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生物竞赛之生物技术专题生物技术(生物竞赛) 一.凝胶过滤层析 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法,主要是根据蛋白质的大小和形状,即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析(molecular-exclusion chromatography)。一种利用带孔凝胶珠作基质,按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先...

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生物技术(生物竞赛) 一.凝胶过滤层析 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,主要是根据蛋白质的大小和形状,即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析(molecular-exclusion chromatography)。一种利用带孔凝胶珠作基质,按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来,小分子后流出来。 应用 ⑴脱盐:高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析法除去,这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15,样品体积可达柱床体积的25%-30%,为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡,然后加入样品,再用同样缓冲液洗脱,收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。 ⑵用于分离提纯:凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力,可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。 ⑶测定高分子物质的分子量:用一系列已知分子量的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析,记录每一分钟成分的洗脱体积,并以洗脱体积对分子量的对数作图,在一定分子量范围内可得一直线,即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时,可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后,根据物质的洗脱体积,在标准曲线上查出它的的分子量。 ⑷高分子溶液的浓缩:通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中,这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中,而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外,再经离心或过滤,将溶胀的凝胶分离出去,就得到了浓缩的高分子溶液 二.透析 通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理,将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 三.超过滤 一种以压力差为推动力,按粒径选择分离溶液中所含的微粒和大分子的膜分离操作。超过滤将液体混合物分成滤液和浓缩液两部分:滤液为溶液或在其中含有粒径较小的微粒的悬浮液;浓缩液中保留原料液中所有较大的微粒。 四.凝胶电泳 凝胶电泳,被科学工作者(如大小、形状、等电点等)的分子。凝胶电泳通常用于 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 用途,但也可以作为制备技术,在采用某些方法(如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹)检测之前部分提纯分子。可脉冲电场凝胶电泳。 凝胶电泳的原理比较简单。当一种分子被放置在电场当中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极,这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说 ,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质,如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等,从而降低了对流运动,故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数,因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异,以及所带的净电荷的多少,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态,从这种意义上讲,DNA和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子。因此,当核酸分子被放置电场中时,它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架 结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因而它们能以同样的速 度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 琼脂糖 ( Agarose ) 是一种线性多糖聚合物 , 系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的 电泳介 质 , 其密 度是由 琼脂 糖的浓 度决 定的。经过化学修饰的低熔点 (LMP) 的琼脂糖 , 在结构上比较脆弱 , 因此在较低的温度下便会熔化 , 可用于DNA片段的制备电泳。 聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式 : 一是用于分离和纯化双链 D N A 片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶。在未变凝胶中分离 D N A 的缺 点是 D N A 的 迁移 率受碱 基组 成和序 列的 影响。由于无法得知未知 D N A 的迁移是 否反 常 , 故不能用未变性的聚丙烯酰胺凝胶 电泳 确定双链 D N A 的大小。二是用于分离及纯化 单链 D N A 片 段的 变性聚 丙烯 酰胺凝 胶。这 类聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂 ( 尿素或甲酰胺 ) 的存在下聚合而成 , 变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关 , 故可用于分离及纯化单链DNA片段和DNA测序等。 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: DNA的分子大小  线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。 琼脂糖浓度  一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 DNA分子的构象  DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 电源电压  在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。 嵌入染料的存在  荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。 离子强度影响  电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。 五.等点聚焦(IEP) 利用特殊的一种缓冲液(两性电解质)在凝胶(常用聚丙烯酰胺凝胶)内制造一个pH梯度,电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点(pI)的pH处(此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷),形成一个很窄的区带。 在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pl)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带。 pH梯度的组成方式有二种,一种是人工pH梯度,由于其不稳定,重复性差,现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端引入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在负极端引入碱液,如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH相等,用pH0表示。电泳开始后,混合物中pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1,这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2>pI1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度。 理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导,前者保证pH梯度的稳定,后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小,易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开,而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。 pH梯度制作利用的两性电解质(ampholyte,商品名为ampholine),是脂肪族多胺和多羧类的同系物,他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下,自然形成pH梯度。 凝胶可用:聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等 六.离子交换层析 离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 七.亲和层析 将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液, 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来,这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。 八.凝胶过滤测相对分子质量 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术,同时也是常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。本实验采用的交联葡聚糖凝胶SephadexG—75的分级范围是3000~80000,相对分子质量在此范围内的蛋白质和其他大分子能够用这种凝胶分离开。当蛋白质溶液加到层析柱上端并用洗脱剂进行洗脱是,相对分子质量大的蛋白质进入凝胶网孔程度小,所受阻力校,先从层析柱中被洗脱下来:相对分子质量小的蛋白质进入凝胶网孔的程度大,后被洗脱。从样品上柱开始到某种分子被洗脱下来为止的洗脱液体积称为该分子的洗脱体积(Ve),在层析条件完全相同的情况下,Ve与相对分子质量的对数(logM)之间存在线性关系。在测定目标蛋白质相对分子质量之前,先测定几种已知相对分子质量的标准蛋白的洗脱体积Ve,以logM对Ve作图将得到标准曲线。在同样的条件下测定样品蛋白的Ve,从标准曲线上即可求得相对分子质量。 实验步骤 1.凝胶溶胀  根据层析柱体积确定凝胶的用量,称取SephadexG—75干粉,加过量蒸馏水室温充分膨胀一天,或沸水浴中溶胀3h。溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒,最后凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。  2.装柱与平衡  将层析柱垂直固定,连接好底部流出导管,加入缓冲液排除底部空气,关闭出口。将凝胶上面过多的溶液倾出,调节凝胶稠度在70%左右,沿玻棒往层析柱中加入凝胶基质,让其自然沉淀形成柱床,沉降后的凝胶床面应距离层析柱的顶端5cm左右,连接洗脱缓冲液、恒流泵与层析柱上端。用2~3倍柱体积的洗脱液通过层析柱使柱床平衡,流速控制在0.5mL/min左右。凝胶上端保持一段液体以防床面被冲坏。 3.上样与洗脱  将标准蛋白质和待测样品浓度控制在2~10mg/mL。先打了柱的出口,待柱中液面流至与床面平齐时关闭出口,用移液器将0.5mL样品慢慢加入柱床表面,应避免将床面冲起,当样品正好完全流入床中时立刻关闭出口。按加样操作加入洗脱剂,加满后拧紧上口螺丝帽,连通恒流泵,调好流速,以0.6mL/min左右的流速进行洗脱。  4.收集与测定  用自动部分收集器收集洗出液,并用电脑软件记录层析曲线,曲线中吸收峰最高点对应的横坐标为洗脱体积Ve。分别测定四种已知相对分子质量标准蛋白质的洗脱体积Ve,以相对分子质量对数logM对Ve作图,得到标准曲线,并求出回归方程。将待测蛋白质的洗脱体积Ve代入回归方程计算其相对分子质量。  5.凝胶柱的再生处理 实验结果 9.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测相对分子质量 实验原理 SDS-PAGE电泳法,即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 1.在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),SDS是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质),使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 3. 当蛋白质的分子量在15000~200000之间时,电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系,符合下列方程: 1gMr =K―bmR 式中:Mr为蛋白质的分子量;K为常数;b为斜率;mR为相对迁移率。在条件一定时,b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 仪器、原料和试剂 仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅,染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。 原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。 试剂: (1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH8.9):取1mol/L盐酸48mL,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。 (2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH6.7):取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。 (3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同,称丙烯酰胺(Acr) 30g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,溶于重蒸水中,最后定容至100ml,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃保存。 (4)10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g,溶于重蒸水中,最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃贮存。 (5)10%SDS溶液:SDS在低温易析出结晶,用前微热,使其完全溶解。 (6)1%TEMED; (7)10%过硫酸铵(AP):现用现配。 (8)电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3):称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。 (9)样品溶解液:取SDS 100mg,巯基乙醇0.1mL,甘油1mL,溴酚蓝2mg,0.2mol/L,pH7.2磷酸缓冲液0.5mL,加重蒸水至10mL(遇液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解标准蛋白质及待测固体。 (10)染色液:0.25g考马斯亮蓝G-250,加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 (11)脱色液:75mL冰乙酸,875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。 实验步骤 1.安装夹心式垂直板电泳槽:目前,夹心式垂直板电泳槽有很多型号,虽然设置略有不同,但主要结构相同,且操作简单,不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意:安装前,胶条、玻板、槽子都要洁净干燥;勿用手接触灌胶面的玻璃。 2.配胶:根据所测蛋白质分子量范围,选择适宜的分离胶浓度。 3.制备凝胶板: (1)分离胶制备:按表配制20ml 10%分离胶,混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内,约8cm高,用1ml注射器取少许蒸馏水,沿长玻璃板板壁缓慢注入,约3—4mm高,以进行水封。约30min后,凝胶与水封层间出现折射率不同的界线,则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水,再用滤纸条吸去多余水分。 (2)浓缩胶的制备:按表配制10ml 3%浓缩胶,混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方,直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处,轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内,避免带入气泡。约30min后凝胶聚合,再放置20—30min。待凝胶凝固,小心拔去样品槽模板,用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分,将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中,应没过短板约0.5cm以上,即可准备加样。 4.样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解,使浓度为0.5~1mg/mL,沸水浴加热3分钟,冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放,使用前应在沸水浴中加热1分钟,以消除亚稳态聚合。 一般加样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质)。如样品较稀,可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部,待所有凹形样品槽内都加了样品,即可开始电泳。 5.电泳 将直流稳压电泳仪开关打开,开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时,将电流调至20-30 mA。当蓝色染料迁移至底部时,将电流调回到零,关闭电源。拔掉固定板,取出玻璃板,用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去,在胶板一端切除一角作为标记,将胶板移至大培养皿中染色。 6.染色及脱色 将染色液倒入培养皿中,染色1h左右,用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到蛋白区带清晰,即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。 计算 1.相对迁移率mR =样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm) 2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图,得到标准曲线,根据待测样品相对迁移率,从标准曲线上查出其分子量。 注意事项 1.   不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量,已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括:电荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1,它本身带有大量正电荷,因此,尽管结合了正常比例的SDS,仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响,它的分子量是21,000,但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此,最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量,互相验证。 2.有许多蛋白质,是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如α-胰凝乳蛋白酶)组成的,它们在SDS和巯基乙醇的作用下,解离成亚基或单条肽链。因此,对于这一类蛋白质,SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量,而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料,还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等,与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。
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分类:高中其他
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