HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯

HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯 ()第 47 卷 第 4 期147 14 理学版 武汉大学学报 V o lN o () . . . . . . 2001, 468, 4702001 年 8 月JW uh an U n ivN a tSc iE d A ug () 文章编号: 025329888 20010420468203 Ξ4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯HCV N S 0 王晓玲, 叶林柏, 郜金荣, 徐进平, 吴正辉 ()武汉大学 病毒研究所, 湖北 武汉 430072 摘 要: 应用 PCR MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1714157403986_1扩增出人丙型肝炎病毒全长 N S 4 基因的 DN A 片段, 克隆入表达载体 pQ E 32 并转化 3 . 经 诱导表达出 42×10蛋白 1 利用22纯化得到纯化产物,2鉴定该 109, Ecol i JM IP T G N iN TA aga ro se W e ste rnb lo t 蛋白能够与抗 的单克隆抗体发生特异性反应 14 N S 关 键 词: 丙型肝炎病毒; 4 蛋白; 表达; 纯化N S 中图分类号: 78 文献标识码: Q A () 及大肠杆菌 基因的质粒 25 5、109丙 型 肝 炎 病 毒 于 1989 年 被 首 次 分 pB lu e B acD H ΑJM H CV 1为本室保存 1 克隆有 单克隆抗体基因的质粒 4 , 它是引起全球约 70% 非甲非乙型肝炎的主要N S离 及其宿主大肠杆菌菌株 、碱性磷酸 62151病 原 因 子 1属 于 黄 病 毒 科, 基 因 组 为 正 链 E FA B HB H CV 酶标记的山羊抗人 抗体由 教授惠 . 全长 9. 5 , 只有一个开放阅读框, 编码一个 , IgG PGa llin a r i RN A k b 赠 12载体购自华美公司 1 各种限制性内切约3 000 个氨基酸的聚蛋白前体1基因组5 ’和 3 ’两 pU Cm T () 酶、连 接 酶、酶 为 、 4 侧各有一个非翻译区 , 1T DN A T a q P rom ega G IBCO U n t ran sla ted reg io n U T R 、公司及上海生工公司产品 1金属离 聚蛋白前体在宿主及病毒自身蛋白酶的作用下, 被 BRL B io sta r N i 子鳌合层析柱为 公司产品 1切割产生多种功能蛋白, 包括结构蛋白: 核衣壳蛋白 In v it ro gen 1. 2 方 法囊 膜 糖 蛋 白 和 以 及 非 结 构 蛋 白 、, 1 2, 7Co reE E P 2 1. 2. 1 、、、、和 1PCR 扩增 234455N SN SN SA N SBN SA N SB 根据已公开报道的人丙型肝炎病毒 核酸蛋白可以在 蛋白酶作用下水解产生 4 3 H CV N SN S 3 3 2 序列, 设计了一对引物, 1: 5’、大小分别是 8×10和 27×101 现 44, P GGT A CC A A G C T T N SA N SB 3’; 2: 5’有资料表明 可以和 蛋白结合促进 43 3C TA TA T CCA GT C C P GA G C T C GGA N SA N SN S 3 3 ’1 以 质 粒 T CC A TA C GC T GC A C G G pB lu e 的蛋白酶活性, 这种结合是否有另外的生物学意 25 为模板进行 循环: 94 ??1 , 52 1义还需探讨 1 另外, 4 相对于其他非结构蛋白在 B acPCR C m in C N S 病毒进化上较为保守, 是 三代诊断试剂盒中 H CV , 72 ?个循环后 72 ?延伸 7 11. 5 , 30 m in C m in C m in 1. 2. 2 的主要抗原, 最近研究发现 N S4 蛋白上有 2 个主要4 的克隆及表达载体 2的构建 4 N S pQ E N S 4的强抗原表位 按照华美公司 载体使用说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行 1 经过 4 T 1 成功地克隆、表达了全长的 N S 蓝白斑筛选出白色菌落, 碱裂解提取质粒, 酶切鉴定 基因, 通过柱层析获得纯化的 蛋白, 为深入开4 N S 展对 的生物功能研究奠定了坚实基础 1阳性克隆 1 用低熔点琼脂糖回收 和 4 I N SB am H H in d ? 双酶切小片段, 即全长 4 基因, 插入载体质粒 N S 的多克隆位点, 从而构建含全长 4 基因 32 pQ E N S 1 材料与方法 的重组表达质粒 214pQ E N S 1. 1 实验材料1. 2. 3 2在大肠杆菌中的表达及纯化 4 N SpQ E 全长 蛋白的表达参照文献 5 4 全部非结构蛋白表达载体 含有 N S 进行 1 纯化 32, pQ E H CV Ξ 收稿日期: 2000207210 0 通讯联系人 ( ) 作者简介: 王晓玲 19752, 女, 硕士生, 现从事分子生物学研究 1 过程按照 N i2N TA 层析柱的使用说明书进行 1 2Y T 培养液中培养过夜, 然后以 1?20 转种, 37 ?C 1. 2. 4 培养 2 后加入 诱导 5 , 2检查结 2和2 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 h IP T G h SD SPA GE SD SPA GE W e ste rn b lo t 3 果如图 2 所示, 表达的 蛋白分子量约 42×10, 4 2分 析 按 常 规 方 法 进 行, 确 定 全 长 N SSD SPA GE 3 ( 蛋 白 由 260 20 ƒ24 与细菌本身的 42×10蛋白带刚好相重合, 在 N SIM A C mm o lL T r isH C lIP T G 3 ) 咪唑洗脱下 pH 8. 0, 0. 5 m o lƒL N aC l, 60 mm o lƒL 诱导后, 42×10的蛋白表达量略有增加, 并且能和 ( 单 克 隆 抗 体 呈 强 烈 的 特 异 性 反 应 如 图 3 所 4 来 1 收集洗脱液, 用 30% 硫酸铵沉淀, 即为纯化产 N S 3 ) 物 1 将诱导表达的 的菌体以及纯 109 4 示, 而 对照菌中的 42 ×10的带不但在含109 JM PQ EN SJM 化 的 蛋 白 进 行 2分 析 12 4 量上相比较低, 而且不能和 N S4 抗体反应, 充分表N SW e ste rn b lo t W e ste rn 按照常规方法进行, 针对 蛋白的可溶性单明 的 4 基因已经在重组质粒转化的菌株 4 b lo t N S H CV N S 中得到表达 1 由于表达出的 蛋白 末端含 6 4 克隆抗体的制备按照文献 6 进行 1 所用一抗为上N SN 个 连 续 的 组 氨 酸, 可 以 用 2柱 层 析 提 纯,述制备的单抗, 二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗人N iN TA 抗体, 以 底物显色 1ƒ90% 左右的细菌蛋白上柱时不能被吸附而直接流IgG N B T BC IP 出 1残存于柱中的少量细菌蛋白被 220 洗出, IM A C 4 蛋白则被 260 洗脱下来, 从而获得提 纯 N SIM A C 2 结果 的 蛋白 1 如图 2 所示, 2电泳检查为 4 N SSD SPA GE 3 2. 1 一条分子量为 42 ×10的带, 即全长的 蛋白 14 N S 4 基因的 PCR N S 2分析表明, 该带可以与抗 的单克 4 产物经琼脂糖凝胶电泳检查只有一条清W e ste rn b lo t N SPCR 晰的扩增带, 如图 1 所示, 大小约 1. 1 , 与预期大k b 隆抗体发生特异性反应 1 小相符, 未见非特异扩增带 1 图 1 扩增及重组质粒 2的鉴定 4 PCR pQ E N S ) 1ΚDN A ƒH ind? + E coR I 分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 图 22在 菌株中的表达及纯化 4 109 pQ E N SJM ) 2pQ E 2N S4 经 B am H 和 H ind 消化?I ) ) 1蛋白质分子量标准; 2含有 2重组质粒的 菌 4 109 pQ E N SJM ) ) 32经 消化 44 产物4 I pQ E N SB am H N SPCR ) ) 体 未 经 诱 导; 3含 有 的 菌 体 对 照; 4含 有30 109 IP T G pQ E JM 表达载体 - 的构建4 pQENS2. 2 ) 2重组质粒的 菌体经 诱导; 54 纯化产物4 109 pQ E N SJM IP T G N S 4 基因连入 2载体后, 用限制性内切N S pU C T 酶 和 消化, 用低熔点琼脂糖回收,I ? B am H H in d ( ) 再 与 经 过 同 样 消 化 的 表 达 载 体32 3. 4 pQ E k b 片段连接后转化 菌株, 筛选转化后的 109 DN A JM 菌落, 提取质粒 进 行 酶 切 鉴 定, 24 质DN A pQ E N S 粒 分 别 以 I 单 酶 消 化, I 和DN A B am H B am H () 双酶消化, 获得 4. 5、3. 4+ 1. 1的? H in d k b DN A () 片段, 与预期结果相符 参见图 1, 说明全长的 4N S 的 已 经 正 确 克 隆 到 了 载 体 质 粒 32 DN A pQ E L a c 图 3 全长 N S4 的W e ste rn b lo t 鉴定 启动子下的多克隆位点中 1) ) 14 纯化产物; 2含有 2重组质粒的 菌体 4 109 N SpQ E N SJM 2. 3 全长 蛋白的表达、纯化和鉴定4 NS) 经 诱导; 3含有 的 菌体32 109 IP T G pQ E JM () 重 组 质 粒 转 化 的 2菌 株 在109 4 JM pQ E N S 361. . 2 C la rk e BM o lecu la r V iro lo gy o f H ep a t it is C V iru s 讨论3 [. , 1997, 78: 239722410.J J G en V irol 3 , , , e t a l. T an ji Y H ijik a ta M Sa to h SH ep a t it is C 目前对于 非结构蛋白 的生物学功能4 H CV N S 24V iru sE nco ded N o n st ruc tu ra l P ro te in N SA H a s 在病毒复制及的认识还非常贫乏 1 资料显示 4 N SA[. V e r sa t ile F unc t io n s in V ira l P ro te in P ro ce ssing J J 多聚蛋白翻译后加工过程中起着十分重要的作用, , 1995, 69: 157521581.V irol 它能够充当 蛋白酶的辅助因子, 增加其切割特 3 N S, , , e t a l. C h ang J C Se ide l C O fen lo ch B A n t igen ic 4 异性并提高 蛋白酶的切割效率, 产生各种功能3 N S 4 H e te ro gene ity o f th e H ep a t it is C V iru s N SP ro te in a s 3[. , 1999,蛋白 M o de led W ith Syn th e t ic P ep t ide sJ V irology 1 最新研究显示 可与非结构蛋白 43 N SA N S7 257: 1772190. 和 在 细 胞 内 形 成 复 合 物, 与 2545 N SB N SB N SA 8 , , . Sam b roo k J F r ish E F M an ia t t is TM olecu la r 5 形成对非离子去污剂稳定的复合体, 暗示 参4 N S : [. : C lon ing a L abora tory M anu a l M N ew Yo rkCo ld 蛋白与了病毒多种生命事件 1 另外 在 4 5 N SN SA91989. Sp r ing H a rbo r L abo ra te ry P re ss, 的成熟过程中发挥着重要作用 , 可能与 的5N SA 6 E spo sito G, M o rea V , Sca r se lli E , e t a l. R ecom b inan t 超磷酸化有关, 并且有可能参与形成复制复合体 1 H um an A n t ibo d ie s Sp ec if ic fo r H ep a t it is C V iru s 在黄病毒中, 4 参与病毒 复制在膜上 N SRN A 2610. 1997, 142: 601P ro te in s[J . A rch V irol, 起始的过程, 黄病毒的 蛋白可固定在膜上, 与4 N S 7 Ish ido S, F u jita T , H o t ta H , e t a l. Com p lex 结 合 于 模 板 上 的 蛋 白 相 互 作 用, 因 而 使 由 RN A 53 4Fo rm a t io n o f N SB W ith N Sand N SA P ro te in s o f 模板及其结合蛋白组成的复制复合物固定在 RN A [ . ,H ep a t it is C V iru s J B ioch em B iop hy R es C om 膜上 1蛋白与黄病毒的蛋白相似, 是 4 4 H CV N SN S1998, 244: 35240. , , . e t a l. 8 L in C W u J W H siao KT h e H ep a t it is C 否也参与 的复制起始还缺乏实验证据 1H CV RN A 10 4: 4V iru s N SA P ro te inIn te rac t io n W ith th e N SB and N S4B 在细胞内的 亚 定 位 实 验 显 示, N S4B 呈 点 N S5A P ro te in s [J . J V irol, 1997, 71: 646526471. 状散布在细胞质中, 暗示 可能与介导胞吐作 4N SB 9 A sabe S I, T an ji Y , Sa to h S, e t a l. 2T h e N te rm ina l 用或胞吞作用形成泡状结构有关 1 表达并提纯了 25R eg io n o f H ep a t it is C V iru sE nco ded N SA is 蛋白对于进一步开展 的生物学功能研究 4 4 N SN S42[ .Im po r tan t fo r N SA D ep enden t P ho sp ho ry la t io n J 是十分必要的 1 2796. 1997, 71: 790, J V irol 10 K im J L , So ng W K , C h ung K M , e t a l. Subce lluba r 参考文献: L o ca liza t io n o f H ep a t it is C V ira l P ro te in s in 1 Iso la t io n o f a cDN A C hoo L , Kao G, A m y J , e t a l. [ . , 1999, 144: 3292M amm a lian C e lls J A rch V irol 222, C lo ne D e r ived F rom a B loo dbo rne N o nA N o nB 343. [. , 1989, 244: 3592V ira l H ep a t it is Genom e J S c ience -4 Expre ss ion of the FullL en g th HCV N S Gen e in E sch e r ich ia co l i an d Pur if ica t ion of the Pro te in W A NG X ia o- l in g, Y E L in - ba i, GAO J in - ron g, XU J in - p in g, W U Zhen g- hu i ( ), , 430072, , In st itu te o f V iro lo gyW uh an U n ive r sityW uh an H ube iC h ina 24 . : A bstra c tA fu lllen g th H CV N S gen e w a s o b ta in ed b y PCR m e tho dT h e DN A f ragm en t w a s c lo n ed . 32 109 . in to exp re ssin g vec to r pQ E an d th e recom b in an t p la sm id w a s t ran sfo rm ed to Ecol i JM st ra in3 , 4 42×10. .In du ced b y IP T G th e N S gen e w a s exp re ssed in to a p ro te in w ith m o lecu la r w e igh t o f in Ecol i 222SD SPA GE p ro ved th a t th e p ro te in w a s p u r if ied to hom o gen e sis b y N iN TA aga ro se co lum n . 24 ch rom a to g rap h yW e ste rn b lo t show ed th a t th e p ro te in co u ld reac t st ro n g ly w ith sp ec if ic an t iN S .m o no c lo n a l an t ibo dy : ; 4 ; ; Key word sH CV N Sp ro te inexp re ssio np u r if ica t io n