四、酶的提取技术
1、酶提取的
方法
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(1)盐析法盐析常用的中性盐有Mgso4、(NH4)2SO4和NaH2SO4和NaH2SO4,其盐析蛋白酶的能力因蛋白酶种类而不同,一般以含有阴离子的中性盐盐析效果较好。但是由于(NH4)2SO4的溶解度在低温也相当高,故在生产上普遍应用(NH4)2SO4。一般使各种酶盐析的剂量通过实验来确定。
以中性盐盐析蛋白酶时,酶蛋白溶液的PH值对盐析的影响不大。在高盐溶液中,温度高时酶蛋白的溶解度低,故盐析时除非酶不耐热,一般不需要降低温度。如酶蛋白不耐热,一般需冷却至30℃盐析。
同一中性盐溶液对不同的酶或蛋白质的溶解能力是不同的,利用这一性质,在酶液中先后添加不同浓度的中性盐,就可以将其中所含的不同的酶或蛋白质分别盐析出来,这就是分步盐析法。分步盐析是一种简单而有效的酶纯化技术,采用此法分离不同的酶或蛋白质,必须先通过实验求出液体中各种酶或蛋白质的浓度与盐析剂浓度有的关系。
盐析法的优点:不会使酶失活;沉淀中夹带的蛋白质种类杂质少;沉淀物在室温长时间放置不易失活,缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。盐析法常作为从液体中提取酶的初始分离手段。
用盐析法沉淀的沉淀颗粒相对密度较小,而母液的相对密度较大,故用离心分离法分离时分离速度慢。
(2)有机溶剂沉淀发有机溶剂蛋白质的机理目前还不十分清
楚。各种有机溶剂沉淀蛋白质的能力因蛋白质种类而异。乙醇沉淀蛋白质的能力虽不是最强,但因挥发损失相对较少,价格也较便宜,所有工业上常以作为沉淀剂。有机溶剂沉淀蛋白质的能力受溶解盐类、温度和PH值等因素的影响。分部有机溶剂沉淀法也可以用来分离酶和蛋白质,但其效果不如分部盐析法好。
按照食品工业用酶的国际法规,食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶,但不允许混入多量水溶性无机盐类(食盐等例外),所以有机溶剂沉淀法的好处是不会引入水溶性无机盐等杂质,而引入的有机溶剂最后在酶制剂干燥过程中会挥发掉。由于具有此种特点,此法在食品级酶制剂提取中占有极重要的地位。又由于它不需要脱盐,操作步骤少,过程简单,收率高,国外食品工业用的粉剂酶如霉菌的淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶和纤维素酶等都是用有机溶剂一次沉淀法制造的。
为了节省有机溶剂的用量,一般在添加有机溶剂前先将酶液减压浓缩到原体积的40%~50%。有机溶剂的添加量,按照小型实验测定的沉淀曲线来确定。要避免过量,否则会使更多色素、糊精及其他杂质沉淀。
除以上两种方法外,还有单宁沉淀法、吸附法等提取方法,此外还有酶的精制技术等。
2、酶提取的过程
(1)发酵液预处理如果目的酶是胞外酶,在发酵液中加入适当的絮凝剂或凝固剂并进行搅拌,然后通过分离(如用离心沉降分离
机、转鼓真空吸滤机和板框过滤机等)除去絮凝物或凝固物,以取得清的酶液。如果目的酶是胞外酶,先把发酵液中的菌体分离出来,并使其破碎,将目的酶抽提至液相中,以取得澄清酶液。
(2)酶的沉淀或吸附用合适的沉淀方法,如盐析法、有机溶剂沉淀法、单宁沉淀法的那个,使酶沉淀,或者用白土或活性氧化铝吸附酶,再进行解析,以达到分离酶的目的。
(3)酶的干燥收集沉淀的酶进行干燥磨粉,并加入适当的稳定剂、填充剂等制成酶制剂;或在酶液中加入适当的稳定剂、填充剂,直接进行喷雾干燥。
浙公网安备 33021202002483