国标-》巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定

国标-》巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定 ICS 67(050X 04 N Y中华人民 共禾口 国农业行业标准 NY,T 939--2005 巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中 复原乳的鉴定 milk and in Identification of reconstituted UHT milkpasteurized 2005-09—30发布 2005一09—30实施 中华人民共和国农业部发布 NY,T 939—2005 刖 置 本标准的第4章为强制性条文，其余为推荐性条文。 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标 准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国 畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单 位:中国农业科学院畜牧研究所。本标准主要起草人:王加启、h登攀、魏宏阳、李树聪、于建国、郭宗辉、付宝华、周凌云、刘 世军、黄萌萌、刘光磊。 939—2005 NY,T 巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定 1范围 本标准规定了巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定和相应的检测方 法。本标准适用于巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定。 2 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方 研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB,T 5413(1婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定 GB,T 6682--1992分析实验室用水规格和试验方法 IS(3 5538:1987乳和乳制品取样品质检验 下列术语和定义适用3术语和定义 于本标准。 3(1 生乳rawmilk 从健康奶畜挤下的常乳，仅经过冷却，可能经过过滤，但未经过巴氏杀菌、低于巴氏杀菌的热处 理、净乳和其他的杀菌处理。 3(2 milk 复原乳reconstituted 炼乳或,和全脂乳粉与水勾兑成的原料乳。 3(3 巴氏杀菌pasteurilization 经低温长时间(62?,65?，保持30 rain)或经高温短时问(72?,76?，保持15 s;或 80?--85?，保持10 s,15 S)的处理方式。 3 4 超高温瞬时灭菌UHT 经135?以 上保持数秒的处理方式。 生乳经唧灭菌处理后，乳果糖含量应该低于 600mg,L。 4复原乳的鉴定 4(1巴氏杀菌乳 当巴氏杀菌乳每100 g蛋白质中糠氨酸含量大于12mg时，则鉴定为含有复原乳。 4(2 UHT灭菌乳 当1 rH，r灭菌乳发生下列情况之一时，则鉴定为含有复原乳: a)W一0(7×t>190: 式中: NY,T 939—2005 w——待测UHT灭菌乳样品中每100 g蛋白质中糠氨酸的含量，单位为毫克(mg); t——待测I TH，r灭菌乳贮存时间，单位为天(d); 0(7——待测UHT灭菌乳每贮存一天每100 g蛋白质中产生的糠氨酸量，单位为毫克(rng)。 b)当UHT灭菌结束时乳每100 g蛋白质中糠氨酸含量为140 mg,190 fng时，乳果糖含量 (mg,L)与糠氨酸含量(每100 g蛋白质所含毫克数)比值小于2。 5试验方法 5(1糠氨酸含量的测定 5 1(1原理 牛奶在加热过程中会发生梅拉德反应，使蛋白质和糖生成特定产物之一——糠氨酸(e—N一2一呋喃 甲基一L_赖氨酸)。糠氨酸的含量利用高效液相色谱紫外(280 nln)检测器测定，依据糠氨酸标准物质 定量。 5(1(2试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅用分析纯试剂和GB,I"6682--1992中一级水。 5(1(2(1甲醇(CH30H):色谱纯，用0(45 gm滤膜真空脱气过滤。 5(1(2(2高纯度氮气:99(99,。 5(1(2(3 3tool,L盐酸溶液。 5(1(2(4 10(6tool,L盐酸溶液。 5(1(2(5三氟乙酸(色谱纯)溶液:体积分数为0(1,。 5 1 2 mol,L6糠氨酸(furosine)(e—N一2一呋喃甲基一L_赖氨酸)标准贮备溶液:将糠氨酸标准物用3 盐酸溶液(5(1(2(3)配制成200$tg,mL的标准贮备液，该标准贮备溶液在一20?可贮存24个月。 5(1(2 7糠氨酸标准工作溶液:取0(1 mL标准贮备溶液(5(1(2(6)，用3 mol,L盐酸溶液 (5(1(2(3)定容至10mL，配制成2ttg,mL的糠氨酸标准工作溶液。 5(1(3仪器和设备 1 3 5 1检测实验室常用仪器设备。 5(1(3(2高效液相色谱仪，带有梯度系统，uV一检测器。 5 1 3 3凯氏定氮仪。 5(1 3 4 nag。 C18萃取柱，500 5 1 3 5硅胶色谱柱:颗粒大小5 btm，柱直径4(6toni，长250mm。 5(1 3 6干燥箱:110??2?。 5(1 3 7带螺盖耐热试管或者其他能够密封的耐热试管:容积为20 mL。 5(1(3(8注射器:10InL。 5(1(4采样 取代表样250n1L送往实验室，样品不应受到破坏或者在转运和贮藏期间发生变化。 采样参照ISO 5538:1987执行。 1 5 5分析步骤 5(1(5(1试样水解液的制备 吸取2(00mL试样，置于带密闭的耐热试管(5(1(3(7)中，加入6mL 的10(6mol,L盐酸溶液 min,2 min，密闭试管，然后将其置 (5(1(2(4)，混匀。向试管中缓慢通人高纯度氮气(5(1(2(2)1 于干燥箱(5(1(3(6)中，在110?下加热水解23 h-24h。加热约1 h后，轻轻摇动试管。 加热结束后，将试管从于燥箱中取出，冷却后干过滤，保留滤液供测定。 2 NY,T 939—2005 5 1(5 2试样水解液中蛋白质含量的测定 吸取2(00mL试样水解液(5(1(5(1)，按GB,T 5413(1测定试样溶液中蛋白质含量。 5 1(5(3试样水解液中糠氨酸含量的测定 5(1 5 3(1试样水解液的纯化 将C18萃取柱(5(1(3(4)安装在注射器上，先后分别用5mL甲 醇和10mL水润湿萃取柱，保 持萃取柱湿润状态。吸取0(500 n1L试样水解液于萃取柱，用注射器(5(1(3(8)缓慢推人C18萃取 mL。柱内。吸取3 mol,L盐酸溶液洗脱萃取柱中的样品至3 5(1(5(32 测定 a)色谱条件:C18硅胶色谱柱，250lTlln×4(6l'rlIn，5tan粒径，柱温 32?。 b)洗脱液:0(1,三氟乙酸溶液(5(1(2(5)为洗脱液A，甲醇(5(1(2(1)为洗 c)洗脱梯度:见表1。 脱液B。 表1洗脱梯度 时间 流量 洗脱液A 洗脱液B 序号 , ,rmn mL,min 1 1(oo 100(0 0(0 1(00 2 16 0086(813 2 3 16(50 1(50 100(0 O(0 1(00 0(0 4 30(00100(0 d)测定:利用洗脱液A和洗脱液B的混合液(50:50)，以1mL,min的流速平衡色谱系统。注 入20,uL--50止的3mol,L盐酸溶液平衡柱子，以检测溶剂的纯度。注入10止待测溶液测定糠氨酸 含量。每测定10个样品后测定一次标准工作溶液(5(1(2(7)，以校准仪器。糠氨酸的出峰时间应该 在8min,10min(参见附录A和附录B)。 5(1(6结果计算 糠氨酸含量以样品质量分数w计，数值以每100 g蛋白质中所含毫克数表示，按如下公式计算: w:地× 100(1) m 式中: w——样品中每100 g蛋白质中糠氨酸的含量，单位为毫克(mg); b——样品水解液中糠氨酸浓度，单位为微克每毫升(pg,mL); D m——样品水解液中蛋白质浓度，——测定时稀释倍数(D=6); 计算结果精确到小数点后一位。单位为毫克每毫升(mg,mL)。 5(1(7精密度 在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均 值的5,。 5 2乳果糖含量的测定 5(2(1原理 牛奶在加热处理过程中，部分乳糖异构为乳果糖，经0一n半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖， 通过酶法测定产生的果糖量计算牛乳中乳果糖含量。 5 2 2试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅用分析纯试剂和GB,T 6682--1992中一级水。 5(2 2(1碳酸氢钠(NaHCfh) 3 939—2005 NY,T 5 2 2 2过氧化氢(H202)，质量分数为30, 5(2(2(3辛醇(GH”0) 5(2(2(4灭菌水 5(2(2(5 300 g,L硫酸锌溶液 5(2(2( 6150 g,L亚铁氰化钾溶液 5 2 2(7 0(33 moVE氢氧化钠溶液(NaoH) 5 2，2(8 1 tool,L氢氧化钠溶液(NaOH) 5(2(2(9缓冲液A:pH=7(5 称4(8 g磷酸氢二钠(NazHP04)，0(86 g磷酸二氢钠(NaHzP04?H20)和0(1 g硫酸镁(MgS04?7H20)溶解于80mL水中，用1mol,L氢氧化钠溶液调整pH到7(5?0(1(20?)，稀释到 100mL，摇匀。 5 2 62(10缓冲液B:pH=7 称取14(00 g三乙醇胺[N(CH2CH20H)3HCl]和0(259硫酸镁(MgS04?7H20)溶解于80mL 水中。用1mol,L氢氧化钠溶液(5(2(2(8)调整pH到7(6?0(1(20?)，稀释到100mL，摇匀。 5 2 2(11缓冲液C 将40(0mL缓冲液B用水稀释到 100H1L，摇匀。5 2(2(12 p驴半乳糖苷酶悬浮液 用3(2mol,L硫酸铵溶液将活性为30[U,mg的B廿半乳糖苷酶(EC(3(2(1(23)制备成浓度为5 mg,mL的悬浮液。 5(2(2(13葡萄糖氧化酶悬浮液 用灭菌水将活性为200 mg,mL悬浮溶 IU,mg的葡萄糖氧化酶(EC(1(1(3(4)制备成浓度为20 液。 5(2(2(14过氧化氢酶悬浮液 用灭菌水将活性为65 000[U,mg的过氧化氢酶(EC(1(11(1(6)制备成浓度为20mg,mL的悬 浮液。 2 5 2(15己糖激酶,葡萄糖奇磷酸脱氢酶悬浮液 在1mL浓度为3(2mol,L硫酸铵溶液中加入2nag活性为140IU,mg的己糖激酶(EC(2(7(1(1) 和1mg活性为140IU,mg的葡萄糖_6一磷酸脱氢酶(EC(1(11(1(6)，轻摇均匀，成悬浮液。 2 5 2 16磷酸葡萄糖异构酶悬浮液 用3(2mol,L硫酸铵溶液将活性为350IU,mg的磷酸葡萄糖异构 酶(EC(5(3(1(9)制备成浓度 为2ml{g,mL的悬浮液。 5 2(2 17 ATP溶液 将50m95’一ATP-Na2和50 rng碳酸氢钠(5(2(2(1)溶于1lnL水中。 5(2(2 18 NADP溶液 将10 nag G—NADP—Na2溶于1 mL水中。 5 2 3仪器和设备 5 2 3(1检测实验室常用仪器设备。 3 5 2 2水浴或干燥箱:温度能维持在40??2?。 5(2(3(3分光光度计，能在340m波长处检测。 5(2(4采样 同5(1(4。 d NY,T 939—2005 5(2(5分析步骤 5 2 5 1试液制备 量取50(0mL样品到100mL容量瓶中，用水稀释 到刻度后混匀。2 5 5 2纯化 吸取10(0 mL试液(5(2(5(1)于50 n1L锥形瓶中，依次加入1(75 mL亚铁氰化钾溶液 (5(2(2(6)、1(75mL硫酸锌溶液(5(2(2(5)和6(51nL缓冲液A(5(2(2(9)。每加入一种溶液后， 充分振荡均匀。全部溶液加完后，静置10min，过滤，弃去最初的1 mL--2mL滤液，收集滤液。5(2(5(3水解乳糖和乳果糖 吸取5(00n1L滤液于10n1L容量瓶中，加入50止的pn半乳糖苷酶悬浮液(5(2(2(12)，混匀 h。 后加盖。在40?水浴或干燥箱培养至少10 5(2(5(4葡萄糖氧化 依次加入2(0InL缓冲液C(5(2(2(11)、100,uL葡萄糖氧化酶悬浮液 (5(2(2(13)、1滴辛醇 (5(2(2(3)、0(5mL浓度为0(33mol,L氢氧化钠溶液(5(2(2(7)、50 p(L过氧化氢(5(2(2(2)和0(1mL过氧化氢酶悬浮液(5(2(2(14)，每加入一种试剂均要摇匀。全部溶液加完后，在40?水浴或干 燥箱中培养3 h。冷却后稀释至10n1L，过滤，弃去最初的1mL--2mI，滤液，收集滤液。5 2 5 5空白 依照5(2(5(1到5(2(5(4步骤处理空白溶液，但不加pD半乳糖苷酶悬浮液(5(2(2(12) 。5(2(5(6测定 测定 步骤见表2。 表2测定步骤 步 骤 空白 样品 比色皿中依次加入: 1(00mL 1(00 rnL 缓冲液B(5(2(2(10) ATP溶液(5(2(2(17) 0(100r11L O 100mL NADP溶液(5(2(2(18) 0(100mL 0(100mL 滤液(5(2(5 4) 1(00mL 1(00mL 水 1(00mL 1(00mL混合均匀后，静置3min 20 ul 20“l 加人己糖激酶,葡萄糖一6一磷酸脱氢酶悬浮液(5(2(2(15) 混合均匀，等反应停止后(约10min)，记录吸光值 AM Ad 20“l 20“l 加人磷酸葡萄糖异构酶悬浮液(5(2(2(16) 混合均匀，等反应停止后(10min 15min)，记录吸光值 A, AM 注1:以上反应均在同一比色皿中完成。 注2:如果1 rnL滤液吸光值增加超过1(3，则减少样品滤液取样体积，注意增加水以保证比色皿中反应液总体积不 变。 5(2 6结果计算 5(2 6(1吸光值差 样品吸光 值差?A。的计算 AA。=(As2一A。1) 空白吸光值差?Ab的计算 NY,T 939—2005 (3)?Ab=(Ab2一Abl) 样品净吸光值差?AL的计算: (4)?AL=?A。一?Ab 5 2 6 2乳果糖含量 乳果糖的含量以样品的质量浓度c计，数值以毫克每升(mg,L)表示，按下列公式计算 。=笺Xd 嵩裂×X。e (5) 一—。 V×幽L b式中: ?AL——样品净吸光值差; ML——乳果糖的 摩尔质量(342(3g,t001); ,——NAl)P}I在340 nl'n处的摩尔吸光值(6(3 L?mmol_1?clq'l_1); mL;v1——比色皿液体总体积，Vl=3(240 ,——比色皿中滤液的体积，v2=1(00mL; cm; v—d——比色皿光通路长度，d=1(00 —测试样体积(L)。 计算结果精确到小数点后一位。 5 2(7精密度 在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平 均值的5,。 6 NY,T 939—-2005 (资料性附附录A 糠氨酸标准物的分离录) 图谱 注:横轴表示保留时间，单位为分钟(Edn);纵轴表示吸光度(AU);峰1表示糠氨酸峰。 7 NY,T 939—2005 附录B {资料性附录) 巴氏杀菌乳样品中糠氨酸的分离图谱 注:横轴表示保留时间，单位为分钟(rain);纵轴表示吸光度(AU);峰1表示糠氨酸峰。 8