提取DNA的原理和基本方法

提取DNA的原理和基本 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 植物组织中DNA的提取 试验原理: 脱氧核糖核酸(deoxribonucleicacid，DNA)是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15,的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿,异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95,的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。 植物DNA的SDS提取法: 试验试剂: 1、研磨缓冲液:称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA,Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液:称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80?水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。 6、氯仿,异戊醇:按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、5mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO4(H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70,80?的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol,LHCl。 10、0.2mol/LNaOH。 11、二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓 硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液,浓乙醛:H2O,1:50(V,V),。 12、1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。 13、0.05mol/LNaOH。 14、DNA标准液:取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。 实验步骤: 1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。 2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿,异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。 3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 4、将试管置72?水浴中保温3min(不超过4min)，以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出 试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液,提取液:高氯酸钠溶液,4:1(V,V),，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。 5、再次加入等体积氯仿,异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心(4000rpm)5min，取上清液置小烧杯中。 6、用滴管吸95,的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。 7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。 8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。 9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50,70μg/ml，并在37?水浴中保温30min，以除去RNA。 10、加入等体积的氯仿,异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。 11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。 植物DNA的CTAB提取法: 试验步骤: 1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。 2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65?水浴中，温育30min。 3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。 4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。 5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。 6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56?水浴中过夜。 7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4?预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。 8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。 9、将风干的DNA直接在4?保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20?保存。 细菌DNA的提取方法 针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂: 抽提缓冲液:2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)(去色素)100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water(抑制RNA酶活性) 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤: 1、抽提缓冲液65?预热。 2、加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀，65?，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡，以12,000rpm，离心10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇(24:1)振荡，以12,000rpm，离心10min。 5、重复再作一次步骤4。 6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇)，,20C下沉淀。 7、以2,000rpm，离心10min。 8、弃上清，以70,乙醇条洗沉淀，也可以再用100,乙醇洗，然后溶解于100ml水中。 较为常用的细菌DNA提取方法: 实验步骤: 1、将菌株接种于液体LB培养基，37?震荡培养过夜。 2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。 3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37?温育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65?温育10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇( 真菌DNA提取 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 的两种方法: 第一种方法: 试验步骤: 1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。 3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3,5min(此处是粗提没有加酚)。 4、以4?，1000rpm，离心5min。 5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4?，10,000rpm，离心5min。 6、取上清，加入2/3倍体积的-20?预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。 7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。 8、加入1ulRNaseA(10mg/mL)，37?下处理1h。 9、用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4?，10,000rpm，离心5min。 10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70?沉淀30min以上。 11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20?保存备用。 DNA提取液:0.2MTris-HCl(pH7.5)，0.5MNaCl，0.01MEDTA，1,SDS，3MNaAc。 第二种方法: 试验步骤: 1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入3mL65?预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65?水浴30min,期间混匀2-3次。 3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。 4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm，4?离心5min)。 5、取上清，加入2/3倍体积的-20?预冷异丙醇,混匀,静置约30min。 6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。 7、加入1ulRNaseA(10mg/mL)，37?处理1h。 8、用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4?，10,000rpm，离心5min。 9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70?沉淀30min以上。 10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20?保存备用