CRISPR-Cas9文库技术原理及应用
CRISPR-Cas9技术原理
CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。
CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组的，长度为20bp左右的sgRNA序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割，最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。
与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。目前比较常见的文库类型包括：
● CRISPR-Cas9 knock out文库
● CRISPR panal文库
● CRISPRa/i文库
● psgRNA文库
CRISPR-Cas9文库建库流程
● 靶位点确认及sgRNA文库设计
● sgRNA文库芯片合成
● sgRNA文库构建
● QC验证文库质量
● sgRNA文库慢病毒包装
● 感染稳定细胞株
● 药物筛选实验
● 细胞表型筛选
● NGS测序验证功能基因
CRISPR-Cas9文库应用方向
1、药物靶点确定与验证
CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。SCIENCE发表文章[1]，研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。
2、基因环路上下游调控机制分析
CRISPR-Cas9文库筛选技术不仅可以用于编辑人类细胞蛋白编码基因，对于基因组中的调控元件也同样有效，利用这种方法可以对基因环路上游有调控机制进行分析。Nature biotechnology发表文章[2]，科研人员利用CRISPR-Cas9文库对癌症细胞中关键的转录因子p53和ERα的增强子元件的685个基因位点进行筛查。通过CRISPR-Cas9文库筛选，共鉴定出3个增强元件与ERα的相关；3个增强元件与p53功能相关联的3个增强子，其中2个增强元件与p53完全结合才能激活细胞衰老过程。
3、代谢通路调节机制分析
CRISPR-Cas9技术在植物代谢调控中也有相关成果。Plant Biotechnology Journal发表文章[3]，科研人员选择对番茄植株GABA代谢通路中多个关键基因进行基因编辑，GABA作为人体中的抑制性神经递质，能调节人体免疫、血糖、血压，具有促进睡眠等功效，对人类健康有重要意义。通过得到六种GABA突变体(包含单基因突变、双基因突变、三基因突变、四基因突变)，其中四基因突变的GABA-6突变体叶子GABA含量与WT相比提高了19倍，这为CRISPR-Cas9多靶点敲除技术在植株代谢调控中的应用研究提供了参考。
4、Long noncoding RNA作用机制分析
CRISPR-Cas9文库的建立可以实现基因组的大规模筛选，为了对非编码基因的功能进行验证，Nature biotechnology发表文章[4]，提出构建了psgRNAs文库的方法，这种成对的sgRNA可在同一基因中造成两处断裂，形成大片段缺失，从而影响表型变化，成为研究非编码基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文库，对人源肝癌细胞系Huh7.5OC进行基因组的700个lncRNA和另外5种癌症细胞进行敲除实验，最终筛选到51个lncRNA基因能够促进或者抑制肿瘤的生长。
苏州泓迅科技利用独创的“GPS”（Genotype，Phenotype，Synotype）平台，提供基于CRISPR-Cas9 sgRNA文库的一站式基因功能筛选服务。服务包括CRISPR-Cas9 sgRNA文库构建、慢病毒包装、高通量/高内涵筛选等，利用先进的合成及筛选技术平台，为客户提供基于CRISPR-Cas9技术的基因功能筛选全套解决方案。
参考文献
1. Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7
2. Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.
3. Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017
4. Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.
本文档为【CRISPR-Cas9文库技术原理及应用】，请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑，
图片更改请在作品中右键图片并更换，文字修改请直接点击文字进行修改，也可以新增和删除文档中的内容。
该文档来自用户分享，如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服，我们会及时删除。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生，若发现您的权利被侵害，请联系客服邮件isharekefu@iask.cn，我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权，请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传，仅限个人学习分享使用，禁止用于任何广告和商用目的。
浙公网安备 33021202002483