软琼脂克隆形成试验[方案]

软琼脂克隆形成试验[方案]软琼脂克隆形成试验[方案] 克隆形成试验-软琼脂克隆形成试验克隆形成率细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接...

软琼脂克隆形成试验[ 方案 ] 克隆形成试验-软琼脂克隆形成试验克隆形成率细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 1、平板克隆形成试验基本步骤: (1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。 (2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37?预温培养液的皿中，并轻轻转 ? 5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2,3周。动，使细胞分散均匀。置37 (3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10,30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 (4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆数克隆形成率= —————×100% 接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 2、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤: (1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40?中不会凝固。 (3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7,10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37? 5%CO2温箱中培养10,14天。 (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40?。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 将1.2,低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6,的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6,低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3,的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液(约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37?，5,CO2 的细胞培养箱中培养2,3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。

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