液质联用基本原理与定量分析流程简介

液质联用基本原理与定量分析流程简介 现代液质联用系统简介 Minxin Meng 孟旻昕 East China, Waters 2013.9.29 To:江南大学食品学院 无锡 1?2012 Waters Corporation 质谱分析过程: 1. 样品通过进样系统进入离子源，由于结构性质不同而电离为各种不同 质荷比(m/z)的气态离子(母离子、碎片离子); 2. 带有样品信息的离子被加速进入质量分析器，不同的离子在质量分析 器中被分离并按质荷比大小依次抵达 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 器，经纪录即得到按质荷比 排列的离子质量谱，也就是质谱 (mass spectrum)。 质谱: 按离子的质荷比的大小依次排列形成的图谱 质谱分析法: 根据质谱给出的信息，进行的定性、定量、结构分析 2?2012 Waters Corporation 3?2012 Waters Corporation 数据系统 真空系统 样品导入 离子源 质量分析器 离子检测器 系统 直接进样 MALDI 四极杆:Quadrupole GC 离子阱、线性离子阱:IT，LIT ESI LC 飞行时间:TOF API APCI CE 傅立叶变换离子回旋共振:FT-ICR APPI 4?2012 Waters Corporation Modern Ionization Source Technology Offline Ionization，离线离子化技术 : MALDI: Matrix Assisted Laser Dissociation Ionization 基质辅助激光解析 : ASAP: Atmospheric Solid Analysis Probe，大气压固体直接进样分析 : …… Online Ionization，在线离子化技术 : ESI: Electric Spray Ionization，电喷雾 : APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization，大气压化学电离 : APPI: Atmospheric Pressure Photo Ionization，大气压光电离 : …… 5?2012 Waters Corporation Matrix Assisted Laser Dissociated Ionization : Offline Ionization technology – Easy to use – No gas needed : Also due to Off-line, – No front end separation – Poor performance to complicated samples 6?2012 Waters Corporation Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP) Obtain Mass Spectrometry Data of Solid and Liquid Samples in One Minute without Sample Cleanup or LC Separation STD ESCi Source 7?2012 Waters Corporation A S A P ASAP? for rapid, non-chromatographic screening <15 seconds 8?2012 Waters Corporation ASAP Heated gas Corona discharge MS inlet Sample loaded onto melting point capillary Licensed from M&M Mass Spec Consulting 9?2012 Waters Corporation Modern Ionization Source Technology Offline Ionization，离线离子化技术 : MALDI: Matrix Assisted Laser Dissociation Ionization 基质辅助激光解析 : ASAP: Atmospheric Solid Analysis Probe，大气压固体直接进样分析 : …… Online Ionization，在线离子化技术 : ESI: Electric Spray Ionization，电喷雾 : APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization，大气压化学电离 : APPI: Atmospheric Pressure Photo Ionization，大气压光电离 : …… 10?2012 Waters Corporation 高效分离系统 高灵敏度检测系统 EI、CI… GC MS 大量的载气 高真空体系 HPLC MS/MS ESI、APCI… 大量的液态流动相 高真空体系 11?2012 Waters Corporation : 离子源技术 – ESI – APCI : 接口技术 – 传统接口 – Z型喷雾接口 : 四级杆理论基础 : 串联四级杆定量分析基础 : LC-MRM定量分析一般原则 12?2012 Waters Corporation 氧化还原反应 LC Flow +2-4kV 13?2012 Waters Corporation Single Ions Remain. 两种模型: “Charge Residue Model “(large ions) E Droplet + + 电荷残留模型 vExplosions + a+ + + p+ + + + + + + o+ Q …………… + + + + + + + + r+ a t i o n + + + + + + + + + + + + Drop Explosion (Rayleigh Instability) + + + + + + + + + + + q + + + + + + + + + + + Ion Evaporation + + Model (small ions) + 离子蒸发模型 14++ + + + + ?2012 Waters Corporation + + ++ + + + + Q + + + + + + + + + : 化合物的浓度 : 基质的性质 : 化合物、溶剂的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面活性 : 流速(去溶剂化速度) 16?2012 Waters Corporation : 信号的饱和归因于离子在液滴表面过于密集,致使某些样品离子不能到 达液滴表面 未饱和 刚好饱和 过饱和 AH+ AH+ AH+AH+ AH+ A AH+ AH+ AH+ AH+ AH+ A AH+ A AH+ AH+ AH+X-A A AH+X- AH+ AH+X- A AH+X- AH+ AH+ AH+X- AH+ AH+ AH+X- AH+ A AH+X- AH+ AH+ AH+ AH+ AH+ 液滴中样品浓度增长的示意图 17?2012 Waters Corporation : 一般而言,样品信号强度响应随着其它电解质浓度的增高而 降低 : 这一现象叫作„离子抑制? : 样品离子和电解质离子对电荷及占据液滴表面的竞争导致 离子抑制 18?2012 Waters Corporation 样品离子与电解质离子竟相转化为 1. 表面竞争 气相离子的竞争使样品响应降低. NH4+ AH+ NH4+ NH4+ A AH+ NH4+ A AH+OAc- 电解质浓度 NH4+OAc- NH4+ NH4+ NH4+OAc- AH+ A AH+ NH4+ NH4+ 样品响应 2. 电荷竞争 OAc- + AH+ , HOAc + A 19?2012 Waters Corporation : 对于正离子检测模式，样品必须比基质更具碱性，以便形 成 (M+H)+，或足够的极性去形成稳定的加和离子，如 (M+NH4)+;溶剂为弱酸性，可以给化合物提供足够的质子 : 而对于负离子检测模式，正相反，即样品必须比基质更具 酸性，以便形成 (M-H)- 或足够的极性去形成稳定的加和 离子，例如 (M+OAc)-;而溶剂最好带一点碱性 20?2012 Waters Corporation : ESI 响应随流速的增加而降低 100 APCI 喷雾的 ESI 50 相对强度 „纯? ESI 0 0.5 1.0 1.5 2.0 流速, mL/min : 对 ESI 接口来说，最佳工作流速，取决于离子源的设计 21?2012 Waters Corporation : High temperature heater — High temperature alloy element — Can operate up to 1080oC — 650oC required for optimal ESI operation : Optimal zone of desolvation — Balanced gas distribution — Vertical nebulizer positioning : Cone gas — Assist to desolvation — Keep the system clean 22?2012 Waters Corporation Heated Nebulizer source: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) corona discharge needle polar to unpolar and thermally stable compounds 23?2012 Waters Corporation 溶剂蒸气 样品蒸气 S S A A S A S S S S S A A A S : 液流被强迫通过一根窄的管路以使其得到高的线速度 : 高温加热器和喷雾器使液流在脱离管路时蒸发成气体 由于溶剂蒸汽的保护，样品分子较少受热裂解的影响，大量的热量 用于溶剂的蒸发，但是有时也会有热不稳定样品分解 24?2012 Waters Corporation 样品锥孔 H2O H3O+ 电晕放电区 H2O+ e- N2 H2O (等离子区) N2+ + N2+ N2 N2 H3O+ e- e- ++ N2 H2O+ N2+ + H2O 电晕放电针 + + 2-5 kV 25?2012 Waters Corporation : APCI : 电喷雾 – 溶液状态下离子化 – 气相离子化 – 反相或者正相 – 反相或者正相 – 离子化 – 离子化 探头不加热 加热探头 o o 探头尖端施以高电压 电晕针(放电针) o o – 流动相影响大 – 更少的基质干扰 – 极性化合物 – 弱极性化合物 – 热不稳定化合物 : 先带电，后汽化 : 先汽化，后带电 26?2012 Waters Corporation 基本功能: 将离子源产生的离子，尽可能多的引入质谱分析系统 : 尽可能地控制不带电的中性粒子进入质谱分析系统 : 设计基本思路: 在离子源与高真空质谱系统(采样锥)之间设置阻力，用“电” 来区分带电离子和中性粒子 27?2012 Waters Corporation : Dual orthogonal ion pathway ensures the ion source stays clean for longer LC inlet ionic species non-ionic species 28?2012 Waters Corporation Quadrupole Mass analyser 四级杆质量分析器 29?2012 Waters Corporation : Three types of voltages present on a Quadrupole: – RFp-p 射频电压– Fixed frequency (1 MHz) oscillating voltage (VAC Mass); establishes harmonic ion trajectories. – Filtering DC (FDC) 直流电压– DC voltage difference between poles (linear to RFp-p) that defines the resolution. – Rod Offset Voltage 四级杆两端电压– Low DC voltage that defines axial ion energy (velocity through quadrupole). 30?2012 Waters Corporation : RFonly – No FDC between poles; only RFp-p, Rod Offset present. – Quad. is in “Total Ion Mode” (transmitting all ions, not filtering). : RF + resolving DC – Allowing for mass selection 31?2012 Waters Corporation –+++ –– + + + + + ++ –– –– – – + + + + + + –+ ++–– 4. RF-voltagerepulsionquadrupoleattraction, respectively,repulsion 6. Ion of AC3. Electrical / of the ionandonly electrical2.pair enters the ionpolarity m/zofofthe nearest1. ... nges into direction to the5. Movement DCthe and pass allows into systemA cha the quadrupole.quadrupolerespectively,oppositedestabilized.charge + and attraction,Allwith them/z areionoppositenearest withandthe chargebetween rods between quadrupoleother rods and ion 32?2012 Waters Corporation + Ion energy spirals ions through the quadrupole. 33?2012 Waters Corporation Detector : Ions scanned by varying the DC/RF voltages across the quadrupole rods Two working modes: MS full scan Single ion scan 34?2012 Waters Corporation Multiple scan mode the QQQ system can give: : MS full scan – Ion scan mode using MS1 or MS2 : MS/MS – Product Ion Scan – MS1: ion selection mode MRM mode – MS2: ion scan mode MS2 : MRM – Multiple Reaction Monitoring MS1 – Both MS1 and MS2: ion selection mode : Precursor Ion Scan – MS1: ion scan mode – MS2: ion selection : Neutral Loss Scan – Both MS1 and MS2: ion scan mode, but with different mass defference : …… 35?2012 Waters Corporation Specific MS/MS Detection 定量分析的优秀工具 Urine Caffeine Retention Time Retention Time Detection by MS/MS Separate on HPLC 36?2012 Waters Corporation Single ion Single ion MRM 1 (321/152) 37?2012 Waters Corporation Single ion Single ion MRM 2 (321/257) 38?2012 Waters Corporation 2nd experiment 1st experiment m/z 3 m/z 3 ? Higher dwell time per m/z ? Higher selectivity ? Higher S/N m/z ratio m/z 2 m/z 2 m/z 1 m/z 1 Time 39?2012 Waters Corporation : MRM Dwell time = MRM time + Pause time : Cycle time = n (MRM time + Pause time), n: MRM的个数 : Num of LC acquisition data point per peak, m T-Wave Width of LC peak (sec) m= Ion processing time Cycle time : MRM time = tQ1 + tQ2 + tQ3 40?2012 Waters Corporation : Step-by-step method development – Literature search，查文献，初步确定实验方式、条件 – Sample Preparation，样品处理与准备 – Mass spectrometry (MS/MS)，建立MRM方法 – Liquid chromatography o Retention time definition，合适的目标化合物保留时间 o Method Optimization ? MS source parameters optimization，质谱源参数优化 ? tR of targeted compound Adjustment， 目标化合物保留时间调整 : Method Validation 方法验证 41?2012 Waters Corporation 仪器的及时清洗，非常重要 : 使用标准品建立方法后，马上清洗管路 – 用50% 乙腈或50%甲醇，Purge管路2次以上，喷针部分用LC流动相冲洗 : LC-MRM做完生物基质的样品后，LC需多冲些时间，使吸附到色谱柱 上的干扰物，如磷脂等完全洗脱下来。 : 使用过含添加剂(如甲酸、铵盐等)的流动相后，色谱柱，离子源都 要用不含添加剂的流动相冲洗，以延长仪器和色谱柱的寿命。 42?2012 Waters Corporation 43 ?2012 Waters Corporation