溶血卵磷酯对内皮细胞CD73的调节作用
====================================================================== 【关键词】 腺苷 内皮细胞 胞外核苷酸酶
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材料
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和方法
1.1材料
细胞培养皿、培养液及细胞柱购自Promocell公司;试验所用试剂乙烯单磷酸腺苷(eAMP)、溶血卵磷脂(LPC)、白屈菜赤碱、AOPCP (αβ甲基腺苷二磷酸)、硝基苄基硫代次黄嘌呤核苷)购自 Sigma 公司.
1.2方法方法
所得第三代PAEC用于实验. 采用Deussen等,1, 首先 分离培养PAEC,
描述的细胞柱方法,分析测量PAEC的腺苷分泌. 本文进行两组实验,每组采用10个细胞柱. 每3 min持续收集一管流出液,每组观察对象收集5管流出液.
5 μmol/L),腺苷膜转运抑制剂(NBTI,1 一组细胞柱中先后泵入eAMP(
μmol/L), LPC(25 μmol/L) 及胞外外核苷酸酶抑制剂(AOPCP,50 μmol/L). 另一组细胞柱按顺序泵入以下试剂:eAMP(5 μmol/L),NBTI(1 μmol/L),蛋白激酶C(PKC)抑制剂白屈菜赤碱(100 μmol/L),LPC(25 μmol/L). 应用高性能液相色谱仪(HPLC)测定腺苷及乙烯腺苷含量. 提取细胞柱中所有的PAEC,以Lowry 等,,,所描述的方法测定其蛋白含量.
2结果
两组细胞柱在仅泵入eAMP时细胞柱中PAEC合成产生内源性腺苷(5.0?1.8) pmol/ min)mg-1. NBTI使此值显著升高至(9.7?3.9) pmol/ min?mg-1 (P<0.001,vs 对照). 第一组细胞柱在泵入 LPC时,此值进一步显著升高至(103.5?36.3) pmol/ min?mg-1 (P<0.001,vs NBTI时). AOPCP使其显著下降至(2.5 ?1.1) pmol/ min?mg-1 (P=0.001,vs LPC时). 同时测得eAMP转换生成eAD的比率在对照情况下为32.7,?16.1%,注入NBTI后,此比率为34.1,?13.2 %,与对照差别无统计学意义(P>0.05,vs 对照). 当泵入LPC后,此比率显著升高至67.2,?12.0% (P<0.001, vs NBTI时). AOPCP使此比率显著下降至2.3,?2.1% (P<0.001, vs LPC时).在另一组细胞柱中,在泵入PKC酶抑制剂白屈菜赤碱后再泵入LPC时,PAEC自身合成腺苷为(15.6 ?7.3) pmol/ min?mg-1,与其前仅泵入NBTI时差别无统计学意义(P>0.05,vs NBTI时).此时eAMP转换生成eAD比率为35.0%?2.8%,与前一情况下相比差别亦无统计学意义(P>0.05,vs NBTI时).
3讨论
近年来有研究
表
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明腺苷参与缺血预适应及后适应,有极强的心脏保护作用
,3,,从而使体内腺苷的分泌及其调节受到人们广泛的关注. 然而由于腺苷可
经细胞膜在细胞内外之间转运,且在细胞内迅速代谢,难以准确测定细胞外腺
苷合成变化,故关于胞外腺苷分泌及CD73活性调节的数据较少. 本研究采用
AMP及腺苷的相似化合物eAMP对CD73活性进行观察. 结果显示,NBTI抑制腺
苷的膜转运后,腺苷分泌率较生理情况下升高近一倍,表明生理状态下,细胞
外生成的腺苷近一半被转运入细胞. 其原因可能为细胞内腺苷快速代谢,造成
细胞内外腺苷浓度阶差,使细胞外腺苷顺此阶差转入细胞内. 此结果与本研究
小组对人脐静脉内皮细胞的研究结果一致,4,. 而泵入NBTI后eAMP转换生成
eAD的比率与模拟生理情况下相比无改变,表明eAMP及由其经CD73转换生成
腺苷不能转运入细胞膜,注入eAMP后测定生成的乙烯腺苷可很好地的乙烯
反映CD73的活性. 给予PKC兴奋剂LPC,使PAEC合成内源性腺苷及eAMP转换
生成eAD的比率均显著增加,表明LPC可以兴奋CD73,显著增加细胞外腺苷分
泌. 本研究在10个细胞柱试验中以白屈菜赤碱抑制PKC后,再观察LPC对
CD73活性的影响. 结果显示此时LPC对CD73的兴奋作用被消除,PAEC自身腺
苷分泌率及eAMP转换生成eAD的比率与泵入LPC前无显著变化. 从而进一步证
明LPC兴奋CD73的作用是通过PKC而产生. 在泵入AOPCP使细胞的自身腺苷分
泌率及eAMP生成eAD的转换率显著降低,进一步证明细胞外腺苷是经CD73合
成的.
通过本实验,我们得出以下结论:(1)PAEC腺苷细胞内代谢非常迅速,
从而使生理状态下腺苷由细胞外转入细胞内;(2)LPC可兴奋PAEC细胞外
核苷酸酶,增加腺苷分泌;(3)LPC兴奋CD73的作用与PKC有关.
【参考文献】
,1,Deussen A, Bading B, Kelm M, et al. Formation and salvage
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,3,Morrison RR, Tan XL, Ledent C, et al. Targeted deletion of
A2A adenosine receptors attenuates the protective effects of
myocardial postconditioning,J,. Am J Phsiol Heart Circl Physiol, 2007, 293(4):H2523-9.
,4,张群英,Deussen A.人血管内皮细胞中腺苷代谢的定量研究,J,. 中
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