细菌菌落总数检测常见误差原因分析[试
题
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]
细菌总数监测常见误差分析
细菌菌落总数是水源地和地面废水样品检测必做的一项指标。菌落总数检测同其他检验一样，也存在检测误差。平板计数法是细菌总数常用方法之一， 因此，该值准确与否直接关系水质好坏。微生物平板计数的通常方法为每个样品用3个稀释度，每个稀释度常做3个重复。但如何对平板菌落进行正确计数、3个稀释度以哪一个稀释度进行计数及微生物检测允许误差等问题，在饲料标准中并未有所
规定
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，而这些问题与统计值的准确性密切相关。我们就实际检测芽孢杆菌工作中遇到一些菌落计数的问题，与大家进行探讨。
1材料与方法
1(1试验材料
1(1(1样品:随机抽取微生态饲料添加剂合生素样品3份。
1(1(2 培养基:营养琼脂。
1(1(3仪器设备:磁力搅拌器，无菌培养皿，培养箱，振荡器。
1(2 试验方法
1(2(1样品的振荡时间对菌数检测的影响
选择1个样品，称取10 g，放人无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为l0、20、30、40和60 rain。用1 mL移液枪从中吸取1 mL样品悬浊液加入到盛有9 mL去离子水的试管中，用振荡器使样品充分均匀，以此类推，制成10一,1O一’不同稀释度的样品溶液。平板涂布法检测菌含量:用移液枪从样品稀释液中各吸取200 L，每个样品稀释液3个重复;
将平板倒置于35—37 cC培养箱中培养24 h。 1(2(2 检测方法对菌数检测的影响
各个样品称取l0 g，放入无菌锥形瓶内，加入90 mL无离子水，磁力搅拌分别为40 rain。并稀释成10,,l0 不同稀释度的样品溶液。倾注平板法检测菌含量:用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取1 mL，每个样品稀释液3个重复，待培养基
表
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面干燥后，将平板倒置于35 37~(2培养箱中培养24 h。平板涂布法检测菌含量:用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取200 L涂布平板，每个样品稀释液3个重复;将平板倒置于35,37?培养箱中培养24 h。2结果
2(1样品的振荡时间对菌数检测结果的影响
采用细菌平板计数的方法，不同振荡时间对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表1。从表l中可见:不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别。总体而言，在一定时间内，随着振荡时间的延长检出有效菌含量增加，说明细菌从载体上解析需要一定的时间;当振荡时间为40 rain后产品中的菌含量基本稳定。采用适当振荡时间才能更精确的显示产品中有效菌的含量。表1 震荡时间对有效菌含量结果的影响 '[",_(CFU,g
震荡时间对有效菌落含量结果的影响 震荡时间 10分钟 20分钟 30分钟 40分钟 60分钟 含菌量 2 6 10.2 15 14
3分析与讨论
3(1样品处理对结果的影响
取样时对样品取样口和取样工具要消毒，防止样品交叉污染。
3(2样品的均质处理对结果的影响
固体样品要用均质器或玻璃珠等充分均质，也可在稀释液中添加相应溶解液f如吐温80和液体石蜡等1的稀释液，以保证样品的充分均质。测定芽孢杆菌活菌数时，不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别，因为细菌从载体上解析并均匀分散到溶液中需要一定的时间，待测样品应在振荡器上充分振荡，使得芽孢杆菌可以充分和均匀地分散到待测溶液中，避免因为菌体未完全释放而引起结果中细菌含量偏低的现象。
3(3 试验过程中操作方法的影响
加样l mL时，用1 mL的吸管并且每做一个稀释度都要换1支吸管，否则稀释度间菌落计数误差会超过10,，说明存在操作误差。用吸管向平皿里加样，平皿开口要小，吸管要直立且加样结束后，让吸头接触皿底干燥处，保证加样的体积不少。若采取倾注平板法时，平皿加样后要及时倾注琼脂，其间隔一般不超过20 min f最好在10 min内)。以琼脂不烫手(约45?)为宜，否则会杀灭细菌，太热也会使冷凝水过多，影响细菌的生长。加入琼脂要及时摇匀，先向一个方向旋转，然后向另一方向旋转。这样会减少菌落的集聚和连片现象。另外，用力不要过大，使琼脂不溅到?IL壁和肌盖上，保证计数结果的准确。当琼脂凝。当琼脂凝固后，要及时移人培养箱倒置培养。若采用涂布平板法进行检测，放置适当时间后，则立即将平皿翻转后放置培养箱中进行培养，以避免菌落蔓延生长，难以计数。为保证结果准确，除作琼脂的空白对照外，还要对菌落计数的全程做一对照。
3(4 菌落计数误差
菌落计数在完成培养后应立即进行，以防菌落继续生长蔓延从而影响测定结果。培养基中加入TrC f氯化一苯四氮唑)可使细菌菌落显红色，这样可与同样品颗粒和凝集物(白色)相区分，以提高菌落计数的准确性。有学者认为:100 mL培养基中加入2,3 mL的TTC可使菌落着色且不抑制细菌的生长。菌落计数时要2个人分别用菌落计数器计数菌落总数，取2个人的平均数报告菌落总数。一般来说，每平板含20,200个菌落的稀释度的菌含量与实际结果最接近，超过200个,平皿或小于2O个,平皿的计数结果则可能与实际存在较大差别。因此，应尽量选择20,200个,平皿的稀释度进行芽孢杆菌的计数，保证菌落计数的有效性。报告结果要遵守国标中菌落计数的方法进行。
4小结
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