各种DNA提取方法

中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 各种 DNA提取 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 一，基因组 DNA提取方法 制备基因组 DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 得到的 片段的长度不小于 100-200kb。在 DNA提取过程中应尽量避免使 DNA断裂和 降解的各种因素，以保证 DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是 CTAB 方法，其他的方法还有 1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方 式：异硫氰酸胍法碱裂解法 3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有: 硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的 PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤 2再重新作一 边。 3、加入 5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS) 混匀。 4、加入 25ul蛋白酶 K使终浓度达到 100ug/ml混匀，50℃水浴 3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯 仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的 5mol/L的 LiCL混匀， 冰浴，10min.。 7、2500rpm离心 10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温 10min。 2500rpm离心 10min。弃上清。 8、加入 0.1倍体积 3mol/L乙酸钠(PH5.2)与 2倍体积-20℃预冷无水乙醇。 -20℃20min。 9、12000r/min室温离心 5min。弃上清。将 DNA溶于适量 TE中。 二，外周血 DNA提取技术 分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血 5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心 10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到 3个 0.5ml离心管中。 3、在血细胞中加入 3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴 15min。 4、2500rpm离心 10min，弃上清。 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 5、加入 10ml溶血液，摇匀，冰浴 15min。 6、3000rpm离心 10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过 2h，4℃放置不超过 5h， 以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组 DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer： 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA 0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至 1000ml，高压灭菌。 ACD抗凝剂：柠檬酸 1.68g柠檬酸钠 4.62g葡萄糖 5.15g；最后加灭菌去 离子水至 350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）： 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mM EDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至 100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在 500μl抗凝血中加入 ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以 4000rpm， 离心 5min。弃上清液。 2、沉淀中加入 ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以 6000rpm，离心 5min。 3、彻底弃去上清，加入 extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于 37 ℃，水溶 1h。 4、加入 8μl的蛋白酶 K，颠混，37℃过夜（或 55℃，3h，但是 37℃效果 要好些）。 5、每管加入 450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃 10min，以 5500rpm， 离心 15min。 6、取上清，每管加入 250μl饱和酚和 250μl氯仿－异戊醇，摇匀 10min， 以 5500rpm，离心 15min。 7、取上清，每管加入 500μl氯仿－异戊醇，摇匀 10min，以 5500rpm，离 心 15min。 8、取上清，每管加 50μl的 3M的 NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满， 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 摇匀放入-20℃保存 2h以上。 9、以 12000rpm，离心 20min。去上清，加入 70％乙醇 500μl，以 12000rpm， 离心 5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入 50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul于 eppendorf管中，12000rpm离心 12min。 2、弃上清，加双蒸水 200ul溶解，摇匀 20s。 3、混匀后加 6MNaI溶液 200ul，摇匀 20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀 20s，12000rpm离 心 12min。 5、取上层液 350ul，加入另一新 eppendorf管中，加 0.6倍体积异丙醇， 摇匀 20s，室温放置 15min，静置后的反应体系 15000rpm离心 12min，使沉淀 紧贴 eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加 70％乙醇 1ml（不振动），以 15000rpm离心 12min。 7、弃乙醇，敞开 eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加 1xTE溶液 30ul，溶解 DNA＞12h以上，制成的 DNA液-20℃冰箱保存备用。 五，常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理： 苯酚/氯仿提取 DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性， SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶 K、EDTA的存在下消化蛋白质 或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使 DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶 于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用， 并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶 体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离 心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两 相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相 与有机相分离和除去 DNA溶液中的酚。抽提后的 DNA溶液用 2倍体积的无水 乙醇在 1/103mol/LNaCl存在下沉淀 DNA，回收 DNA用 70%乙醇洗去 DNA沉 淀中的盐，真空干燥，用 TE缓冲液溶解 DNA备用。 试验步骤： 1、将 1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入 5ml离心管中，加入 1ml 磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心 15min倾去含裂解红细胞的上 清。重复一次。用 0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育 1h。 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 2、将上述 DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育 1h后，加入 1mg/ml蛋 白酶 K0.2ml至终浓度为 100-200ug/ml上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴 保温 3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应 液。 3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心 管 5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心 15min，用大口吸管 小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿 ﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000rpm离心 15min，用大口吸管小心吸 取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4、加入 1/5体积的 3mol/LNaAc及 2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢 慢摇动离心管，即有乳白色云絮状 DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的 DNA， 转入另一 1.5ml离心管中，加 70%乙醇 0.2ml，以 5000rpm离心 5min。洗涤 DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让 DNA 完全干燥。加 TE液 20ul溶解 DNA置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通 常需 12-24h。制成的 DNA液-20℃冰箱保存备用。 六，真核细胞 DNA的制备 一般真核细胞基因组 DNA有 107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温 保存的组织细胞中提取，常是采用在 EDTA以及 SDS等试剂存在下用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的 DNA不仅经酶切后可用于 Southern分析，还可用于 PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的 DNA提取方法大体 类似，但都应考虑以下两个原则： 1、防止和抑制 DNase对 DNA的降解。 2、尽量减少对溶液中 DNA的机械剪切破坏。 试剂准备： 1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。 2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。 3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶 K至 100mg/ml。 4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶 K 6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤： 材料处理： 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 1、新鲜或冰冻组织处理： 1)取组织块 0.3-0.5cm3剪碎，加 TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 2)将匀浆液转移到 1.5ml离心管中。 3)加 20%SDS25ml，蛋白酶 K(2mg/ml)25ml，混匀。 4)60 C水浴 1-3hr。 2、培养细胞处理： 1)将培养细胞悬浮后，用 TBS洗涤一次。 2)离心 4000g 5min，去除上清液。 3)加 10倍体积的裂解缓冲液。 4)50-55 C水浴 1-2hr。 DNA提取： 1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀 3min。 2、离心 5000g 10min，取上层水相到另一 1.5ml离心管中。 3、加等体积饱和酚，混匀，离心 5000g 10min，取上层水相到另一管中。 4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心 5000g 10min，取上层水相到另一管 中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心 5000g 10min，取上层水相到另一管中。 6、加 1/10体积的 3M醋酸钠（pH5.2）和 2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒 置混匀。 7、待絮状物出现后，离心 5000g 5min，弃上清液。 8、沉淀用 75%乙醇洗涤，离心 5000g 3min，弃上清液。 9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加 50-100mlTE溶解过夜。 七，植物组织中 DNA的提取 试验原理： 脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成 分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取 DNA的常规技术之一。从细胞中分离 得到的 DNA是与蛋白质结合的 DNA，其中还含有大量 RNA，即核糖核蛋白。 如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于 0.14mol/L的 NaCl 溶液中，而 RNA则能溶于 0.14mol/L的 NaCl溶液之中，利用这一性质就可以 将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有 Dnase释放 到提取液中，使 DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸 盐和 EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 去垢剂 0.15％的 SDS，经过 2h搅拌，或用氯仿－ 异醇除去蛋白，通过离心使 蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用 95％的预冷乙醇即可 把 DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。 植物 DNA的 SDS提取法： 试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取 59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na 分别溶解后合并为一，用 0.2mol/L的 NaOH调至 pH7.0，并定容至 1000ml。 2、10 SSC溶液：称取 87.66gNaCl和 44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一 起定容至 1000ml。 3、1 SSC溶液：用 10 SSC溶液稀释 10倍。 4、0.1 SSC溶液：用 1 SSC溶液稀释 10倍。 5、Rnase溶液：用 0.14mol/LNaCl溶液配制成 25mg/ml的酶液，用 1mol/LHCl，pH至 5.0，使用前经 80℃水浴处理 5min（以破坏可能存在的 Dnase）。 6、氯仿－异戊醇：按 24ml氯仿和 1ml异戊醇混合。 7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取 NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水 溶解再容至 100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将 SDS放入无水酒精中 达到饱和为止，然后在 70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液 放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol／LHCl。 10、0.2mol/LNaOH。 11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于 100ml冰醋酸中，添加 1.5ml浓硫 酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加 0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V ／V）］。 12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13、0.05mol/LNaOH。 14、DNA 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 液：取标准 DNA25mg溶于少量 0.05mol.L-1NaOH中，再 用 0.05mol/LNaOH定容至 25ml，后用移溶管吸取此液 5ml至 50ml容量瓶中， 加 5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用 0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得 100μg/ml的标准溶液。 实验步骤： 1、称取植物幼嫩组织 10g剪碎置研钵中，加 10ml预冷研磨缓冲液并加入 0.1g左右的 SDS，置冰浴上研磨成糊状。 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 2、将匀浆无损转入 25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液， 加上塞子，剧烈振荡 30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以 4000rpm 离心 5min。 3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞 碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 4、将试管置 72℃水浴中保温 3min（不超过 4min），以灭活组织的 DNA 酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加 5mol/L高氯酸钠溶液［提取 液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为 1mol/L。 5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡 1min，静置后在 室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。 6、用滴管吸 95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙 醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕 在玻璃棒上。 7、然后加入 0.5ml左右的 10 SSC，使最终浓度为 1 SSC。 8、重复第 6步骤和第 7步骤即得到 DNA的粗制品。 9、加入已处理的 Rnase溶液，使其最后的作用浓度为 50～70μg/ml，并在 37℃水浴中保温 30min，以除去 RNA。 10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡 1min，再除去残 留蛋白质及所加 Rnase蛋白，室温下以 4000rpm离心 5min，收集上层水溶液。 11、再按 6、7步骤处理即可得到纯化的 DNA液。 八，植物 DNA的 CTAB提取法： 试验步骤： 1、称取新鲜叶片 2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。 2、将粉末转移到加有 7ml经预热的 15 CTAB提取缓冲液 15ml离心管中， 迅速混匀后置于 65℃水浴中，温育 30min。 3、取出离心管冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下 2300 转离心 20min。 4、将上清转移至另一新的 15ml离心管中，加入 1/10体积 10%的 CTAB 和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心 20min。 5、转移上清至另一新的 15ml离心管中，加入等体积 1%的 CTAB沉淀缓冲 液，轻轻摇晃至形成 DNA絮状沉淀。1000rpm离心 10min，使 DNA沉淀于管 底。 6、加入 1.5-2ml的 1mol/LNaCl及 5μlRNase置于 56℃水浴中过夜。 7、待 DNA完全溶解后，加 2-3ml4℃预冷的 95%的冰乙醇使 DNA沉淀， 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 挑出 DNA，置于 15ml离心管中，用 70%乙醇清洗 30min。 8、离心机甩 5s，倒出 70%乙醇，再用 95%乙醇浸泡 5min，倒出 95%乙醇， 在超净工作台上吹干。 9、将风干的 DNA直接在 4℃保存备用或溶于 100μlTE溶液中于-20℃保存。 九，细菌 DNA的提取方法 针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂： 抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素） 100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（抑制 RNA酶活性） 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤： 1、抽提缓冲液 65℃预热。 2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以 12000rpm，离心 10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以 12000rpm，离心 10min。 5、重复再作一次步骤 4。 6、加入 1/10体积的 3M醋酸钠和 1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙 醇），－20C下沉淀。 7、以 2000rpm，离心 10min。 8、弃上清，以 70％乙醇条洗沉淀，也可以再用 100％乙醇洗，然后溶解于 100ml水中。 十，较为常用的细菌 DNA提取方法： 实验步骤： 1、将菌株接种于液体 LB培养基，37℃震荡培养过夜。 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 2、取 1.5ml培养物 12000rpm离心 2min。 3、沉淀中加入 567ul的 TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入 30ul10%SDS和 15ul的蛋白酶 K，混匀，于 37℃温育 1h. 4、加入 100ul5mol/LNaCl充分混匀，再加入 80ulCTAB/NaCl溶液，混匀 后再 65℃温育 10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心 4-5min将上清转入一只新管中， 加入 0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到 DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用 1ml的 70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 十一，真菌 DNA提取 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 的两种方法： 第一种方法： 试验步骤： 1、取真菌菌丝 0.5g在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入 4mL提取液，快速振荡混匀。 3、加入等体积的 4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋 3～5min（此处是粗提没 有加酚）。 4、以 4℃，1000rpm，离心 5min。 5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以 4℃，10000rpm，离 心 5min。 6、取上清，加入 2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或 2.5倍体积的无水乙醇 沉淀混匀静置约 30min。 7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用 75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗 1 次吹干，重悬于 500ulTE中。 8、加入 1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理 1h。 9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提 1次。 以 4℃，10000rpm，离心 5min。 10、取上清，加入 1/10倍体积的 3MNaAc2.5倍体积的无水乙醇-70℃沉淀 30min以上。 11、沉淀用 75%乙醇漂洗，风干溶于 200ulTE中，-20℃保存备用。 DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS， 3MNaAc。 第二种方法： 试验步骤： 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 1、真菌菌丝 0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入 3mL65℃预热的 DNA提取缓冲液，快速振荡混匀 65℃水浴 30min 期间混匀 2-3次。 3、加入 1mL5MKAc，冰浴 20min。 4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提 1次（10000rpm，4℃离心 5min）。 5、取上清，加入 2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇混匀静置约 30min。 6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用 75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗 1 次吹干，重悬于 500ulTE中。 7、加入 1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理 1h。 8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提 1次。 以 4℃，10000rpm，离心 5min。 9、取上清，1/10V3MNaAc2.5V体积的无水乙醇-70℃沉淀 30min以上。 10、沉淀用 75%乙醇漂洗，风干溶于 200ulTE中，-20℃保存备用。 十二，石蜡包埋 DNA提取试验方法 试验原理： 从石蜡包埋组织中提取 DNA的基本步骤，是在常规 DNA提取方法的基础 上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织 DNA提取技术， 是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含 SDS和高浓度蛋白酶 K（１ mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得 DNA虽不完 整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实 验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和 脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使 DNA释放和蛋白 去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的 DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的 DNA分子，从而提 DNA质量，适于 做 Sorthern印迹杂交分析。 试验试剂： 配方：3mol/lNacl，0.3M柠檬酸三钠 2H2O，用 HCL调 PH值至 7。0 石蜡消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l柠檬酸钠，1%SDS，PH7.0。 试验步骤： 1、取蜡块切片 15-20张（8μm），置于 eppendorf管中，加入 1ml的二甲 苯，37℃作用 3h，以 10000rpm，离心 3min，倾去二甲苯。重复 3-4次，观察 管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存，需继续脱蜡。 2、剃度酒精水化：加入 100%乙醇 1ml，室温下放置 30min，以 10000rpm 离心 3min，去上清；再依次分别加入 95%；75%；50%的乙醇重复上面的步骤。 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http:www.120.com 3、消化：以 1 SSC500μL加入 SSC洗涤沉淀，以 12000rpm离心 3min。 弃去上清夜，干燥沉淀。加入石蜡消化液 400μL，PK（20mg/ml）20μl；55℃ 消化 120h，第四天，补加 PK10μl。 4、消化后的液体很清亮，肉眼可见的组织较少。将其转入 98℃的水浴箱中， 煮沸 10min，以灭活 PK，取出后置于冰上，使其迅速冷却。以 10000rpm，离 心 5min。 5、取上清加等量的酚-氯仿，轻颠倒混匀呈乳白色。低温下以 14000rpm， 离心 10min。小心取上清，再加入等量的酚-氯仿重复上面的步骤。 6、取上清加入预冷的两倍体积的无水乙醇及 1/10的乙酸钠（PH5.2），颠 倒混匀。置于-20℃，30min。低温下以 14000rpm，离心 10min，去上清。 7、沉淀用 1ml的 70%乙醇洗涤2次，（颠倒 eppendorf管数次）以 14000rpm， 离心 5min，，自然干燥沉淀。 8、加 TE20μl，（含 RNA酶），4℃下过夜。 注意事项： 1、取材时应避免出血坏死的组织，尽可能选用新鲜的标本。 2、消化时应不时震摇离心管，使酶与组织充分接触。 3、福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，匀浆的效果往往不理想，可 将组织切成 10um的薄片进行消化。 4、消化不完全，可采用高浓度蛋白酶 K及延长消化时间。