进行，它极易受到杂菌的 5 污染。虽然已从溶剂发酵中获得很有价值的知识，然而还要解决向培养基中通入大量无菌空气和高粘度培养液的搅拌问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。早期青霉素生产与溶剂发酵的不同点还在于青霉素生产能力极低，因而促进了菌株改良的进程，并对以后的工业化起着重要的作用。由于实验工厂的崛起，使发酵工业进一步的发展，它可以在半生产规模中试验新技术。与此同时，大规模回收青霉素的萃取过程，也是另一大进展。在这一时期中，发酵技术有重大的变化，因而有可能建立许多新的过程，包括其他抗生素、赤霉素、氨基酸、酶和甾体的转化。 在60年代初期，许多跨国公司决定研究生产微生物细胞作为饲料蛋白质的来源，推动了技术进展。这一时期，可视作发酵工业的第四阶段。最大的有机械 33搅拌发酵罐的容积，已经从第三阶段时的80M扩大到150M。由于微生物蛋白质的售价较低，所以必需比其他发酵产品的生产规模更大些。如以烃为碳源，则在发酵时对氧的需求量增加，因而不需要机械搅拌的高压喷射和强制循环的发酵罐应运而生。这种过程如果进行连续操作，则更为经济。这个阶段工业上普遍采用了分批培养和分批补料培养法。连续发酵是向发酵罐中连续注入新鲜培养基，以促使微生物连续生长，并不断从中取出部分培养液，它在大工业中的应用极为有限。与此同时，酿造业中也研究连续发酵的潜力，但在工业中应用的时间极短。 3如ICI公司还在使用3000M规模连续强制循环发酵罐。超大型的连续发酵的操作周期可超过100天，面临的主要问题是染菌。这类发酵罐的灭菌，是通过下列手段而达到的:即高度标准化的发酵罐结构、料液的连续灭菌和利用电脑控制灭菌和操作周期，以最大限度地减少人工操作的差错。 发酵工业发展史中的第五阶段，是以在体外完成微生物基因操作，即通常称为基因工程而开始的。基因工程不仅能在不相关的生物间转移基因，而且可以精确地对一个生物的基因组进行交换。因而可以赋予微生物细胞具有生产较高等生物细胞所产生的化合物的能力。由此形成新型的发酵过程，如胰岛素和干扰素的生产，使工业微生物所产生的化合物超出了原有微生物的范围。采用基因操作技术，还可以提高工业微生物生产常规产品的能力。 三 发酵产品的类型 工业上的发酵产品有四个主要类别: 6 1，以菌体为产品; 2，以微生物的酶为产品; 3，以微生物的代谢产物为产品; 4，将一个化合物经过发酵改造化学结构------生物转化过程。 这些过程的发展史，将在稍后予以讨论，首先要对四类产品作简要的叙述。 (一) 菌体 工业生产的微生物体，可分为二种。一种是供制备面包用的酵母;另一种是作为人类或动物的食物的微生物细胞(单细胞蛋白质)。早在1900年时，面包酵母已经形成大生产的规模。作为人类食物的酵母生产，则是在第一次世界大战时在德国发展起来的。作为食用蛋白质来源的微生物细胞的生产，直到1960年才作深入的研究。 (二) 微生物的酶 工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优点。而且与植物或动物相比，改进微生物的生产能力也方便得多。微生物的酶的应用广泛，主要在食品及其相关工业中。酶的生产受到微生物本身严格控制。为改进酶的生产能力可以改变这些控制，如在培养基中加入诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术，以消除反馈阻遏作用。 近半人世纪以来，提纯结晶的酶制剂已在百种以上。例如，广泛用于食品加工、纤维脱浆、葡萄糖生产的淀粉酶就是一种最常用的酶制剂。其他如可用于澄清果汁、精炼植物纤维的果胶酶，以及在皮革加工，饲料添加剂等方面用途广泛的蛋白酶等，都是在工业和医药上十分重要的酶制剂。此外，还有一些在医疗上作为诊断试剂或分析试剂用的特殊晦制剂也在深入研究和应用。 (三) 微生物代谢产物 微生物的生长过程，可分为几个阶段。向培养基中接种菌种后，并不立即开始生长，可能是个适应时期，这个阶段称为延缓期。然后细胞的生长率逐渐增加，而达到最大生长率，并成为一个常数，这时称为对数成长期。接着细胞生长停滞进入所谓稳定期。随后，活细胞数下降，培养液进入死亡期。除以动力学描述微生物的生长外，还可以按生长曲线中不同时期所产生的产物来分期。在对数生长期中，所产生的产物，主要是供给细胞生长的物质，入氨基酸、核苷酸、蛋白质、 7 核酸、脂类和碳水化合物等。这些产物称为初级代谢产物。能产生这些物质的生长阶段(相当于对数期)称为营养期(Trophophase)。 利用发酵生产的许多初级代谢产物，具有重大的经济意义(表1-1)。野生型的微生物所产生的初级代谢产物，只限于微生物本身的需要。工业微生物学家的任务是改良野生型微生物并改善培养条件，以增进这些化合物的生产能力。 表1,1 微生物的初级代谢产物及其在工业上的用途 初级代谢产物 用 途 乙醇 含酒精饮料中的活性成份 与石油混合后，可作为汽车的燃料 柠檬酸 食品工业与化学工业中多种用途 丙酮和丁醇 溶剂 谷氨酸 调味品 赖氨酸 食品添加剂 核苷酸 调味品 多糖 食品工业 提高油类回收率 维生素 食品添加剂 有些微生物的稳定期培养物中所含有的化合物，并不在营养期时出现，而且未见到对细胞代谢功能有明显的影响。这些化合物称为次级代谢产物。这个生长期(相当于稳定期)则称为分化期(Idiophase)。只有在继续培养过程中，细胞处于不生长或缓慢生长状态时，才能实现次级代谢。这一点是十分重要的。因此，推断微生物在天然环境中，是以相对低的速率生长的;即在自然界中，是以分化期，而不是以营养期占优势。这是微生物在培养过程中的另一个特性。初级代谢物与次级代谢物之间的关系见图。 从图1-2中可见到次级代谢产物是由初级代谢的中间体和产物合成而得。图中的初级代谢途径是极大多数微生物的常见途径。各种次级代谢产物，只是极少数几个微生物种才能合成的。图中的次级代谢产物是由众多微生物所产生。当然，并不是所有微生物都能进行次级代谢。通常，丝状菌、真菌以及产芽孢的细菌都能进行次级代谢，而肠道细菌则都不能。次级代谢与初级代谢的微生物在分类学上的分布截然不同。产生菌细胞在产生次级代谢时的生理学规律，曾经是重要的讨论主题。由于次级代谢产物在工业上的重要性，促使人们对微生物的注意力超过了它们的产物。许多次级代谢物具有抗微生物活性，另一些则是某一特定酶的抑制剂、生长促进剂或具有特殊药理作用。和初级代谢物一样，许多次级代谢产 8 物的生产形成多种形式的发酵过程。野生型微生物只能产生浓度很低的次级代谢物。它们的生物合成受到诱导、降解物的阻遏和反馈系统的控制。 谷氨酸(C5N) 图1-2 初级和次级代谢间的关系(Turner，1972) (粗线表示初级代谢，名称下加粗线者表示次级代谢产物) (四) 转化过程 1 定义 生物细胞或其产生的酶能将一种化合物转化成化学结构相似，但在经济上更有价值的化合物。转化反应是催化脱氢、氧化、羟化、缩合、脱羧、氨化、脱氨化或同分异构作用。生物的转化反应比用特定的化学试剂有更多的优点。反应是在常温下进行，而且还不需要重金属催化剂。将乙醇用微生物转化成乙酸，已是成熟的生产方法。微生物转化还可以生产更有价值的化合物。如利用生物转化过程生产甾体、手性药物、抗生素和前列腺素。 转化发酵过程的奇特之处是先产生大量菌体，然后催化单一反应。一些最新型的过程，是将全细胞或其中有催化作用的酶固定在惰性载体上。具有催化作用的固定化细胞可以反复多次使用。 2 生物转化反应的特点 (1)反应条件温和(30-40?常压，水相反应)反应选择性高; 9 (2)反应产物纯度高(包括光学纯); (3)反应底物简单便宜(一般无毒、不易燃); (4)反应收率主要取决于菌种的性能; (5)设备简单。 四 固体发酵和液体发酵 一般发酵工艺过程按照培养基物理性状不同，将发酵方式分为两大类:固体发酵和液体发酵。 (一)固体发酵 固体发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。固体发酵起源于中国，具有几千年的历史。近年来，由于固体发酵具有节水、节能的独特优势，属于清洁生产技术、逐步得到世界各国的重视。根据物料堆积和通气方法可将固态发酵细分为浅层发酵、转桶发酵和厚层通气发酵3种方式。目前我国酒类、酱油、食醋等的酿造主要采用固态发酵。下面以浅层发酵为例说明固体发酵过程。 (1) 种曲制作 试管斜面?锥形瓶菌种?曲盒菌种?曲池。逐级扩大培养 一般采用含有麸皮的固态基质。 (2) 成曲制作 将配制好的物料蒸后冷却到40?左右时按2%-4%的比例接 入种曲，混合均匀后移入通风制曲池。曲层厚度25-30cm，曲料保持 疏松，厚度一致，保温28-32?，当曲成熟后保存备用。 (3) 发酵 将种曲接入蒸后物料中，在40-50?进行发酵，此阶段利用成 曲中微生物产生的酶对物料进行分解转化，产生所需要的代谢产物。 (4) 产物的分离提取 根据产物的性质进行。 (二)液体发酵 是将发酵原料制成液体培养基，接种微生物，通过其代谢活动，使发酵原料转化为发酵产品。液体发酵可分为表面发酵和深层发酵两种方式。其中深层发酵是应用最广的方式。深层发酵是微生物的菌体或菌丝体均匀分散在液体培养基中，根据发酵微生物对氧的需求通入或不通入无菌空气。现代发酵工业中，抗生素、有机酸、氨基酸、酶制剂等许多产品都可通过液体深层发酵来实现。深层发 10 酵具有生产规模大，发酵速度快，生产效率高，容易进行自动化控制等优点。根据生产过程液体深层发酵可细分为分批发酵(间歇发酵)、连续发酵、补料分批发酵和计算机控制的发酵。 五 发酵过程的控制 微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。 发酵工艺条件控制的目的就是要为生产菌创造一个最适的环境，使生产所需要的代谢活动得以最充分的表达。在发酵过程中通常要对培养温度、pH、溶解氧、二氧化碳、泡沫、补料等因素进行控制，使其符合生物细胞生长的需要，从而获得高产高质的产品。 六 发酵产物的分离提取 是指从发酵液中分离、精制有关产品的过程，也称发酵生产的下游加工过程。发酵液是含有细胞、代谢产物、剩余培养基等多组分的多相系统，粘度非常大，从中分离产物很困难;发酵产品在发酵液中浓度一般很低;有些发酵产品具有生物活性，在分离提纯过程中很容易失活。上述原因使下游加工过程很困难，也使其成为发酵工业的重要组成部分。当发酵结束后根据所要分离产物的性质进行产物的分离提取。若需要的是菌体，要用离心沉淀或板框压滤将菌体与发酵液或发酵基质相分离，然后进一步加工成产品。若需要的是细胞外产物，要通过过滤戒离心收集清液，再根据性质的不同进行离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取和精制。若是胞内产物，要收集细胞并裂解细胞，使产物释放，然后进一步分离提取。 11 1 预处理和固液分离 通过预处理可改善发酵液性质，有利于固液分离。常用的处理方法有酸化、加热、加絮凝剂等方法。固液分离常用过滤、离心等方法。如果目的产物在细胞内，还需要破碎细胞。在发酵工业中常用高压匀浆器和球磨机对细胞进行破碎。破碎后通过离心、两水相萃取等方法使滤液和细胞碎片分离。 2 提取 通过预处理，目的产物存在于滤液中。由于滤液的体积较大，目的产物的浓度较低，需要通过提取使目的产物得到浓缩，同时也除了一些杂物质，使目的产物得到一定程度的纯化。常用的提取方法有吸附法、离子交换法、沉淀法、萃取法、超滤法、蒸馏法。 3 精制 经过提取使目的产物得到浓缩和一定程度的纯化，要通过精制使目的产物得 到纯化，从而使纯度达到目的要求。小分子物质的精制常采用结晶操作，大 分子的精制常采用层析分离，包括凝胶层析、离子交换层析、聚焦层析、疏 水层析、亲和层析等。 4 成品加工 经过提取和精制后，一般根据产品应用要求，还要对目的产物进行浓缩、过 滤除菌、去除热原、干燥、加稳定剂等操作。 5 废物的回收和利用 12 第二部分:酵母单细胞蛋白液体发酵 实验目的: 1. 学习酵母单细胞蛋白的发酵方法和发酵过程的优化控制; 2. 学习和掌握液体发酵的方法和一般过程。 实验原理: 发酵是一项古老而又现代的生物技术，在食品、饲料、环保、冶金，尤其是现代医药领域有着广阔的应用。其实质是利用微生物的生命活动来为人类生产出有用的物质，包括菌体蛋白、初级代谢产物、次级代谢产物、基因重组蛋白或多肽等，主要过程有菌种的活化、培养基的制备和灭菌、种子(根据需要可以有一级种子、二级种子、三级种子)的制备、接种、发酵及其过程的监控、产物的分离纯化、成品制备。 酿酒酵母是一种食品级的微生物，人类从几千年前就开始利用它了，像夏禹时期就有仪狄作酒的记载。干酵母蛋白质含量高达45%，且其蛋白氨基酸品种齐全，维生素丰富，营养价值较高，是饲料工业、医药工业、发酵工业和食品工业的重要原料。早在1900年时，面包酵母已经形成大生产的规模。作为人类食物的酵母生产，则是在第一次世界大战时在德国发展起来的。酵母单细胞蛋白一直是欧美市场上缺乏的蛋白质资源，国内也很匮乏。 本次实验是在学完发酵工艺原理理论课的基础上，以液体发酵法制备酿酒酵母单细胞蛋白为实践内容，深入地理解发酵的原理、方法、一般过程、过程的优化控制。通过实践与理论的结合，使学生掌握好发酵工艺原理课程。 【实验安排】 本实验安排在第十二周周六、周日两天进行。 第一天: 讲解、熟悉仪器设备、培养基的配制、灭菌、一级种子的制备 第二天: 摇瓶液体发酵、取样检测、分离出酵母单细胞蛋白 利用实验间隙，分批观摩10L和40L发酵罐，并进行讲解。 13 实验1 培养基制备与灭菌 【实验原理】 培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一个完整的培养基配方组成包括组成成分、各组成成分的浓度和合适的pH。培养基的组成成分主要有碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、生长因子以及特殊用途的前体和诱导物。本实验用由葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物组成的YPD培养基来培养酵母。 灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵，因此所使用的培养基须彻底灭菌。本实验采用121?，30min的湿热灭菌法来对培养基进行灭菌处理。 【仪器、材料和试剂】 (一)仪器 1. 砝码天平 2. 高压灭菌锅 (二)材料 1. 蛋白胨(peptone) 2. 酵母抽提物(yeast extract) 3. 葡萄糖 4. 去离子水 5. pH试纸 6. NaOH 7. HCl 8. 100mL三角瓶 9. 250mL三角瓶 10. 普通棉花 11. 纱布 12. 棉线 13. 玻璃棒 14. 称量纸 14 15. 100mL量筒 16. 500mL烧杯 17. 培养皿 (三)试剂 1.YPD固体平板培养基 葡萄糖:2%，蛋白胨:2%，酵母抽提物:1%，琼脂:2% 2.YPD液体培养基 葡萄糖:2%，蛋白胨:2%，酵母抽提物:1% 【实验步骤】 1. 计算 按YPD固体培养基和液体培养基的配方，计算50mL固体培养基 和250mL液体培养基各物质的用量。 2. 称药品 用砝码天平准确称量各物质。 3. 溶解 将液体培养基的组分放置在500mL烧杯中，加入250mL的去离 子水，玻璃棒搅拌溶解。固体培养基的组分直接放入250mL三角瓶中， 加入50mL去离子水，搅拌均匀(琼脂在室温下不能溶解)。 4. 分装 液体培养基每组按30mL YPD/100mL三角瓶规格分装4瓶，一、 二、三组分别按750mLYPD/250mL、100mL YPD/250mL、125mL YPD/250mL三角瓶规格分装一瓶，四、五、六组按100mL YPD/250mL 各分装一瓶。固体培养基不用分装。 5. 调pH值 250mL三角瓶中培养基的pH值根据要求作设定，一至六组为 原始pH，七、八组分别用酸、碱调为原始pH,1、原始pH，1。 6. 加棉塞 三解瓶口塞上用普通棉花制作的棉塞，棉塞的形状、大小和松 紧要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙。要使棉塞总长约3/5塞入试管或 瓶口内，以防棉塞脱落。 7. 包扎 用双层报纸和线绳包扎，，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。 8. 标记 在报纸上写上培养基名称、组别、日期 9. 灭菌 放置于高压蒸汽灭菌锅内，121?湿热灭菌30分钟 10. 倒平板 待高压蒸汽灭菌锅降温至60?时，取出培养基，液体培养基室 温放置，固体培养基在已紫外灭菌的超净工作台里倒制2块平板。 15 【实验注意事项】 1. 准确称量各物质，称完药品应及时盖紧瓶盖。 2. 调pH值时要小心操作，避免回调。 3. 不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 4. 灭菌操作中务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。 16 实验2 酵母菌种活化与种子制备 【实验原理】 菌种活化是指将保存在砂土管、冷冻干燥管、冷冻斜面中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面或平板培养基进行复苏处理。活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种。这些纯种培养物称为发酵的种子。 种子的一般制备过程可用下图表示: 【仪器、材料和试剂】 (一)仪器 1. 恒温培养箱 2. 超净工作台 3. 恒温摇床 (二)材料 1. 酿酒酵母菌种 2. 接种环 (三)试剂 1. YPD固体培养基 2. YPD液体培养基 【实验步骤】 1. 超净工作台灭菌 打开紫外灯，照射30min，完毕后打开风机吹5min。 17 2. 准备工作 将菌种和2块YPD平板放在超净工作台中，点燃酒精灯，用 75%的酒精棉球擦拭双手。 3. 灼烧接种环 将接种环在酒精灯外焰上来回移动着灼烧，其中螺旋部分 多烧一会儿，接种环烧至红热状态后，移离火焰冷却。 4. 三线法划板 接种环挑取少量酵母菌，左手拿YPD平板在酒精灯火焰旁 打开，接种环在平板表面分三次作“之”字形划线。每次划线后要烧接 种环，再从上一次划痕的尾部拉出后划下一区。重复划一块板。 5. 菌落培养 将划线接种的平板倒置于30?培养箱中培养24h。观察菌落 的大小、颜色、形状。 6. 单菌落接种 在超净工作台中(注意无菌操作)，将30mL YPD/100mL 三角瓶的瓶口连同棉塞在酒精灯火焰上旋转灼烧片刻后取下棉塞，用灼 烧过的接种环挑取一个酵母单菌落，伸入YPD液体培养基中振荡几下， 取出在火焰上灼烧，再将瓶塞塞好。再依次完成另外三瓶30mL YPD/100mL三角瓶的接种操作。 7. 标记 在接种的三解瓶壁上贴上标签，注明菌种名称、操作人、日期。 8. 种子培养 将接种后的培养基置于30?摇床中，200rpm，振荡培养过夜 (12h)。 【实验注意事项】 1. 整个实验过程要严格无菌操作。 2. 标记时请写明操作者的姓名，方便查找和整理，提高效率。 3. 划线及接种完后要将接种环在火焰上灼烧，以杀死残留的酵母菌。 18 实验3 液体接种、培养与过程控制 【实验原理】 发酵过程即细胞的生物反应过程，是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应过程。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。 【仪器、材料和试剂】 (一)仪器 1. 超净工作台 2. 烘箱 3. 恒温摇床 4. 显微镜 5. 分光光度计 (二)材料 1. 酿酒酵母一级种子 2. 移液管 3. 普通棉花 4. 吸耳球 5. 1mL移液枪 6. 载玻片和盖玻片 (三)试剂 1. YPD液体培养基 2. 去离子水 【实验步骤】 19 1. 移液管灭菌 在移液管的尾部塞入一小长条普通棉花，用报纸包扎在一 起，湿热蒸汽高压灭菌，之后放入烘箱里烤干。 2. 超净工作台灭菌 将吸耳球放入超净工作台中，打开紫外灯，照射 30min，完毕后打开风机吹5min。 3. 准备工作 将酿酒酵母种子和一瓶100mL YPD培养基放入超净工作台 中，点燃酒精灯，用75%的酒精棉球擦拭双手。 4. 接种 在超净工作台中(注意无菌操作)，将装有30mL种子的三角瓶瓶 口连同棉塞在酒精灯火焰上旋转灼烧片刻后取下棉塞，将装培养基的三 角瓶也如此操作。用吸耳球和灭过菌的移液管吸取一定量的酵母种子， 转移到装100mL培养基的三角瓶中，振荡均匀，取500μL用于分析。 其中，一、二、三、七、八组的装液量为30%，四、五、六组的装液量 分别为20%、30%、40%，一瓶种子不够的可以用两瓶。之后将瓶塞和 三角瓶瓶口分别在火焰上旋转灼烧片刻，再将瓶塞塞好。 5. 标记 在接种的三解瓶壁上贴上标签，注明菌种名称、操作人、日期。 6. 培养 将250mL三角瓶置于30?摇床中振荡培养，200rpm培养8h。另 外的种子液静置培养。 7. 取样监测 振荡培养从培养零时开始，每1小时在超净工作台中取 500μL培养液用于分析酵母细胞的生长状况，一为酵母细胞的形态，二 为酵母的生物量。静止培养也从培养零时开始，每1.5小时取样进行同 样的分析。 8. 形态观察 见实验四。 9. 生物量测定 利用分光光度计测600nm处酵母细胞的吸光值，可间接地 反映细胞的多少。 【实验注意事项】 1. 整个实验过程要严格无菌操作，尤其是取样时。 2. 取样的动作要快、准确。 3. 在用分光光度计测OD值时，要迅速，尽是避免细胞沉降所引起的误差。 【实验数据处理】 1. 根据所获得的不同时间点的生物量，绘制出酵母的生长曲线。 20 2. 比较不同pH值、不同的装液量、不同的接种量之间生长曲线及最终生物 量的差别。 【实验结果与讨论】 1. 根据所获得的数据，总结酵母细胞的生长规律。 2. 综合三个参数，确定为获得最大的产量，摇瓶操作时应采取的培养条件。 21 实验4 酵母菌的形态观察 【实验原理】 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍或几十倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖;有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本试验通过美蓝染液水浸片合水,碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种数的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏(McClary)培养基(葡萄糖,醋酸钠培养基)有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 【仪器、材料和试剂】 (一)仪器 1. 显微镜 2. 超净工作台 (二)材料 1. 吸耳球 2. 不同时间取样的酿酒酵母样品 3. 50mL小烧杯 4. 玻璃棒 5. 载玻片和盖玻片 6. 擦镜纸 7. 接种环 8. 酒精灯 (三)试剂 1. 0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液 22 2. 革兰氏染色用碘液 3. 5,孔雀绿 4. 0.5,沙黄液 5. 95,乙醇。 【实验步骤】 1. 美蓝浸片观察(死活细胞的观察) (1) 在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀。 (2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。 (3) 将制片放置3min 后镜检，先用低背景然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 (4) 染色后约0.5h 后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。 (5) 用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 (6) 对于发酵液中的酵母细胞，可以用无菌玻璃棒蘸取后直接制片观察。比较固体培养和液体培养的酵母细胞形态有何异同，并绘图。 2. 水,碘液浸片观察(酵母菌细胞中肝糖粒的观察) 在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3 小滴水，取少许酵母菌苔放在水,碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。 3. 酵母菌子囊孢子的观察 (1) 活化酿酒酵母:将酿酒酵母接种至新鲜的PDA培养基上，置28?培养2,3d，然后移植2,3次。 (2) 移接产孢培养基:将活化的酿酒酵母移至醋酸钠培养基上，置30?恒温培养14d。 (3) 观察:挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，1min后水洗，加95,乙醇30s，水洗，最后用0.5,沙黄液复染30s，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈深绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的形状。 23 【实验注意事项】 1. 用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润。 2. 通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。 【实验结果】 根据观察结果，绘制出酵母和子囊孢子的形态图。 24 实验5 酵母细胞的分离提取 【实验原理】 酵母细胞提取物富含氨基酸、维生素、核酸等营养成分，可用于食品、保健品、医药、饲料等多种领域。可通过机械破裂，化学和酶处理， 巴氏灭菌法， 自 溶，质壁分离和水解等多种技术实现胞内产物的释放。因而首先需要从发酵液中将酵母细胞分离出来。离心分离是生物技术中最常用的分离方法之一，本实验即利用离心技术分离酵母细胞，并比较不同离心操作条件下其生物量的得率，从而确定优化的离心分离条件。另外，工业上常采用板筐过滤机进行酵母细胞的分离。 【仪器、材料和试剂】 (一)仪器 1. 离心机 (二)材料 1. 发酵液 2. 100mL量筒 3. 50mL塑料离心管 4. 玻璃棒、 (三)试剂 丙酮(cp) 去离子水 【实验步骤】 1. 晃动三角瓶，使发酵液中的酵母细胞混合均匀。用量筒测定三角瓶中发 酵液的体积，并均匀的分成4等份移至50mL离心管中。在3000r/min 的转速下，分别离心10min、15min、20min、25min。 2. 从三角瓶中倾出清液，回收酵母细胞，并用少量的丙酮清洗酵母细胞、 称重。绘出离心时间,酵母细胞得率的曲线。 3. 采用相似的步骤，在不同的转速1500，3000，4000r/min下离心10min， 分析转速,酵母细胞得率之间的关系。 4. 根据上述结果，分析优化的离心条件并阐明原因。 25 【实验注意事项】 1. 离心时样品需对称放置并平衡，平衡时如果缺少样品，可以用蒸馏水空 白离心管代替。 2. 各组在离心操作时，对离心时间、转速等进行协调，以节省实验时间。 26 第三部分:发酵设备讲解与观摩 一 发酵设备概述 (一)通风发酵设备 四十年代中期，青霉素的工业化生产，或深层通风培养技术的出现，标志近代通风发酵工业的开始。在深层通风培养技术中，发酵罐是关键设备。在发酵罐中，微生物在适当的环境中进行生长、新陈代谢和形成发酵产物。 通风发酵罐又称好气性发酵罐，如谷氨酸、柠檬酸、酶制剂、抗生素、酵母等发酵用的发酵罐。好气性发酵需要将空气不断通入发酵液中，以供微生物所消耗的氧。 常用通风发酵罐有以下几种类型: (1)机械搅拌发酵罐 (2)气升式发酵罐 (3)自吸式发酵罐 (4)伍式发酵罐 (5)文氏管发酵罐 1 机械搅拌通风发酵罐 机械搅拌通风发酵罐是发酵工厂最常用类型。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促使氧在发酵液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、发酵所需要的氧气。 1，机械搅拌通风发酵罐的基本要求 一个性能优良的机械搅拌通风发酵罐必须满足以下基本要求: (1)发酵罐应具有适宜的径高比;发酵罐的高度与直径之比一般为1.7~4倍左右，罐身越长，氧的利用率较高 (2)发酵罐能承受一定压力; (3)发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧; (4)发酵罐应具有足够的冷却面积; (5)发酵罐内应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底，避免染菌; (6)搅拌器的轴封应严密，尽量减少泄漏。 2，机械搅拌发酵罐的结构 机械搅拌通风发酵罐是一种密封式受压设备，其主要部件包括:罐身、轴封、消泡器、搅拌器、联轴器、中间轴承、挡板、空气分布管、换热装置和人孔以及管路等，如图3-1。 27 (1)罐体 发酵罐的罐体由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成，小型发酵罐罐顶和罐身采用法兰连接，材料一般为不锈钢。为了便于清洗，小型发酵罐顶设有清洗用的手孔。中大型发酵罐则装没有快开入孔及清洗用的快开手孔。罐顶还装有视镜及灯镜。 发酵罐的罐顶上的接管有:进料管、补料管、排气管、接种管和压力表接管。罐身上的接管有冷却水进出管、进空气管、取样管、温度计管和测控仪表接口。 图3-1 搅拌通风发酵罐的结构示意图 (2)罐体的尺寸比例 罐体各部分的尺寸有一定的比例，罐的高度与直径之比一般为1.7~4左右。 发酵罐通常装有两组搅拌器，两组搅拌器的间距S约为搅拌器直径的三倍。对于大型发酵罐以及液体深度H较高的，可安装三组或三组以上的搅拌器。最下面L 一组搅拌器通常与风管出口较接近为好，与罐底的距离C一般等于搅拌器直径D，但也不宜小于0.8D，否则会影响液体的循环。最常用的发酵罐各部分的比ii 例尺寸如图3-2。 28 图3-2 常用的发酵罐各部分的比例尺寸 (3)搅拌器 搅拌器的作用是打碎气泡，使空气与溶液均匀接触，使氧溶解于发酵液中。搅拌器有轴向式(桨叶式、螺旋桨式)和径向式(涡轮式)两种。 轴向式搅拌器:桨叶式、螺旋桨式 径向式(涡轮式)搅拌器(Disc turbine):平直叶、弯叶、箭叶，如图3-3。 图3-3 径向式(涡轮式)搅拌器的结构示意图 29 (4)挡板 挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。通常，挡板宽度取(0.1~0.2)D，装设6~4块即可满足全挡板条件。 全挡板条件:是指在一定转数下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。要达到全挡板条件必须满足下式要求: (5)消泡器 消泡器的作用是将泡沫打破。消泡器常用的形式有锯齿式、梳状式及孔板式。孔板式的孔径约10~20毫米。消泡器的长度约为罐径的0.65倍。 (6)联轴器 大型发酵罐搅拌轴较长，常分为二至三段，用联轴器使上下搅拌轴成牢固的刚性联接。常用的联轴器有鼓形及夹壳形两种。小型的发酵罐可采用法兰将搅拌轴连接，轴的连接应垂直，中心线对正。 (7)轴承 为了减少震动，中型发酵罐—般在罐内装有底轴承，而大型发酵罐装有中间轴承，底轴承和中间轴承的水平位置应能适当调节。罐内轴承不能加润滑油，应采用液体润滑的塑料轴瓦(如聚四氟乙烯等)，轴瓦与轴之间的间隙常取轴径的0.4~0.7,。为了防止轴颈磨损，可以在与轴承接触处的轴上增加一个轴套。 (8)变速装置 试验罐采用无级变速装置。发酵罐常用的变速装置有三角皮带传动，圆柱或螺旋圆锥齿轮减速装置，其中以三角皮带变速传动较为简便。 (9)轴封 轴封的作用是使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄漏和污染杂菌。常用的轴封有填料函和端面轴封两种。 ?填料函式轴封是由填料箱体，填料底衬套，填料压盖和压紧螺栓等零件构成，使旋转轴达到密封的效果(图3-4)。 填料函式轴封的优点是结构简单。主要缺点是:死角多，很难彻底灭菌，容易渗漏及染菌;轴的磨损情况较严重;填料压紧后摩擦功率消耗大;寿命短，经常维修，耗工时多。 30 图3-4 填料函式轴封的结构示意图 ?端面式轴封又称机械轴封。如图3-5，密封作用是靠弹性元件(弹簧、波纹管等)的压力使垂直于轴线的动环和静环光滑表面紧密地相互贴合，并作相对转动而达到密封。 图3-5 端面式轴封的结构示意图 端面式轴封的优点: 清洁; 密封可靠; 无死角，可以防止杂菌污染; 使用寿命长; 31 摩擦功率耗损小; 轴或轴套不受磨损; 它对轴的精度和光洁度没有填料密封要求那么严格，对轴的震动敏感性小。 端面式轴封的缺点: 结构比填料密封复杂，装拆不便; 对动环及静环的表面光洁度及平直度要求高。 (9)发酵罐的换热装置 ?夹套式换热装置 这种装置多应用于容积较小的发酵罐、种子罐;夹套的高度比静止液面高度稍高即可，无须进行冷却面积的设计。这种装置的优点是:结构简单;加工容易，罐内无冷却设备，死角少，容易进行清洁灭菌工作，有利于发酵。其缺点是:传热壁较厚，冷却水流速低，发酵时降温效果差， ?竖式蛇管换热装置 这种装置是竖式的蛇管分组安装于发酵罐内，有四组、六组或八组不等，根据管的直径大小而定，容积5立方米以上的发酵罐多用这种换热装置。这种装置的优点是:冷却水在管内的流速大;传热系数高。这种冷却装置适用于冷却用水温度较低的地区，水的用量较少。但是气温高的地区，冷却用水温度较高，则发酵时降温困难，发酵温度经常超过40?， 影响发酵产率，因此应采用冷冻盐水或冷冻水冷却，这样就增加了设备投资及生产成本。此外，弯曲位置比较容易蚀穿。 ?竖式列管(排管)换热装置 这种装置是以列管形式分组对称装于发酵罐内。其优点是:加工方便，适用于气温较高，水源充足的地区。这种装置的缺点是:传热系数较蛇管低，用水量较大。 2 气升式发酵罐 机械搅拌通风发酵罐其通风原理是罐内通风，靠机械搅拌作用使气泡分割细碎，与培养基充分混合，密切接触，以提高氧的吸收系数;设备构造比较复杂，动能消耗较太。采用气升式发酵罐可以克服上述的缺点。 1，气升式发酵罐的特点 (1)结构简单，冷却面积小; (2)无搅拌传动设备，节省动力约50%，节省钢材; (3)操作时无噪音; (4)料液装料系数达80~90,，而不须加消泡剂; (5)维修、操作及清洗简便，减少杂菌感染。 32 但气升式发酵罐还不能代替好气量较小的发酵罐，对于粘度较大的发酵液溶氧系数较低。 2，气升式发酵罐的结构及原理 分为内循环和外循环两种。其主要结构包括:罐体、上升管、空气喷嘴。其结构如图3-6所示。 图3-6 气升式发酵罐的结构示意图 3，气升式发酵罐的性能指标 气升式发酵罐是否符合工艺要求及经济指标，应从下面几方面进行考虑。 (1)循环周期时间必须符合菌种发酵的需要。 (2)选用适当直径的喷嘴。具有适当直径的喷嘴才能保证气泡分割细碎，与发酵液均匀接触，增加溶氧系数。 3 自吸式发酵罐 自吸式发酵罐是一种不需要空气压缩机，而在搅拌过程中自动吸入空气的发酵罐。这种设备的耗电量小，能保证发酵所需的空气，并能使气液分离细小，均匀地接触，吸入空气中70~80%的氧被利用。采用了不同型式、容积的自吸式发酵罐生产葡萄糖酸钙、力复雷素、维生素C、酵母、蛋白酶等，都取得了良好的成绩。 1，自吸式发酵罐的结构 自吸式发酵罐的主体结构包括:(1)罐体;(2)自吸搅拌器及导轮;(3)轴封;(4)换热装置;(5)消泡器，如图3-7。 33 图3-7 自吸式发酵罐的结构示意图 2，自吸式发酵罐的充气原理 自吸式发酵罐的主要的构件是自吸搅拌器及导轮(如图3-8)，简称为转子及定子。转子由箱底向上升入的主轴带动，当转子转动时空气则由导气管吸入。转子的形式有九叶轮、六叶轮、三叶轮、十字形叶轮等，叶轮均为空心形。 图3-8 自吸式发酵罐的导轮的结构示意图及充气原理 34 3，自吸式发酵罐的类型 根据通气的型式不同，自吸式发酵罐可分为三个类型: (1)回转翼片式自吸式发酵罐; (2)具有转子及定子的自吸式发酵罐; (3)喷射式自吸式发酵罐。 前两者自吸式发酵罐结构简单，制作容易，比较广泛采用。其传动装置有装在罐底及罐顶两种，如装在罐底，则端面密封装置的加工和安装要求特别精密，否则容易漏液染菌。第三种喷射式自吸式发酵罐，电耗少，但是泵的构造复杂。 4，自吸式发酵罐的优点: (1)节约空气净化系统中的空气压缩机、冷却器、油水分离器、空气贮聪、总过滤器等设备，减少厂房占地面积。 (2)减少工厂发酵设备投资约30,左右，例如应用自吸式发酵罐生产酵母，容积酵母的产量可高达30~50克。 (3)设备便于自动化、连续化，降低劳动强度，减少劳动力。 (4)酵母发酵周期短，发酵液中酵母浓度高，分离酵母后的废液量少。 (5)设备结构简单，溶氧效果高，操作方便。 4 伍式发酵罐 1，结构 伍式发酵罐的主要部件是套筒、搅拌器，如图3-9。 图3-9 伍式发酵罐的结构示意图 2，通气原理 搅拌时液体沿着套筒外向上升至液面，然后由套筒内返回罐底，搅拌器是用六根弯曲的空气管子焊于圆盘上，兼作空气分配器。空气由空心轴导入经过搅拌器的空心管吹出，与被搅拌器甩出的液体相混合，发酵液在套筒外侧上升，由套筒内下降，形成循环。设备的缺点是结构复杂，清洗套筒较困难，消耗功率较高。 35 5文氏管发酵罐 其原理是用泵将发酵液压入文氏管中，由于文氏管的收缩段中液体的流速增加，形成真空将空气吸入，并使气泡分散与液体混合，增加发酵液中的溶解氧，如图3-10。这种设备的优点是:吸氧的效率高，气、液、 固三相均匀混合，设备简单，无须空气压缩机及搅拌器，动力消耗省。 这种设备的缺点是气体吸入量与液体循环量之比较低，对于好氧量较大的微生物发酵不适宜。 图3-10 文氏管发酵罐的结构示意图 (二)厌氧发酵设备 发酵设备是发酵工厂中主要的设备，它提供了一个适应微生物生命活动和生物代谢的场所。 由于微生物分厌氧和通风两大类，故供微生物生存和代谢的生产设备也就各不相同。 不论厌氧或通风发酵设备，除了满足微生物培养所必要的工艺要求外，还得考虑材质的要求以及加工制造难易程度等因素。 1 酒精发酵设备 (1)酒精发酵设备的基本要求 1，满足酒精发酵的工艺要求; 2，满足酒精酵母生长和代谢的必要工艺条件。 A(将发酵产生的热量及时移走; 36 B(有利于发酵液的排出，设备的清洗、维修以及设备制造安装方便等问题。 (2)酒精发酵罐的结构 1，基本结构 酒精发酵罐筒体为圆柱形。底盖和顶盖均为碟形或锥形的立式金属容器。罐顶装有废汽回收管，进料管，按种管，压力表、各种测量仪表接口管及供观察清洗和检修罐体内部的人孔等。罐底装有排料口和排污口对于大型发酵罐，为了便于维修和清洗，往往在近罐底也装有人孔。罐身上下部装有取样口和温度计接口(图3,11)。 图3,11 酒精发酵罐的结构示意图 2，发酵罐的冷却装置 根据发酵的大小不同，酒精发酵罐通常采用以下冷却装置: A(中小型发酵罐:多采用罐顶喷水淋于罐外壁表面进行膜状冷却; B(大型发酵罐:由于罐外壁冷却面积不能满足冷却要求，所以，罐内装有冷却蛇管或罐内蛇管和罐外壁喷洒联合冷却装置，如图3,12。 C(也有采用罐外列管式喷琳冷却的方法，此法具有冷却发酵液均匀、冷却效率高等优点。 37 图3,12 酒精发酵罐冷却装置示意图 3，发酵罐的洗涤装置 大型酒精发酵罐通常采用水力喷射洗涤装置，如图3,13。 图3,13 酒精发酵罐洗涤装置的结构示意图 2啤酒发酵设备 传统的啤酒发酵设备是由分别设在发酵间的发酵池和贮酒间内的贮酒罐组成的。目前圆筒体锥底罐(C.C.T)在露天大罐工艺中使用最为普遍，简称露天锥形发酵罐。 38 (1)设备的结构特点 33C(C(T发酵最大特点在于大型化，容积从100~600m(国内也有60m小型的)。 1，设备的外型特点 外简体蝶形或拱形盖，锥形体底，罐筒体壁和锥底有各种形式的冷却夹套，如图3,14。 筒体直径(D)和筒体高度(H)是主要特性参数。对单酿罐一般是D:H,1:1~2。对两罐法的发酵罐D:H,1:3~4，对两罐法的贮酒罐D:H,1:1~2，也有采用直径为3~4m的卧式圆简体罐作贮酒罐。增加H有利于加速发酵，降低H有利于啤酒的自然澄清。 图3,14啤酒发酵罐的结构示意图 39 发酵罐锥底角，考虑到发酵中酵母自然沉降最有利，取排出角为73,75?(一定体积沉降酵母在锥底中占有最小比表面积时摩接力最小)，对于贮酒罐，因沉淀物很少，主要考虑材料利用率常取锥角为120,150?。 2，罐材料 大型C(C(T均采用碳钢加涂料或不锈钢两种材料制成。啤酒是酸性液体，能造成铁的电化学腐蚀，啤酒发酵产生的HS、SO对铁材料会造成氧化还原腐蚀。 22 不锈钢是一种含铬较多的合金，它之所以能够抗腐蚀，原因在于其表面能形成铬含量高、化学性质稳定的氧化层。铬钢中常加入镍、铝、钛、锰等元素，可以改善耐腐蚀性和工艺性能。啤酒厂(包括发酵罐)常用的是8Crl8Ni的不锈钢。提高铬、镍、钼含量可增加抗腐蚀性。 3，冷却夹套 先进的C(C(T均采用换热片式(爆炸成型)一次性冷媒直接蒸发式换热，一次性冷媒(如氨蒸发温度为-3,-4?)蒸发后的压力在1.0MPa,1.2MPa，也就是说换热片需耐高压，制作困难。国内大多用低温低压(-3?、0(03MPa)液态冷媒在半圆管、弧形管的夹套，或米勒板式夹套内流动换热。 图3,15 C.C.T冷却面积分布 40 冷却夹套的发酵罐或单酿罐内一般分成三段，如图3,15，上段距发酵液面15cm向下排列，中段在筒体的下部距支撑裙座15cm向上排列，锥底段尽可能接近排酵母口，向上排列。 啤酒冰点温度可按如下经验式计算: 由于啤酒冰点温度为-2.0,-2.7?。为了防止啤酒在罐内局部结冰，冷媒温度应在-3?左右。国内常用20,~30,酒精水溶液，国内更多用20,丙二醇水溶液为二次冷媒。一次冷媒常用NH。 3 罐体冷却面积由复杂传热计算求得。冷媒移走热量由三部分组成:发酵罐环境(露天)太阳的辐射热和环境传导热;啤酒发酵时，糖的有氧呼吸和厌氧发酵热;啤酒降温(0.4?,h)放热。 啤酒发酵最大放热量为0.15g糖/h产生的热量。啤酒冷却(从+5?-0?)最大放热(0.3?/h)并不重叠，而且由于降温放热大，实际计算是由第一部分和第三部分组成。 对于单酿C(C(T发酵，一次冷媒直接蒸发冷却，冷却面积(F):发酵啤酒体积(V),F/V,0.25,0.30，用二次冷媒冷却FV,0.35,0.40。 4，隔热层和防护层 绝热层材料应具有:导热系数低、体积质量低、吸水小、不易燃等特性。啤酒C(C(T常用如下材料:绝热材料聚酰氨树脂，可现场喷涂发泡，施工方便，价格中等，但易燃。自熄式聚苯乙烯泡沫塑料是最佳绝热材料，但价格贵。采用上述两种绝热材料只需厚度150,200mm。膨胀珍珠岩粉和矿渣棉价格低，因吸水性大需增加厚度200,250mm。 外防护层一般采用0.7,1.5mm厚的合金铝板或0.5,0.7mm的不锈钢板，特别是瓦楞型板更受欢迎。 5，罐主要附件 41 图3,16 C(C(T底部结构 在上中下三段冷却介质进口位置下装智能型铂温度传感器。在圆筒形下部装可清洗取样阀。温度传感器和取样管均需深入罐中300mm。罐顶部应有安全阀、真空破坏阀，CIP执行机构应装在液面上150mm。还应装上视镜、灯镜、空气和二氧化碳排出管等装置。 锥底有直径500mm的快开入孔。如做单酿罐应具有深入锥底800,1200mm的出酒管和排酵母底阀及四通视镜。 (2)圆筒体锥底发酵罐发酵的优点 1，加速发酵 C(C(T发酵和传统发酵相比，由于发酵基质(麦汁)和酵母对流获得强化，可加速发酵。 C(C(T发酵由于罐高度要大于传统5,10倍，发酵液对流的三个推动力得 2到强化。?发酵罐底部产生CO汽泡上升，对发酵液拖曳力大。?在发酵阶段，由于底部酵母细胞浓度大于罐上部，底部糖降快，酒精生成快，造成罐上、下部间密度差而造成对流。?在发酵时控制罐下部温度高于上部(差1,2?)，由于温差引起热对流，特别在发酵后期第一、二推动力减小后，温差对流更能发挥作用。 在C(C(T发酵技术中，主发酵结束不排酵母，全部酵母参于后发酵中VDK 42 的还原，特别是凝聚性差的酵母，发酵液有高浓度酵母参于VDK还原，大大缩短了还原时间。发酵温控自由，可以灵活采用各种温度(大多较高温度)下VDK的还原，更可以缩短后发酵周期。 传统发酵酿造周期，低温发酵需50d以上，快速发酵需25,30d，而C(C(T发酵如单酿罐发酵，酿造周期一般为16,22d，如两罐法发酵一般20,30d，即酿造周期可缩短1/3,1/2倍。可大幅度减少罐数，节省投资。 2，厂房投资节省 传统发酵必须在有绝热层的冷藏库内发酵和贮酒。C(C(T发酵可以大部分或全部在户外，而且罐数、罐总容积减少，厂房投资节省。 3，冷耗节省 C(C(T发酵冷却是直接冷却发酵罐和酒液，而且冷却介质在强制循环下，传热系数高。传统发酵和贮酒，冷量多消耗在冷却厂房、空气、操作人员和机器(如泵、电动机)、发酵罐支座等。根据计算和测定，C(C(T发酵比传统可节省40%,55%冷耗。 4，发酵罐清洗、消毒 传统发酵罐和贮酒罐基本上依赖人工清洗和消毒，根本无法实现自动化程序化。C(C(T发酵可依赖CIP自动程序清洗消毒，工艺卫生更易得到保证。 当然C(C(T发酵也有弱点。由于罐体比较高，酵母沉降层厚度大，酵母泥使用代数一般比传统低(只能使用5,6代);贮酒时，澄清比较困难(特别在使用非凝聚性酵母)，过滤必须强化;若采用单酿发酵，罐壁温度和罐中心温度一致，一般要5,7d以上，短期贮酒不能保证温度一致。 43 二 现场观摩 实验老师带领学生参观我院30L、50L全自动发酵罐，讲解发酵罐的罐体、搅拌器、轴封、消泡器、联轴器、中间轴承、挡板、空气分布管、换热装置、人孔、管路、各种仪表、蒸汽发生器、空压机等，并解释各个部件的功能。 44 45