植物生理生化实验指导

植物生理生化实验指导 实验一、氨基酸的纸层析 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1 实验二、蛋白质含量测定（ 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 性实验）„„„„„„„„„„„„„„„„„ 5 实验三、酶的基本性质„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 7 实验四、维生素C含量的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 12 实验五、还原糖和总糖的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 14 实验六、淀粉酶活性的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 17 实验七、脂肪浸提——索氏脂肪浸提法„„„„„„„„„„„„„„„„„ 20 实验八、一种简单实用的提取植物DNA的方法„„„„„„„„„„„„„„ 22 实验九、聚丙烯酰胺电泳法测定大麦、小麦种子纯度 „„„„„„„„„„ 24 实验十、淀粉酶的诱导、提取和活性测定（综合性实验）„„„„„„„„„„ 26 实验一、植物组织水势的测定（小液流法）„„„„„„„„„„„„„„ 28 实验二、植物伤流量的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 30 实验三、根系活力的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 31 实验四、蒸腾强度的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 35 实验五、叶绿体色素的提取、分离、性质和定量测定（综合性实验）„„„„„ 37 实验六、光合强度的测定（改良半叶法）„„„„„„„„„„„„„„„„„ 39 实验七、呼吸强度的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 41 实验八、植物抗逆性的鉴定（电导仪法）„„„„„„„„„„„„„„„„ 43 实验九、植物缺水程度的测定（脯氨酸法）„„„„„„„„„„„„„„„ 45 层析 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 法已广泛用于氨基酸、核酸、激素、维生素、糖类的分离与分析。 其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质；设备简单，操 作容易，样品用量很少，结果也较明确。 本实验的目的在于要求学生掌握纸层析法的一般原理和操作技术。 纸层析法是以滤纸作为支持物的分配层析法。分配层析法是利用物质在两种 不同混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的。通常用α表示分配系数。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。 溶质在静止相的浓度（C）s, ,溶质在流动相的浓度（C）l 层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维素对水有较强的亲和力 （纸上有很多-OH 基与水以氢键相连），吸附很多水分子，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），因此使这一部分水扩散作用降 低形成静止相；而有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可以在滤纸的毛细管中自由流 动，便形成流动相。层析时，将滤纸一端浸入层析溶剂中，有机溶剂连续不断地 通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。 分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分 配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地 在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两 相间分配的数量也就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移 动的速度快；而分配系数大的溶质在静止相中分配的数量多，移动的速度慢。所 以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。 移动速度一般用移动速率表示Rf 表示： 原点到层析点中心的距离R, f原点到溶剂前沿的距离 1 各种化合物在恒定条件下，经层析后都有其一定的Rf值，也就是说在层析谱中有一定的位置。借此可以达到分离、定性、鉴别的目的。 Rf值决定于很多的因素，其中最主要的是所分离物质的分配系数。物质的分 配系数是由以下因素决定的： （1）物质极性的大小。水的极性很强，一般极性强的物质就容易进入水相， 非极性的物质易进入有机溶剂中。例如侧链含-OH和-NH、-COOH较多的氨基酸分2 配在水相中，Rf值较小，而含非极性（如-CH ）较多的物质其分子的极性降低，3 Rf值增大。 （2）滤纸的质地以及为水分饱和的程度。滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄 适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。 （3）溶剂的纯度、pH值和含水量。pH值和含水量的改变可使氨基酸和层析溶 剂极性改变，Rf值也随之改变。 （4）层析的温度和时间。温度改变使溶剂中有机相含水量改变，Rf值也改变。当所有条件相同时，层析时间短，测Rf值的因素必须严格控制。 1、 实验材料：在25?温箱中萌发2-3天的绿豆芽。 2、 仪器：（1） 恒温水浴一台；（2）烘箱一个；（3）研钵一个；（4）三角瓶一个 ；（5） 蒸发皿一个；（6）50毫升分液漏斗一个；（7）量筒三个；（8） 微量吸管（或标有刻度的毛细管）；（9）电热吹风机一个；（10） 层析缸及培养皿；（11）层析滤纸；（12）小型喷雾器一个；（13）剪刀、刀片、铅笔、尺 子、玻棒、凡士林、点样瓶。 3、试剂： （1）氨基酸 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液：浓度为0.01M，溶于10%异丙醇中。 第一组：天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸。 第二组：鸟氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、缬氨酸。 第三组：谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸。 第四组：酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺。 第五组：胱氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、瓜氨酸、天门冬酰胺。 （2）溶液系统： 第一向：正丁醇：甲酸：水：（15：3：2，体积），摇匀静止备用。 2 第二向：苯酚：水（80：20，重量）。配制方法：在分液漏斗中先计量加入 少量无离子水，再加入一定量的新蒸馏的酚。根据酚量补足应加入的全部无离子 水，这样可避免因酚的冷凝而造成的溶解困难。充分摇匀后静止备用。 （3）无离子水：用于实验中各种试剂配制。 （4）10%异丙醇：用于配制氨基酸标准液。 （5）80%乙醇：取分析乙醇以无离子水稀释。 （6）0.25%的水合茚三酮溶液。 （7）活性炭。 （8）石英砂。 1、 氨基酸的提取： 取新鲜的绿豆芽下胚轴2克，加80%乙醇10毫升，加少量石英砂，在研钵研成 匀浆，移入三角瓶，用少量80%乙醇淋洗研钵，一并移入三角瓶，加0.8克活性炭，置沸水浴中加热至沸1分钟，取下冷却，用滤纸过滤，用少量80%乙醇冲洗滤渣。滤液收集在蒸发皿中置50-60?水浴上蒸干。用1毫升10%异丙醇溶解，收集样液，准备点样。 2、 滤纸的准备： 单向层析滤纸：取28?28厘米层析滤纸一张，在对应的两边距每边2厘米处，用铅笔和直尺各划一条平行于纸边的直线，其中一条为溶剂前沿到达标志，另一 条为点样线。在点样线上每隔2厘米划一与点样线垂直的短线，标出五组标准氨基 酸和样品的点样位置 双向层析滤纸：取28?28厘米层析滤纸二张，在距每边2厘米处各划一条平行于纸边的直线，以“井”字格下边缘直线左端交点为点样原点，原点右手为第一 向，另一垂直方向为第二向。用一张作标准氨基酸图谱，另一张作样品图谱。 3、点样： 点样时选用微量吸管或标有刻度的毛细管（每小格1微升），分别在每个点样处精确点样4微升。必须在每一滴样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥，可在 有加热装置的点样台上进行，或用吹风机吹干，样点的直径以2-3毫米为宜，点样时温度不能过高，否则会破毁氨基酸。将点好样品的单向和双向层析滤纸均卷成 筒形，在上、中、下三处系三道线，但滤纸两边缘不能接触。为了消除盐酸的干 3 扰，避免拖尾现象，可将层析滤纸放入盛有浓氨水的层析缸中熏10分钟，取出后在45?烘箱中将氨驱净，再行层析。 4、层析： 本试验采用上层析法。 （1） 单向层析：取适当大小的层析缸一个，缸底放一培养皿，向培养皿内加 入第一向溶剂，液层厚约1.5厘米，在培养皿上横放两根玻棒，取已点好的样品的 单向层析滤纸以点样端朝下放在盛有层析溶剂的层析缸内的玻棒上，盖上盖子（滤 纸切勿与溶剂接触）。平衡一小时，然后将滤纸放入层析溶剂中，注意样点不能 进入溶剂，以免浸脱。将层析缸密封，这时溶剂沿纸上升，待溶剂前沿到达标志 线时，立即取出，用吹风机吹干或45?下烘干，然后显色。 （2） 双向层析：按上述单向层析方法，将点好标准氨基酸的样品的双向层析 滤纸分别用第一向溶剂进行上行层析，到达前沿标志线时，立即取出吹干溶剂， 减去溶剂前沿以外的部分，然后将纸转90?角，以同样的方法用第二向溶剂进行 上行层析，当溶剂前沿到达标志时立即取出吹干或45?下烘干，进行显色。 5、显色： 用喷雾器将0.25% 的茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸上，注意不要喷得过多。 用吹风机吹干溶剂后，放在60-65?烘箱中烘30分钟或用吹风机吹热风，即能显现 各种氨基酸的色斑。为了消除铵离子的影响，可在展开后在滤纸上喷1%的氢氧化钾的无水乙醇溶液，在60?下保持15分钟，以使全部氨完全挥发掉，再行显色。 单向层析：显色完毕后，用铅笔将各色谱的轮廓和中心点描绘出来，然后量 出由原点至色谱中心点和溶剂前沿的距离，计算出各种已知和未知的色谱的Rf值进行比较和鉴定。各组已知氨基酸色谱顺序由指导教师供给。 双向层析：Rf值有两个数值组成，即要在第一向和第二向层析中各计算一次， 根据Rf并借助各种氨基酸的特有颜色，分别与标准氨基酸对比，即可鉴定为何种 氨基酸。 色素含量不高的植物样品，可不用活性炭处理。 4 我们将逐步改变实验教学都由实验技术人员准备实验，教师讲解，学生照做 的方法，尽量多给学生留下思考的时间和创新的机会。在教师指导下，查文献、 拟定实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 、调试仪器、配制药品、处理数据、研究和解决实验中出现的问题， 从失败中获得经验，从成功中获得动力。 蛋白质含量是农产品品质的重要指标之一，大豆、水稻等农作物是农业院校学 生学习研究的最重要的生物材料。农作物品种及各个发育时期或不同栽培条件下的 生理生化指标反映了其品种特性和生长的变化规律，掌握这些生理生化指标测定的 方法对学生今后的科研实践是非常必要的。在以往的实验中，我们没有开设这样的 实验设计项目，使学生对生物化学实验技术在农业研究方向的重要地位认识不够。 所以为了将基础知识与专业技术更好地衔接，使学生将生化基本实验技能应用于农 学专业的科研、管理，很有必要开设此项实验。 1.本实验通过比较不同大豆(或水稻等)品种或同一品种各个发育时期或不同栽培条件下的籽粒蛋白质含量变化，来掌握测定原理，学习测定方法，并通过分 析得出相应结论。 2.提高学生对生物化学实验技术在农业研究方向的重要地位的认识；使学生 将生化基本实验技能应用于农学专业的未来科研工作中。 1.仪器：电子天平、过滤装置、移液管、滴定装置、可见分光光度计、紫外分 光光度计、离心机、水浴锅、温度计、烘箱、真空抽气机、粉碎机、电炉子、实验 室常用玻璃器皿； 2.试剂：常规化学、生物化学试验的试剂均有，如有特殊要求请说明； 3.实验材料：大豆粉、小麦、玉米等。 1. 要求学生认真查文献、拟定实验方案、调试仪器、配制药品、处理数据、 尽量独立解决实验中出现的问题，必要时与老师商量解决，以达到锻炼提高的目的。 5 2.书写报告要认真、层次清楚、整洁、对结果有客观分析。 3.最后要有总结（自我评价），包括独立完成实验的收获、教训、注意事项、 实验过程中遇到的问题及解决的方法等。 6 酶是生物体中具有催化功能的蛋白质，因此，也叫生物催化剂。生物体内存 在多种多样的酶，从而使生物体在温和的条件下能够迅速完成复杂的代谢过程。 所以了解酶的基本性质，对于揭示各种生化进程具有非常重要的意义。 通过本实验认识酶的催化效率比一般催化剂高。 酶作为一种特殊的催化剂，能大大降低反应的活化能，从而极大地加快了反应 速度。这在生理上具有极其重要的意义。在生物体内，某些代谢由于需氧脱氢的结 果而产生对机体有毒害作用的HO。过氧化氢酶能催化过氧化氢很快地分解成HO和222 O，使HO不致在体内大量积累。铁粉也是过氧化氢分解的催化剂，但其催化效率仅222 为过氧化氢酶的100亿分之一。 1．实验材料：马铃薯 2．仪器：（1）试管：4支；（2）管架：1个；（3）研钵；（4）量筒：10 毫升?1 3．试剂：（1）2% HO；（2）铁粉 22 管号 1 2 3 4 项目 2%HO（ml） 3 3 3 3 22 生马铃薯糜 少许 熟马铃薯糜 少许 铁 粉 少许 现 象 解释现象 取4支试管，编号，按上表操作。 7 1. 了解酶的特异性。 2. 掌握检查酶的特异性的方法及其原理。 酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度的特异性，即一种酶只能对 一种或一类化合物起催化作用。例如：蔗糖酶只能催化蔗糖的水解，而不能催化 淀粉的水解；而淀粉酶能催化淀粉水解，却不能催化蔗糖水解。本实验以蔗糖酶 和淀粉酶对蔗糖和淀粉的作用为例来说明酶的特异性。 1． 仪器： （1）研钵 ；（2）试管：6 支；（3）试管架；（4）小烧杯；（5）刻度吸管：1毫升?5，2毫升?1 ；（6）漏斗；（7）电热恒温水浴。 2． 试剂： （1）1% 淀粉溶液（含0.3%NaCl）：将1克可溶性淀粉及0.3克氯化钠，混悬于5毫升蒸馏水中，搅动后缓慢倒入沸腾的60毫升蒸馏水中，搅动煮沸1分钟。晾至室温后加水至100毫升，放置于冰箱贮存。 （2）2% 蔗糖溶液：蔗糖是典型的非还原糖，若商品蔗糖中还原糖含量超过 一定标准，则呈还原性，这种蔗糖不能使用。所以，实验前必须进行检查。本实 验用的蔗糖至少应是分析纯的试剂，要现用现配。 （3）淀粉酶液：稀释200倍的新鲜唾液。 （4）蔗糖酶液：取1克新鲜酵母放入研钵中，加少量石英砂和蒸馏水，研磨 10分钟左右，用蒸馏水稀释至50毫升，静止片刻再过滤，滤液即为蔗糖酶提取液。 （5）本乃狄（Benedict）试剂：将17.3克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中。冷却后稀释至150毫升。取柠檬酸钠173克及碳酸钠（NaCO?HO）100克，加水232600毫升，加热使之溶解，冷却后，稀释至850毫升。最后把硫酸铜溶液缓缓倾入 柠檬酸钠—碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此试剂可长期保存。 8 取6支试管编号，按下表操作： 编号 1 2 3 4 5 6 操作项目 1%淀粉（ml） 1 1 1 2%蔗糖（ml） 1 1 1 淀粉酶液（ml） 1 1 蔗糖酶液（ml） 1 1 蒸馏水（ml） 1 1 反应 摇匀，放入37?水浴中保温10分钟 木乃狄试剂 2 2 2 2 2 2 （ml） 反应 摇匀，放入沸水加热数分钟 结果 解释实验现象 通过检验不同温度下淀粉酶的活性，了解温度对酶活性的影响，并进一步明 确酶的最适温度的概念。 酶的催化作用受温度的影响很大。在一定温度范围内，随着温度的升高，酶 的热变性不显著，而酶促反应速度增加，直至达到最大值。由于酶是一种蛋白质， 温度过高会引起酶的急剧变性，导致酶失活，因此，反应速度达到最大值以后， 随着温度的升高，反应速度急剧下降，以至完全停止酶促反应。反应速度达到最 大值时的温度称为酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37~40?，植物 9 酶的最适温度为50~60?。 本实验以不同温度条件下淀粉酶作用于淀粉，并用碘液检查酶促淀粉水解程 度，来说明温度与酶活力的关系。 1． 仪器：（1） 刻度吸管：1毫升?2，2毫升?1；（2） 试管：3支；（3） 试管架；（4）恒温水浴：3个；（5） 冰浴 2． 试剂： （1）1%淀粉溶液（含0.3%NaCl）：配法如前。 （2）pH7.0磷酸盐缓冲液：配法同前。 （3）碘液 取3支试管，按下表操作： 酶液处 项目 淀粉酶pH6.8缓1％淀粉液反应条件冷却 碘液 理5分结果 管号 液（ml） 冲液（ml） （ml） 10分钟 3分钟 （滴） 钟 1 1 0? 2 1 0? 流动1 2 1 37? 2 1 37? 水冷1 3 1 70? 2 1 70? 却 1 解释实验现象。 了解酶促反应的激活和抑制作用；学习激活剂和抑制剂影响酶促反应的方法和 原理。 酶的活力常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活力增加，称为激活剂； 10 有些物质能使酶的活性降低，称为抑制剂。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝 对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。 例如，氯化纳达到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活力。 1． 仪器： （1）试管：3支；（2）试管架；（3）漏斗；（4）烧杯；（5）刻度吸管：1毫升?4，5毫升?1；（6）恒温水浴；（7）10毫升?1 四、 操作步骤： 取3支试管，按下表操作 管 号 1 2 3 项 目 1%NaCl（ml） 1 蒸馏水（ml） 1 1%CuSO（ml） 1 4 唾液淀粉酶（ml） 1 1 1 将上述各管试剂混匀 0.1％淀粉（ml） 3 3 3 摇匀后放入37?水浴中保温反应1分钟左右，从1号试保温反应检验淀粉水 管取出1滴溶液置白瓷板上，用碘液检查淀粉的水解程 解程度 度，待试液不再变色时，取出所有试管。 现象 解释现象 11 维生素C是人类营养中最重要维生素之一，缺乏时会产生坏血病。水果、蔬菜 是供给人类维生素C的主要来源。通过对维生素C含量的测定，可以了解果品质量 的高低，并掌握这一测定方法。 利用染料2,6-二氯酚靛酚作氧化剂，可将还原态的维生素C氧化成脱氢维生素C，而染料本身被还原成无色的衍生物。2,6-二氯酚淀粉在酸性条件下呈红色。在 滴定终点之前，滴下的2，6-二氯酚淀粉立即被还原成无色。当溶液从无色转变成 为红色时，即为滴定终点。 1、 实验材料：水果或蔬菜。 2、 仪器：（1） 微量滴定管；500毫升?1；（2）量瓶：50毫升?2；（3）三角瓶；500毫升?2；（4） 研钵；（5）量筒； （6）刻度吸管；10毫升?2； 3、 试剂： （1）1%草酸：秤取5.0克草酸溶于少量蒸馏水中，定容至500毫升。 （2）2%草酸：秤取10.0克草酸溶于少量蒸馏水中，定容至500毫升。 （3）0.001N 2，6-二氯酚靛酚钠溶液：称取干燥的2，6-二氯酚靛酚钠60毫克，放入200毫升量瓶中，加热蒸馏水中100-150毫升，滴加0.01N NaOH4-5滴，强烈摇动10分钟冷却后加水至刻度。摇匀后用紧密滤纸滤于棕色瓶中，贮于冰箱中 备用，有效期一周。使用前需标定（见附注）。 1、 样品的处理和提取： 称取4.0克新鲜样品，至研钵中，加5毫升2%草酸，研成匀浆。通过漏斗将样 品提取液转移到50毫升量瓶中。残渣再用2%草酸提取2-3次，提取液及残渣一并转 入量瓶。2%草酸总量为35毫升，最后以水定容。溶液定容时若泡沫较多，可加几 滴乙醇消除泡沫后再定容。摇匀，过滤，滤液备用。 12 2、 样品的测定： 吸取滤液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的红色，并在15秒内不消失为止。 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 所用滴定液体积。 3、 空白测定： 在另一50毫升三角瓶内，放入35毫升2%草酸，并用1%草酸定溶，摇匀，取此液10毫升放入另一50毫升三角瓶内，用2,6-二氯酚靛酚钠滴定至终点，记录染料 用量。 ，，V,V，K，V12X,，100 W，V3 X：100克样品所含维生素C毫克数（毫克/100克） W：称取样品重（克） V1：滴定样品所用染料毫升数 V2：滴定空白所用染料毫升数 V：样品提取液稀释之总体积（即50毫升） K：1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出 （1）2,6-二氯酚靛酚钠溶液的标定：准确称取维生素C20毫克，用1%草酸溶解定容至200毫升。吸取此液10毫升，以1%草酸再次稀释定容至200毫升。吸取此液10毫升，放入50毫升三角瓶中（同时吸取10毫升1%草酸于另一个50毫升三角瓶中，做空白对照立即用所要标定的2，6-二氯酚靛酚钠滴定至粉红色出现15秒不消失，记录所用毫升数，按下式计算K值（即1毫升染料所能氧化抗坏血酸的毫克数）。 G1010K,，， 200200V (式中：G为称取维生素C的毫克数。V为滴定10毫升标准维生素C时所用去染料的毫升数，与滴定空白所用毫升数之差值) （2）操作要尽可能快，并防止与铁铜器具接触，以减少维生素C的氧化。 （3）草酸及样品的提取液避免日光直射。 （4）当样液本身带色时，测定前于提取液中加2-3毫升二氯乙烷。在滴定过程中当二氯乙烷由无色变粉红色时，即达终点。 13 掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉 721型分光光度计的使用方法。 各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可 将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的 双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖将3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它 产物，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅的程度呈一定的比例关系， 在540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出 样品中还原糖和总糖的含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在 计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9 即为实际的总糖量。 1、实验材料：面粉。 2、仪器： (1) 25ml 血糖管或刻度试管?11；(2) 大离心管或玻璃漏斗?2；(3) 烧杯：100ml?1；(4) 三角瓶：100ml?1；(5) 容量瓶：100ml?3；(6) 刻度吸管：1ml?11、2ml?4、10ml?1；(7) 恒温水浴；(8) 沸水浴；(9) 离心机(过滤法不用此设备)；(10)电子天平；(11)分光光度计； 3、试剂： (1) 1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取 100 mg分析纯葡萄糖(预先在 80 ?烘至衡重)，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 (2) 3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2NNaOH 溶液，加到500ml含有185g酒石酸甲钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。 (3) 碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml 蒸馏水中。 (4) 酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml 70%乙醇中。 14 (5) 6NHCl (6) 6NNaOH 1、制作葡萄糖标准曲线： 取7支具有25ml刻度的血糖管或试管，编号，按下表所示的量，精确加入浓度 为1mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。 数量 管号 0 1 2 3 4 5 6 项目 葡萄糖标准溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 3,5-二硝基水杨酸试剂 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 （ml） 将各管摇匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却 至室温，再以蒸馏水定容至25ml刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大 试管，则向每管加入21.5ml蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1-6号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准 曲线。 2、样品中还原糖和总糖的测定： （1）样品中还原糖的提取： 准确称取2g食用面粉，放在100ml的烧杯中，先以少量的蒸馏水调成糊状，然 后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50?恒温水浴中保温20分钟，使还原糖浸出。离心 或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部 收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 (2)样品中非还原糖的水解和提取： 准确称取1 g食用面粉，放在100ml 的三角瓶中，加入10 ml 6NHCl及15ml 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30分钟。取1~2 滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解 液冷却后，加入一滴酚酞指示剂，以6NNaOH中和至微红，过滤，再用少量蒸馏水 冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度， 15 混匀。精确吸取10ml定容过的水解液，移至另一100ml的容量瓶中，定容，混匀， 作为总糖待测液。 (3)显色和比色： 取5支25ml刻度的血糖或刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测 液和试剂。 数量 管号 还原糖测定管号 总糖测定管号 项目 ? ? ? ? ? 还原糖待测液（ml） 2 2 0 0 0 总糖待测液（ml） 0 0 1 1 0 蒸馏水（ml） 0 0 1 1 2 3,5-二硝基水杨酸试剂（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加完试剂后，其余操作均与葡萄糖标准曲线是相同，测定各管消光值。 以管?、?的消光值平均值和管?、?的消光值的平均值，分别在标准曲线 查出相应的还原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 测定时取用体积查曲线所得还原糖毫克数，提取液总体积还原糖（%）,，100% 样品毫克数 查曲线所得水解后还原糖毫克数，稀释倍数总糖（%）,，0.9，100% 样品毫克数 1、 用血糖管比大试管方便。 2、 离心比过滤易得清液。 3、 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 16 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物 中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。植物中有α-淀粉酶及β-淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。本实验的目的在于掌握分别测定这 两种淀粉酶的方法。 α-淀粉酶及β-淀粉酶，各有其一定的特性，如β-淀粉酶不耐热，在高温下 易钝化而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化，通常提取液同时有两种淀 粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出 另一酶的活性。将提取液加热到70?维持15分钟以钝化β-淀粉酶，便可测定α-淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0?加以处理，钝化α-淀粉酶的活性，以测出β-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5-二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的深度成正比，故可求出麦芽糖的含量，以 麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。 1、 实验材料：萌发的小麦（芽长1厘米左右） 2、 仪器：（1） 小台秤；（2）研钵；（3）容量瓶：100毫升?1；（4）具塞刻度试管25毫升?13；（5） 试管：8支；（6）刻度吸管：1毫升?2，2毫升?2；（7）离心机；（8） 恒温水浴； （9）分光光度计。 3、试剂： （1）1%淀粉溶液； （2）0.4 N NaOH； （3）pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01克，溶解后稀释至1升；B、称取柠檬酸钠29.41克，溶解后稀释至1升。取A液13.7毫升与B液26.3毫升混匀，即为pH5.6之缓冲液。 （4）3,5-二硝基水杨酸：精确称取3,5-二硝基水杨酸1克溶于20毫升1N氢氧 17 化钠中，加入50毫升蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至 100毫升，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。 （5）麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100克溶于少量蒸馏水中，仔细移入100毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 1、 酶液的提取： 称取2克萌发的小麦种子（芽长1厘米左右），至研钵中加一克石英砂，磨成 匀浆倒入25毫升具塞刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀后在室温（20?）下放置，每隔数分钟震荡一次，放置15-20分钟，离心，取上清液备用。 2、 α-淀粉酶活性的测定： （1） 取试管4支，注明两支为测定管。 （2） 于每管中各加酶提取液1毫升，在70?恒温水浴中（水温度的变化不应 超过?0.5?）准确加热15分钟，在此期间β-淀粉酶受热而钝化，取出后迅速在 自来水中冷却。 （3） 在试管中各加入1毫升pH5.6柠檬酸缓冲液。 （4） 向对照管中加入4毫升0.4N氢氧化钠，以钝化酶的活性。 （5） 将测定管和对照管置40?（?0.5?）恒温水浴中保温15分钟，再向各管分别加入40?下预热的淀粉溶液2毫升，摇匀，立即放入40?水浴中准确保温5分钟后取出，向各测定管迅速加入4毫升0.4N氢氧化钠，以终止酶的活动，然后准 备下步糖的测定。 3、 α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定： 取上述酶液2-6毫升，放入容量瓶中，用蒸馏水稀释至100毫升（稀释程度视酶活性大小而定）混合均匀后，取4支试管，各加入稀释之酶液1毫升及1毫升pH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶的第（4）及（5）的操作，同样准备糖 的测定。 4、 麦芽糖的测定： （1） 取25毫升刻度试管7个，编号，分别加入麦芽糖标准液（1毫克/毫升）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，以消 光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 18 （2） 样品的测定：取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2毫升，分别放入25毫升具塞刻度试管中，再加入2毫升3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀，置 沸水中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，混匀。用分光光度计 在520nm波长下进行比色，记录消光值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然 后进行结果计算。 （A-A'），样品稀释总体积,,淀粉酶水解活性[麦芽糖（毫克）/鲜种（克）,5分钟],样品重（克），C （B,B'），样品稀释总体积（,，,）-淀粉酶总活性[麦芽糖（毫克）/鲜种（克）,5分钟],样品重（克），C A —— α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（在标准曲线上查得值） A` —— α-淀粉酶的对照管中麦芽糖量 B —— （α+β）-- 淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量 B` —— （α+β）-- 淀粉酶的对照管中麦芽糖量 C —— 比色时所用样品液毫升数 19 学习和掌握粗脂肪提取的原理和测定方法。 用脂肪溶剂将脂肪从样品中浸提出来，然后将溶剂蒸发除去，称取瓶中残留 物的重量或称量样品损失的重量，即可求出样品中粗脂肪的含量。 在测定样品含油量时，通常采用沸点低于60?的有机溶剂作为脂肪溶剂 (如 乙醚和沸点为30?至60?的石油醚)所提取的脂溶性物质为脂类物质的混合物，其 中含有脂肪、游离脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油、某些色素及有机酸等，因 此称为粗脂肪。 1、 实验材料：（1）待测植物样品；（2）滤纸筒。 2、 仪 器：（1）兰氏脂肪浸提仪；（2）电热恒温水浴；（3）分析天平。 3、 试 剂：（1）乙醚。 1、仪器的安装： 将索氏脂肪浸提取仪的冷凝管及脂肪接受瓶的磨砂玻璃接口处用铅笔编号， 洗净烘干。脂肪接受瓶放入干燥器内冷却后称取空瓶质量，仍放回干燥器内备用。 将冷凝器用铁驾台卡夹安装在加热用的电热恒温水浴上，装牢。在冷凝器的进出 水口分别装上橡胶管，通向冷凝器内蛇型管的短管为进水口，通向外层的短管为 出水口。 2、样品的称取： 取滤纸筒（25ф70毫米）截成35毫米的长度，用铅笔编号，两边对称的夹上 一个回形针，留出一段铁环作挂钩用。在分析天平上称取空滤纸筒的重量，加入 经 1 毫米筛孔制备的样品2 — 3克，称准其重量，再向滤纸筒塞入脱脂棉一小块， 防止样品散失，将已加入样品的滤纸筒放在一个小烧杯内，然后放入90?的真空干燥烘箱内烘5—6 小时，取出放入干燥器内冷却备用。 20 3、 脂肪的浸提： 将滤纸筒挂在冷凝器内固定在杆下端的钩子上，再将脂肪瓶加入无水乙醚70 毫升，套在冷凝器下面的磨口上。把装好冷凝器的脂肪瓶放在预先调好温度 （50-60?）的电热水浴上。松开固定杆上的止水夹，将滤纸筒浸入乙醚内，开放 冷凝水阀门，注意乙醚煮沸的情况，要求回流速度适当，不可太快，以免冷凝不 及乙醚在冷凝器上部逸失。滤纸筒内样品经热沸的乙醚浸提20分钟后，提起滤纸筒操作杆至最高位置，冷凝后的乙醚自溢流管流入，装满滤纸筒，使之淋洗滤纸 筒上部的筒壁，然后从乙醚逐步回收管回收乙醚，直至脂肪接受瓶中的乙醚完全 蒸发干为止。关闭电源，关上冷凝水的阀门。 4、 脂肪瓶的干燥和滤纸筒乙醚的回收： 脱下脂肪瓶，用绸布擦去手摸的痕迹及沾上的尘土，放入90?的直空干燥箱内烘45-60分钟后取出放入干燥器内，冷却半个小时后称重。滤纸筒脱离挂钩后立 即放入一个空的脂肪瓶内，一个脂肪瓶可以同时放入4-8个，套上冷却器，开放冷却水，打开水浴电源回收乙醚。 浸提前脂肪瓶重,浸提后脂肪瓶重粗脂肪%,，100% 样品重 乙醚易燃，操作时应特别注意，加乙醚时不要打开电门，脂肪瓶与冷凝器的 结合必须吻合，不能漏气，脂肪浸提仪附近不能有明火闪动。乙醚试剂瓶应远离 加热器。 21 植物DNA的提取是植物分子生物学和基因工程研究的一种基本的技术，至今已 有了数种方法。此方法最大的特点是：将SDS同时用作细胞膜的去污剂和蛋白质的 变性剂，变性的蛋白质通过离心而不是酚抽提除去，使得整个操作过程变得简单 快捷，比较温和，1小时左右就可以获得纯化的植物DNA。用这种方法得到的DNA能直接被限制性内切酶酶解，纯度较高，适用于分子生物学的研究。本实验的目 的是掌握DNA提取的原理和方法。 1、 植物材料：螺旋藻（Spirulina platensis）、水稻（Oryza sativa）和烟草（Nicotianatabacum）. 2、 试剂和溶液： -1（1）20?SSC：3mol?L柠檬酸钠，pH8.0： -1（2）溶菌酶、10μg?μlRnase、10%SDS（均为Sigma产品）； （3）酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 -1-1（4）TE：10mmol?LTris-HCL、1mmol?LEDTA，pH7.6。 3、提取步骤： 收集对数生长期的螺旋藻细胞，悬浮于5倍体积（v/w）含2mg?mL-1溶菌酶的20?SSC中，室温保持10分钟，偶尔摇动混匀。水稻幼苗和烟草嫩叶在液氮中研磨 成粉状后，立即用5倍体积的20?SSC悬浮，并轻轻拌匀。上述悬浮液在冰上先放 置3分钟，然后加入10% SDS至终浓度为2%，混匀；继续放置10分钟后，在4?用11000?g离心15分钟。上清液转移至新的离心管中，并用相同体积的TE稀释，再加入RNase至终浓度为10μg?ml-1，室温放置30分钟。11000?g离心15分钟，所得的DNA沉淀用70%的乙醇洗两次后，真空中抽干或自然干燥，最后溶于适量的TE中。 利用本方法，从烟草、水稻和螺旋藻中提取了DNA。因为整个过程的操作步骤 较少，也较温和，减少了DNA被弄断的机会，所以所得的DNA分子量较大，大部分都比完整的λ噬菌体的DNA（48.5Kb）还大。另外，用此方法所提的DNA的 22 OD260/OD280的比值1.8至1.9之间，并能被限制性内切酶酶切，显示有较好的纯度。 在使用本方法时，须注意下面的几个问题。当20?SSC的悬浮液中加入SDS至2%后，溶液中会出现白色絮状物质，表明蛋白质已经变性，这是本方法的主要特 点之一。它通过变性后离心而不是常用的多次酚抽方法，将绝大部分的蛋白质除 去。离心所得的上清液，需要用TE稀释，这是因为溶液中的盐浓度较高，如不稀 释，RNase就无法起作用；而且在沉淀DNA时，如用乙醇会将溶液中的盐析出，如 用异戊醇则形成两相的界面，将溶液中盐的浓度降低后，就解决了这些问题。但 是，加大稀释TE的体积，对于DNA的产量并无非常明显的作用，用等体积的TE稀释即可。DNA抽提液经RNase酶解后，再用酚：氯仿：异戊醇抽提一次，用以除去剩 余的蛋白质和酶。本方法适用于大量和微量的DNA制备。大量制备时，RNase酶解和酚：氯仿：异戊醇的抽提步骤可以在DNA浓缩一些后再使用，这样就较便于操作， 并且节省RNase和酚。通常，用这种方法能从每克新鲜组织中提取到10至15μg的DNA。 23 本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，提取分离种子中的蛋白质，根据不同 品种的蛋白质谱带与标准谱带的差异，可鉴定出品种的真实性和纯度。本实验目 的是掌握聚丙烯酰胺电泳的原理、实验方法以及此方法在种子鉴定中的应用。 从种子中提取的醇溶蛋白在凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下 得到良好的分离，通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种由于遗传组成不同， 种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对品 种真实性和纯度进行鉴定。 1、 仪器：电泳仪（满足稳压500V）、离心机、垂直板电泳槽、钳子、5ml、10ml移液管、微量进样器、聚丙烯离心管。 2、 试剂：尿素，乙醇，甘氨酸，甲基绿，三氯乙酸，冰乙酸，过氧化氢，硫 酸亚铁，抗坏血酸，α-氯乙醇。 3、 药剂配制： （1） 蛋白质提取液： 小麦：0.05克甲基绿溶于25毫升α-氯乙醇中，加蒸溜水至100毫升。低温保存。 大麦：0.05克甲基绿溶于20毫升α-氯乙醇中，加入118克尿素，再加入1毫升β-巯基乙醇，加蒸溜水至100毫升。低温保存。 （2） 电泳缓冲液：0.4克甘氨酸加蒸溜水溶解，加4毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低温保存。 （3） 凝胶缓冲液：1.0克甘氨酸加蒸溜水溶解，加20毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低温保存。 （4） 0.6%过氧化氢：30%过氧化氢2毫升，加蒸溜水至100毫升。低温保存。 （5） 染色液：0.25克考马斯亮蓝加25毫升无水乙醇溶解，加入50克三氯乙酸，加水至500毫升。 （6） 凝胶液：丙烯酰胺20克，甲叉双丙烯酰胺0.8克，尿素12克，硫酸亚铁0.01克，抗坏血酸0.2克，用凝胶缓冲液溶解并定容至200毫升。低温保存。 24 1、 样品提取： 一般每个样品测定100粒种子，若更准确地估测品种纯度，则需更多的种子。 如果分析结果要与某一纯度的标准值比较，可采用顺次测定法（sepuential testing）来确定，即50粒作为一组，必要时刻连续测定数组，以减少工作量。如 果只鉴定真实性，可用50粒。 取小麦或大麦种子，用钳子逐粒夹碎（夹种子时最好垫上小片清洁的纸，以 便于清理钳头和防止样品之间的污染），置1.5毫升离心管中，加入蛋白质提取液 （小麦0.2毫升，大麦0.3毫升）充分摇动混合，在室温下提取24小时，然后在18000?g条件下离心15分钟。取其上清液用于电泳。 2、 凝胶制备： 从冰箱中取出凝胶溶液和过氧化氢液，吸取10毫升凝胶溶液，加1滴0.6%过氧化氢，摇匀后迅速倒入封口处，稍加摇动，使整条缝口充满胶液，让其在5-10分钟聚合封好。 吸取45毫升凝胶溶液，加3滴0.6%过氧化氢，迅速摇匀，倒入凝胶板之间，马 上插好样品梳，让其在5-10分钟内聚合。 3、 进样： 小心抽出样品梳，将玻璃板加在电泳槽上，用滤纸或注射器吸取样品槽中多 余的水分，然后用微量进样器吸取10-20μl样品加入样品槽中。 4、 电泳： 在前后槽注入电极液，前槽接正极，后槽接负极。然后打开电源，逐渐将电压 增到500V电泳时，要求在15-20?温度下进行。电泳时间一般为60-80分钟，具体时间可按甲基绿迁移时间来推算，电泳时间为甲基绿移至前沿所需时间的2-2.5倍。 5、 染色： 将胶板小心的取下，在染色液中染色1-2天。一般情况不需要脱色，但为使谱 带清晰，可用清水冲洗。 谱带命名可采用相对迁移率法，或电泳程式法。根据醇溶蛋白谱带的组成和 带型的一致性，并与标准样品电泳图谱比较，坚定种子真实性以及测定品种纯度。 25 大麦（或小麦）种子萌发时，种胚产生GA扩散到胚乳的糊粉层细胞（被称为3 GA反应的“靶细胞”），刺激其合成或激活α-淀粉酶，然后进入胚乳，使贮藏的3 淀粉被水解为还原酶，因此，无胚种子不能释放GA，也不能形成与激活α-淀粉3酶。外加的GA也可代替胚的释放作用，从而诱导α-淀粉酶的合成。在一定范围3 内，由去胚的吸胀大麦产生的还原糖量，与外加GA浓度的对数成正比，由此可说3明GA对α-淀粉酶的诱导形成。 3 1、材料：大麦（或小麦）种子； 2、仪器：721分光光度计；超净工作台（或灭菌箱）；温箱；摇床；恒温水浴； 高压灭菌锅；棉塞；牛皮纸；刀片；镊子；烧杯；培养皿；试管；移液管；玻璃 棒。 -33、药品：10mol/L乙酸缓冲液（pH 4.8）[每ml含链霉素硫酸盐1mg（或氯霉素40μg）]、10 mg/L GA10 mg，加少量95%乙醇溶解，用蒸馏水定容至1000ml、3 淀粉溶液（称取可溶性淀粉0.67g和KHPO0.82g溶于20 ml蒸馏水中不断搅拌下加24 到70ml沸水中，最后加水定容至100ml）、I- KI溶液（称取I0.06g和KI 0.6g，22 溶于0.05mol/L HCL溶液1000ml中）、5%漂白粉溶液（W/V）、5% HSO溶液（W/V）、24灭菌水、石英砂。 1、材料准备 选择对GA敏感、萌发高、大小一致的小麦种子，用50% HSO浸泡2h，取出后，324用自来水冲洗约20次，然后用力揉搓除去颖壳；用刀片将种子横切近于等长的两 半，使成无胚的半粒和有胚的半粒，各150粒分装与两个小烧杯内，用5%漂白粉溶液消毒15min，在无菌条件下倒掉漂白粉溶液，用无菌水洗5次。然后将无胚与有胚的半粒种子放于内装一层石英沙的无菌培养皿内，倒入刚好浸没种子的无菌水， 将培养皿置于25度温箱中吸涨24-48 h。 2、GA系列浓度标准溶液的配置 3 取干洁试管5支（编号），各加蒸馏水9ml，向1号管加GA母液1 ml，混匀后吸3 26 出1 ml加到2号管内；2号管混匀后吸出1 ml加到3号管内；依次稀释，于是依次配 -1-2-3-4-5成0.10 mg/L、10 mg/L、10 mg/L、10 mg/L、10 mg/L的 GA系列浓度标准3溶液。再取干洁试管8支（0-7号），按表加入各种试液也材料（烧杯中吸胀的半粒 大麦种子），与25度下振荡保温24 h，过滤（或离心），滤液（或上清液）备用。 3、α-淀粉酶活性测定 取干洁试管8支（0-7号），分别加入蒸馏水0.8 ml和淀粉溶液1 ml，再按号加入半粒种子保温滤液（或上清液）0.2 ml混匀，于25度恒温水浴中准确计时保温 10 min（适宜的时间由预备试验确定，即以1mg/L GA的反应液与碘试剂反应，以3 OD值达到0.4-0.5的反应时间为宜），立即取出试管放入冷水中，加入I- KI试剂21ml终止反应，再加蒸馏水2ml，混匀后于620nm下测定OD值（表2-6），以光密度表示淀粉酶的相对活性（以蒸馏水为空白校正仪器）。以GA浓度的负对数为横坐标，3OD值为纵坐标，绘制出标准曲线。 GA对α-淀粉酶活性的影响 3 GA溶液 3乙酸缓冲溶液 半粒种 管号 HO（ml） 2OD值(620nm) -3/（10mol/L） （5粒） 浓度/（mg/L) 体积/ml 1 0 0 1 1 有胚 2 0 0 1 1 无胚 3 0.00001 1 0 1 无胚 4 0.0001 1 0 1 无胚 5 0.001 1 0 1 无胚 6 0.01 1 0 1 无胚 7 0.1 1 0 1 无胚 8 1 1 0 1 无胚 注：溶液灭菌后在无菌条件下放入半粒种子。 1、GA在什么浓度范围与诱导α-淀粉酶的活性成正比关系？ 3 2、GA诱导α-淀粉酶的最底浓度是什么？ 3 27 植物组织的水分状况可用水势（代表水的能量水平）来表示。植物组织的水 势愈低，则吸水能力愈强。反之，水势愈高，则吸水能力愈弱而供水给其它较缺 水细胞的能力愈强。不同植物，不同部位，不同年龄及不同时期的组织，水势都 有一定差异，土壤条件及大气条件等外界因素对植物组织的水势也有很大影响， 故应深入研究，以便为研究植物的水势状况以及制订灌溉生理指标打下基础，本 实验在于用小液流法测定植物组织的水势，并初步观察其变化情况。 水势表示水分的化学势。象电流是由高电位向低电位处移动一样，水从水势 高处流向水势低处。植物体细胞之间以及植物体有环境间的水分移动方向都由水 势差决定。当植物细胞或组织放在溶液中时，如果植物细胞的水势小于溶液的渗 透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大，反之，则植物细胞内水分外流 而使溶液浓度变小。若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动 态平衡，所以外部溶液浓度不变，此溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以 利用溶液浓度的不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液浓度的变化。然后 根据公式计算渗透势。 ?试管；?毛细吸管；?剪刀；?移液管；?镊子；?次甲基蓝。 1. 首先配制一系列浓度递增的蔗糖溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8M）。取上述溶液各10毫升分别注入8只试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序排成一列，放在试管架上作为对照组。 2. 另取8支试管编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然后由对照组 中各试管中分别取溶液4ml，移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞 子。 3. 用剪刀将白菜叶或马铃薯剪成大小相等的小块，40块，向试验组的每一试 28 管中各加相等数目的小块，塞好塞子，放置30分钟，在这段时间内摇动数次，到 时间后，向每试管中各加次甲基蓝粉末少许，并振荡，此时溶液变成蓝色。 4. 用毛细移液管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对 照组的相同编号试管的液体的中部，缓缓放入一滴蓝色试验溶液，并观察小液流 移动的方向。如果小液流向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡，比 重比原来小了，如果小液流向下，则说明细胞从溶液中吸水，溶液变浓，比重变 大。如果液流不动，则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等 于溶液的渗透势。记录小液流不动的试管中蔗糖溶液的浓度。 5. 半小时后，重复测定一次。 计算水势值：D=P（巴） P=–RTiC P：表示渗透势。以巴的负值表示（1.013巴等于1大气压） R：表示气体常数0.083?Lbax/M?K T：表示绝对温度：即273?+t?（当时实验温度） i：表示解离系数：蔗糖等于1 c：表示等渗溶液的克分子浓度。 所以：P=–0.083?（273?+t?）?C 29 伤流量是植物根系活力的重要指标，伤流量多时，一般可直接测量其体积， 而对一些伤流量较少的植物，可用脱脂棉吸收后称重来测定。 （1）指形管；（2）电烙铁；（3）玻璃纸；（4）脱脂棉；（5）棉线；（6） 天平。 1．在指形管内装入脱脂棉，松紧要适宜，并与一段绑扎的线一起在天平上称 重,记录重量。 2．将待测植株地上部离地面2—3cm处用锋利的刀切去，然后立刻将上述准备 好的指形管套上，用线扎紧，以免使伤流液蒸发掉（注意务必使套管内脱脂棉与 植株切口密切接触）。 3．经过一段时间后取下套管，开口端用棉线扎紧，在天平上称重，测定前后 称量之差即为伤流量，求出单位时间内的伤流量。 30 植物的根系是肥水的主要吸收器官，又是很多物质同化、转化和合成的器官， 因此，根的生长情况和活动能力直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量 水平。本实验练习测定根系吸收面积的方法，为植物营养研究提供依据。 根据植物矿质吸收的理论，认为植物对溶质的最初吸收具有吸附的特性，并 假定这时在根系表面均匀地复盖了一层吸附物质的单分子层。因此能根据根系的 某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。常用甲烯蓝作为被吸附物质，它的被吸 附量可以根据溶液浓度的变化用比色法准确地测出。已知1毫克甲烯蓝成单分子层时占用1.1平方米的面积。据此即可求出根系的总吸收面积。当根系在甲烯蓝溶液 中已达到吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来的物质吸收到细 胞中去，因而继续吸附甲烯蓝。而后根据吸附量求出活跃吸收面积，可作为根系 活力指标。 1、植物材料：最好用水培植物的根，如用砂培植物的根，在冲洗石英砂时应 十分小心，以免将根系折断或伤害。 2、仪器与用具： （1）581G型光电比色计或721分光光度计1台；（2）小磁杯或小烧杯三只；（3）50或100毫升量筒一个（依根系大小确定）；（4）刻度吸管，1ml 1支，10ml 1支；（5）试管（15?150毫升）10支；（6）量瓶，100ml 1个，1000ml 1个；（7） 吸水纸适量；（8）试管架1个。 3、试剂： 31 （1）0.0002N甲烯蓝溶液。 精确称取64mg甲烯蓝在烧杯中加水溶解，转入1000ml量瓶中，加水定容，摇 匀即成。此溶液每ml含有甲烯蓝0.064mg。 （2）每毫升含0.010毫克的甲烯蓝溶液。 用刻度吸管吸取0.0002N甲烯蓝15.6毫升放入100毫升量瓶中，加水至刻度， 摇均即成。 （1）甲烯蓝溶液标准曲线的制作： 取试管7支，用玻璃铅笔编号，按下表次序加入各溶液，即成甲烯蓝系列标准 液： 试管号 1 2 3 4 5 6 7 每ml含0.010mg的甲烯蓝溶液 0 1 2 4 6 8 10 加入量（ml） 水（ml） 10 9 8 6 4 2 0 相当于甲烯蓝的浓度（mg/ml） 0 0.001 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 以第一管（水）为对照在光度计下比色，读出光密度（波长660毫微米），以甲烯蓝浓度为横坐标，光密度为纵坐标绘成标准曲线。 （2）取根系（待测植物根系）用排水法在量杯或量筒中测定其根系体积。 （3）把0.0002N甲烯蓝溶液（每毫升溶液中含有0.064毫克甲烯蓝）分别倒在 三个编号磁杯里（或烧杯里）磁杯中溶液量约10倍于根的体积，准备记下每杯的 溶液用量。 （4）取根系，用吸水纸小心吸干数次，慎勿伤根，然后顺序地浸入盛有甲烯 蓝溶液的磁杯中，在每杯中浸1.5分钟。注意每次取出时都要使甲烯蓝溶液从根上 流回原磁杯中。 （5）从三个磁杯中各取1ml溶液加入试管，分别稀释至10倍，用电光比色计测得其光密度，查标准曲线，求出每杯浸入根系后溶液中剩下的甲烯蓝毫克数。 32 测定根系吸收面积记载表 杯中甲开始时甲浸根后溶液被吸收的甲根吸收面活跃吸根体 比面积 2） 收面积积烯蓝溶烯蓝浓度浓度（毫克/烯蓝量（毫积（m作 3液量（毫（毫克/毫毫升） 克） (％) (cm物) 升） 升） 名磁杯 磁杯 活活总总称 跃跃的 的 1 2 3 1 2 3 的 的 （6）把结果记录下来，并依据下式求出根的吸收面积： 2,,,,总吸收面积（m）,（C,C'），V，（C,C'），V，1.1 111222 2,,(C,C')，V，1.1活跃吸收面积（m）= 333 22活跃吸收面积（%）=[活跃吸收面积（m）/总吸收面积（m）]?100 23比表面=根的总吸收面积（m）/根的体积（cm） C——溶液原来浓度（mg/ml） C'——浸根后的浓度（mg/ml） V——溶液量（ml） 1，2，3为编号(磁杯) 33 将带叶的枝条插在装满水的滴定管里，叶子仍不断地进行着蒸腾作用。蒸腾 作用的强弱因植物的种类而不同，并受外界因子所影响（温度、湿度、光照等）。 滴定管内水的体积减少的数量反映出蒸腾的强弱。 1. 滴定管（25ml）；2. 橡皮塞；3. 铁架与铁夹；4. 小橡皮管与夹子；5. 管温度计。 1. 选取一个适于滴定管口的橡皮塞，打一小孔（枝条插入小孔内便不会漏水）。 2. 选适合的橡皮管剪取3—4cm，紧套在滴定管尖端上用夹子夹紧橡皮管使其 不漏水。 3. 滴定管内灌满冷开水。选取棉花、烟草的带叶枝条浸在水中剪下，以免导 管内进入空气。把此枝条插入滴定管上的橡皮塞孔中，伸入管内约5cm左右。将滴定管倒置，使之不滴水，调节管内水位达到最高刻度。 4. 先把滴定管倒置固定在铁架上。然后把铁架放于测定的环境中（如不同光 强和风速），再除去橡皮管与夹子，并记下水位刻度和水位开始移动的时间。 5. 每隔一定时间观察并记录水位刻度。用半导体点温计测定叶面温度并记录。 6. 24小时后作最后一次观察和记录，然后将枝条上叶子全部剪下，用重量法 计算出每一个枝条上总的叶面积。 蒸腾强度按以下公式计算： W a,ts 34 2a 为蒸腾强度，单位为g/m?小时。 t 为时间，单位为小时。 2 s 为叶面积，单位为m。 叶面积的测定计算如下： 将100cm的称量纸称量为W，将从枝条上剪取下来的每片叶子，按实际大小用1 铅笔在称量纸上描下来，然后称取重量为W，则枝条上总叶面积： 2 W22，100cm S= W1 蒸腾作用与植物水分生理关系密切，蒸腾的快慢与矿质盐在植物体内运输的 速度以及叶温等都有关系，蒸腾强度还可作为确定需水程度的重要指标，因而常 有研究的必要，本实验练习在自然条件下测定蒸腾强度的方法，为进一步研究作 物的水分生理特性准备条件。 植物蒸腾失水重量减轻，因此可用称重法测得一定叶面积（或一定叶片重量） 在一定时间内所失水量，以示蒸腾强度，离体快速的称重法能在自然条件下进行。 植物枝叶虽剪离母体，但短时间内在生理上尚无明显变化，测得蒸腾强度与实际 情况近似。本法的缺点是必须损耗植物材料，不能连续测量和自动记录较长时间 内的蒸腾强度。 快速称重最好是用托盘式扭力天平，该天平灵敏度高且称量范围大（0.01— 100g），称重快速，能随时监测植物材料重量变化。如无托盘式扭力天平，也可 将较灵敏的普通托盘天平稍加改制使用。 35 a. 托盘天平；b. 镊子一把；c. 剪刀一把；d. 三角瓶一个；e. 带孔橡皮塞；f. 任何植物带柄叶子或小枝条 1. 剪下带柄叶子或小枝条，称其重，记录W。 1 2. 将三角瓶装上适量的水、盖上带孔的橡皮塞，将预先准备好的叶子或枝条 通过带孔的橡皮塞插入三角瓶的水中，封闭。擦干三角瓶外的水，称重，记录其 重量W。 2 3. 在室内或室外放置1—2小时后称其重，记录其重量W。 3 4. 用W减去W即为蒸腾的水量。 23 5. 可用下面两种方法求得蒸腾强度。 （1）用透明方格板计算所测叶子和枝条的叶面积（平方厘米），按下式计算 蒸腾强度（计算成平方米叶面积每小时蒸腾水分的克数）。 蒸腾失水量（克）*60000 蒸腾强度（克/平方米叶面积?小时）= 叶面积（平方厘米）*测定时间（分） （2）针对树之类不便计算叶面积的植物可用称原始鲜重的方法，求得蒸腾强 度（每克叶片每小时蒸腾水分毫克数）。 蒸腾水量（毫克）60 蒸腾强度= ，组织鲜重（克）测定时间 一般植物也可以鲜重为基础计算蒸腾强度，但应将嫩梢计算在蒸腾组织的重 量之内。 36 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质。本实验学习植物 中叶绿体色素的提取、分离，了解叶绿体色素的重要理化性质，定量分析的原理 和方法。 1、溶解性：叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用乙醇或丙 酮提取。 2、分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。纸层析是其中较简单的一 种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时由于混合色素中各种成分在两相中（即流 动相和固定相）间有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成 分得到分离。 3、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 4、皂化反应：叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐， 就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 2++2+5、取代反应：在酸性和加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg可依次被H和Cu取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 ？ ？ 6、定量分析，叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645 ？ 和663用于定量叶绿素a，b。 ？ 1、实验材料：小麦、菠菜等植物的叶片 2、仪器：（1）电子天平 （2）分光光度计（3）层析缸 37 取鲜叶3g+100%丙酮10ml，磨成匀浆 , 观察荧光现象： 过滤入三角瓶，洗净滤纸上 透射光 色，反的叶绿素，并定容至25ml 射光 色。 色素分离叶绿素定量测皂化反应：加KOH 加醋酸约2ml，（如下） 定：适当稀释提数片剧烈摇匀，加变（ ）色， 取液，用分光光石油醚5ml和为（ ）叶绿素；度计分别在波H O1ml，分层后观取1/2加醋酸铜2长645、663nm察，上层呈（ ）粉加热变（ ） 下测吸光度，以色，为（ ）；下层色，为（ ）丙酮为对照。 呈（ ）色，为叶绿素。 （ ）。 色素分离方法：取一直径略大于培养皿的圆形滤纸，用吸管吸取样品滴于滤纸 的中心处一滴，风干或烤干，在原位置重复七次。取另一宽约1cm的长条滤纸，搓成纸芯后从样品点中心穿过，使纸芯与圆形滤纸垂直。在培养皿内放一小铝盒， 平放在培养皿上，盒内加适量汽油并加入1-2滴苯，把已处理好的滤纸芯下端浸 入汽油中，迅速盖好培养皿盖，此时汽油借毛细管引力顺纸条扩散到圆形滤纸上， 并把叶绿素沿着滤纸向四周推动，不久即可看到被分离的各种色素的同心圆环。 • C=12.7OD-2.69 OD a(mg/L)663645 • C =22.6OD-4.68 OD b(mg/L)645663 C*提取液总量*稀释倍数• 叶绿素含量(mg/g.FW)= 叶片重量*1000 38 改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取下置于暗处，另一部分则留 在光下进行光合作用，过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同等面积， 分别烘干称重，因为对称叶片的两对应部位的等面积的干重原来相等，光照后叶 片重量超过暗中的叶重、超过部分即为光合作用产物的重量，并通过一定的计算 可得到光合作用强度。 剪刀 分析天平 称量皿 烘箱 刀片 金属模板 纱布 锡纸 三氯乙酸 1．选择测定样品 在田间选择有代表性的植株叶片（如叶片在植株上的部位、叶龄、受光条件 等）20片，用小纸牌编号。 2． 叶子基部处理 为了不使选定叶片中光合作用产物往外运而影响测定效果的准确性可采用下 列方法进行处理。 （1）可将叶片输导系统的韧皮部破坏。如棉花等双子叶植物的叶片可用刀片 将叶柄的韧皮部环割0.5厘米左右宽。 （2）如小麦、水稻等单子叶植物，由于韧皮部和木质部难以分开处理，可用 刚在开水中浸过的纱布或棉花做成夹子在叶子基部烫伤一小段即可（一般90?以 上的开水烫20秒）。 39 （3）由于棉花叶柄木质化程度低，叶柄易受折断。用开水烫又难以掌握烫伤 的程度，往往不是烫得不够便是烫得过重使叶片下垂、改变了叶片的角度。因此 可改用化学方法来处理，选用适量浓度的三氯乙酸点涂叶柄以阻止光合产物的输 出。三氯乙酸是一种强烈的蛋白质沉淀剂，渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死而 起到阻止有机物质运输的作用。三氯乙酸的浓度视叶柄幼嫩的程度而异，以能显 著灼伤叶柄而又不影响水分供应，不改变叶片角度为宜。一般使用5%的三氯乙酸。为了使烫后或环割等处理后的叶片不致下垂影响叶片的自然生长角度可用锡纸或 塑料管包围之，使叶片保持原来生长角度。 3．剪取样品 叶基部处理完毕后，即可剪取样品，记录时间，开始进行光合作用测定。一 般按编号次序分别剪下对称叶片的一半（主脉不剪下），按编号顺序夹于湿润的 纱布中，贮于暗处。过四、五小时后，再依次剪下另外半叶，同样按编号夹于湿 润纱布中，两次剪叶的速度应尽量保持一致，使各叶片经历相等的光照时间。 4．称重比较 将各同号叶片两半按对应部位迭在一起，在无粗叶脉处用已知面积的打孔器 取小圆叶片数个分别置于光照及暗中的两个称量皿中，在80-90?下烘至恒重（约5小时），在分析天平上称重比较。 5．计算结果 222 叶片干重差之总和（以mg表示）除以叶片面积（换成dm，1dm=100cm）及 2光照时数，即得光合作用强度，以干物质mg/dm?h表示之。计算公式如下： 干重增加总数（mg）光合强度= 叶面积总和（dm2）*光照时间 由于叶片内贮存的光合产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘系数 21.5，得二氧化碳同化量，单位为COmg/dm?h。 2 40 呼吸强度是植物生命活动最重要的指标之一，在植物生理研究及生产实践等 方面都有测定的必要。本实验练习用广口瓶法（小篮子法）测定呼吸强度的技术， 并了解不同条件对呼吸强度的影响。 植物进行呼吸放出CO，计算一定的植物材料在单位时间内放出CO的数量，即22能测知该植物材料的呼吸强度。呼吸放出的CO可用氢氧化钡溶液吸收，再用滴定2 法测得之。如比较不同条件下的呼吸强度，则可得知不同条件对呼吸强度的影响。 1、植物材料：（1）干小麦种子；（2）发芽的小麦种子；（3）浸湿但未发芽的小麦种子。 2、仪器与用具：（1）广口瓶测呼吸装置一套，（2）托盘天平1架；（3）酸滴定管及碱滴定管各1支；（4）滴管架1套；（5）恒温水浴锅1具。 3、试剂：（1）1N的草酸溶液（每ml 1N草酸相当于1mgCO）；（2）0.1N氢2氧化钡溶液；（3）酚酞指示剂。 1、呼吸强度的测定： （1）取500ml广口瓶一个，加一个一孔橡皮塞。孔直径约1厘米，供滴定用之，平时用一个小橡皮塞塞紧，瓶塞下面挂一铁丝小篮，以便装植物材料。整个装置 可称“广口瓶测呼吸装置”。 （2）在瓶中准确加入0.1N的氢氧化钡溶液20毫升，立即塞紧橡皮塞（不带小 篮）。充分摇动广口瓶几分钟，待瓶内全部CO被吸收后，拔出小橡皮塞加入酚酞2 试剂3滴，把滴定管插入孔中，1/22N草酸溶液进行空白滴定，直至红色刚刚消失 为止。 （3）倒出废液，用无CO的蒸馏水（煮沸过的）洗净后，重加同一氢氧化钡2 溶液20ml，同时称取植物材料（发芽的小麦种子）5克，装入小铁丝筐中，挂于橡 41 皮塞下，把塞子盖在瓶上，开始记录时间，经20—30分钟，其间轻轻摇动数次， 使溶液表面的碳酸钡薄膜被破坏而利于CO的充分吸收。到预定时间后，轻轻开塞，2 把装有植物材料的小篮子迅速取下立即重新塞紧，充分摇动2分钟，使瓶中CO完2全被吸收，然后拔出小橡皮塞，加入酚酞3滴，用草酸滴定如前。注意防止口中呼 出气体侵入瓶内。 （4）计算呼吸强度（每克组织每小时放出CO毫克数）： 2 空白滴定值（ml）,正式滴定值（ml）]*草酸浓度（N）*CO2当量呼吸强度（毫克CO/克组织?小时）= 2植物组织重（g）*时间（小时） 2、不同条件对呼吸强度的影响： （1）用前面描述过的大小一致的呼吸瓶四个（可四个实验小组联合作），进 行如上处理： ? 加干种子100粒（小麦或其它种子，以下相同）在30?恒温水浴锅上： ? 加入浸湿种子100粒，在30?恒温水浴锅上； ? 加催芽种子100粒，在30?恒温水浴锅上； ? 加催芽种子100粒，在10?左右室温下。 （2）30分钟后，轻轻从呼吸瓶中取出种子，然后用草酸滴定如前，并用下式 计算各瓶呼吸强度（100粒种子1小时内放出CO毫克数）： 2 [空白滴定值（ml）,正式滴定值（ml）]*草酸浓度（N）*CO2当量呼吸强度（mg.CO/100粒种子?小时）= 2测定时间（小时） （3）把不同处理的测定结果记于下表，并加以解释。 呼吸强度测定记录表 材料量测定时间空白滴定值正式滴定值 处理号 处理方式 呼吸强度 （粒） （分钟） （ml） （ml） 1 干种子30? 100 2 湿种子30? 100 3 催芽种子30? 100 4 催芽种子10? 100 42 植物抗逆性的研究，在科研上有一定重要性，与生产关系也很密切，因此抗 逆性的大小常有测定的必要。本实验练习根据电导度变化来测定细胞透性变化（透 性变化能反应抗逆性大小）的技术，并观察干旱、高温等因子对细胞透性的影响， 为深入开展抗逆性的研究提供条件。 当植物组织受干旱或其它不良条件如高温、低温等影响时，常能伤害原生质 体的结构而引起透性增大，结果细胞内含物将有不同程度的外渗，使外渗液的电 导度增大，用电导仪即可明显地测定出来，透性变化愈大，表示受伤愈重、抗性 愈弱。 1、植物材料：小麦、玉米或其它作物叶片。 2、仪器与用具：（1）电导仪（DDS-11型或DDS-11A型）1台；（2）分析天平（感量万分之一）1台；（3）温箱1个；（4）真空泵1台；（5）真空干燥器1个；（6）恒温水浴锅1个；（7）烧杯、50毫升10只；（8）量瓶：100毫升6个，1000毫升1个；（9）玻璃蒸馏器或离子交换纯水器1套；（10）玻棒10根；（11）滤纸若干；（12）洗瓶1个；（13）解剖剪1把。 3、试剂： （1）重蒸馏水或无离子水； （2）100ppm氯化钠标准液：取分析纯氯化钠100毫克，先溶于少量无离子水或 重蒸馏水中，用1000毫升量瓶定容并摇匀； （3）硫酸-重铬酸钾洗涤液适量。 1. 清洗用具，由于电导变化极为灵敏，稍有杂质即产生很大误差，故清洗为 43 重要步骤，所以玻璃用具均需先用肥皂洗，再用新配洗涤液洗，然后用自来水、 无离子水（或重蒸馏水）各洗四五遍（最后容器向下用水冲），然后倒置于洗净 而垫有洁净滤纸的盘中，上用洁净纱布或玻璃板覆盖，需要干的可入烘箱烘干。 2．作标准曲线：如需要定量测定透性变化，可用分析纯NaCl配成0，10，20，40，60，80，100ppm的标准液，在20～25?恒温下用电导度测定，读出电导数， 并作成标准曲线，如只需定性，则作标准曲线这一步可以省去。 3．准备试验材料： 选用小麦或其它植物一定部位生长及叶龄相似的叶子若干，剪下后先用纱布 洗拭净，取2份，各重2克，一份在40?温箱内萎蔫半至1小时，一部分插入水杯中 做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗两次，并用洁净滤纸吸干，然后剪成长约1厘米的小段，放入硬质小玻璃杯中（大小能容电极为度），并用玻棒压住，在烧杯中 准确加入10-15毫升无离子水浸没叶片。然后放入真空干燥器，用抽气机抽气7-8分钟，以抽出细胞间隙中的空气。然后缓缓放入空气，水即被渗入组织中而使叶 片变成半透明状。注意在整个过程中，叶片及与叶片接触的用具必须绝对洁净， 也不应用手直接接触叶片，以免污染。此外还应防止口中呼出的CO溶于杯中。 2 4．把盛有叶片的水杯放入恒温水浴中：维持水温20-25?，1小时后，用洁净玻璃棒轻轻搅拌，然后轻轻夹出叶片，仍在原温度下用电导仪测定，记录读数。 与标准曲线对比，即可求出溶液渗出的电解质相当于NaCl的ppm数。另用不加叶片而同样处理的水杯作空白测定。由正式测定减去空白测定的数值，即为叶子外渗 量。如只作定性测定，则用二处理直接比较即可。比较经萎蔫处理及对照的测定 结果，可知干旱高温的影响。测定致少要有三个重复。 44 当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反 映了植物体内的水分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。 用人造沸石(Permutit)在pH1-7范围内振荡溶液可除去干扰的氨基酸或使其 不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯 柄氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色的深浅呈 正相关，可用分光度计测定。该法有专一性。 （1）721分光光度计；（2）水浴锅；（3）离心机；（4）移液管；（5）烧杯；（6）容量瓶；（7）研钵；（8）冰醋酸；（9）具塞试管；（10）脯氨酸；（11）80%乙醇；（12）茚三酮试剂：将2.5g茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml 6M磷酸中，加热（70?）溶解，试剂至少在24小时内稳定。 1. 绘制标准曲线 取脯氨酸溶于80%乙醇中，然后稀释成下列浓度：0、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15、20、25、30μg/ml。分别取标准溶液2ml，冰醋酸2ml，茚三酮试剂2ml加入试管中，用橡皮塞塞紧，于沸水浴中加热15分钟。用分光光度计于波长515nm下进行比色测定，以浓度0为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光 密度为纵坐标作标准曲线。 2. 植株样品液的提取 选取植株功能叶片2g，用3ml 80%乙醇研磨（放少许石英砂），成浆状，用80%乙醇洗研钵，将提取物和洗液置于试管中，80%乙醇总量为10ml。加盖置于黑暗中室温下提取24小时或水浴。 将提取液在放有活性炭的滤纸上进行过滤，重复过滤一次，除去色素和残渣。 45 将提取液置于试管中，加其重1/5的人造沸石强烈振荡5分钟。将上层液在离心机上离心10分钟，取上清液备用。 3. 样品溶液的测定 将离心后所得上清液，取2ml置于试管中，再加入2ml冰醋酸和2ml茚三酮试剂， 加盖密封，在沸水浴上加热15分钟。用3ml 80%乙醇代替样品液作对照。在分光光度计上用515nm进行比色测定。读出光密度后，从坐标曲线上求出样品溶液中脯氨 酸含量。 4. 结果计算： a(ug/ml)*10-3 脯氨酸含量（mg/g）= ?10 2 5. 问题：脯氨酸和植物缺水程度有何关系？ 46