蛋白双向2D-WB 电泳实验服务
实验技术:2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离,然后将凝胶蛋白转印至支持膜上,再通过抗体杂交显色。2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化,在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用;而2D-WB结合质谱鉴定技术,可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。[晶莱生物]
实验操作流程:
1、第一项电泳(IEF),胶条平衡,第二项电泳SDS-APGE。
2、第二项电泳结束后,取出凝胶进行转膜,转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。
3、封闭, 5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时(室温)或过夜(4度)。
4、一抗孵育,根据抗体说明
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选择孵育时间,常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜,一抗孵育后取出膜TBST洗涤3次,每次5分钟。
5、二抗孵育:根据一抗选择合适的二抗(抗鼠、抗人、抗兔等),室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次,每次5分钟。
6、显影:将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上,暗室中将胶片置于膜上,盖上压片夹,曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影,直到出现清晰的蛋白质条带,清水漂洗一下后在定影液中定影,曝光时间需综合考虑蛋白质的上样量,抗体稀释浓度,抗体孵育时间等因素。
7、定影后,清洗胶片,晾干,标定marker,扫描图片和2D Western blot图片分析。
一、2D Western blot
2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离,然后将凝胶蛋白转印至支持膜上,再通过抗体杂交显色。2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化,在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用;而2D-WB结合质谱鉴定技术,可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。
二、2D Western blot技术服务内容
1、蛋白质抽提与定量;
2、双向电泳;
3、转膜,封闭,孵育,显示成像。
三、送样须知,为了保证2D Western blot技术服务能顺利进行,样品寄送需满足以下要求:
顾客提供:组织、细胞、蛋白质溶液等;一抗(如果公司抗体库里没有)。
运输要求:干冰或液氮包装寄送,广州本地客户可上门收样。
注:样本应避免各类污染和反复冻融。
四、2D Western blot技术服务
报告
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内容
1、蛋白质定量结果及电泳上样量;
2、原始胶片、电子图片及图片分析结果;
3、2D Western blot完整的实验报告,包括实验步骤、使用仪器和试剂等。
附:2D Western blot实验步骤
1、2D Western blot蛋白质样本制备,制备的主要原则是尽可能溶解全部蛋白质,破坏蛋白
质与蛋白质间的相互作用,避免各类干扰物质,样品制备与IEF兼容等。
2、双向电泳的主要步骤,第一项电(IEF),胶条平衡,第二项电泳SDS-APGE。
3、第二项电泳结束后,取出凝胶进行转膜,转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。
4、封闭, 5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时(室温)或过夜(4度)。
5、一抗孵育,根据抗体说明书选择孵育时间,常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜,一抗孵育后取出膜TBST洗涤3次,每次5分钟。
6、二抗孵育:根据一抗选择合适的二抗(抗鼠、抗人、抗兔等),室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次,每次5分钟。
7、显影:将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上,暗室中将胶片置于膜上,盖上压片夹,曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影,直到出现清晰的蛋白质条带,清水漂洗一下后在定影液中定影,曝光时间需综合考虑蛋白质的上样量,抗体稀释浓度,抗体孵育时间等因素。
8、定影后,清洗胶片,晾干,标定marker,扫描图片和2D Western blot图片分析。
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