高水解度大豆肽的制备

了l 度 豆 的 备 (江南大学食品学院，无锡 214036) 王吉庄 钟 芳 王 璋 ■ 一：比较了五种蛋白酶对大豆蛋白质的水解能力，并从中选 出了两个对大豆蛋白具有较强水解能力且价格相对便宜 的酶 ：Alcalase和 AS1．398。通过正 交实验确 定 了二者的最 适反 应条件 ，Alcalase最适 条件 为 ：温度 55oC，pH8，5，底 物／酶 量 比为 80 (g／mL)，4h后 水 解度 可 达 20，42％； AS1．398酶 的最佳条件 ：温度 4ooC，pH7．0，CaCI20．001％， 底物／酶量 比为 40(g／g)，4h后 水解度可达 25，49~,／o。 关■词 ：酶解，大豆蛋白 A ct：The abilitv of five proteinases to hydrolyze soy protein was compared under the same E／S ratio． and the most effective and economical ones were AIcalase and AS1．398． Through o~hogonal experiments， optimal reaction conditions of the two proteinases were determined． F0r AIcalase： temperature 55℃，pH 8．5，substrate／enzyme ratio 80 (g／mL)， and for AS1．398： temperature 40℃ ． pH 7．O， CaC ．001％ ， substrate／enzyme ratio 40 (g／g)．Under the above conditions。after 4 hours． the DH of soy protein hydrolysates attained 20．42％ and 25．49％．respectively． 1 werds：enzymatic hydrolysis；soybean protein 中图分类号：TS201．2 1 文献标识码：A 文 章 编号 ：1002-0306(2003)09-0040-03 目前 市 场 上 出 售 的 大 豆 肽 多 是 粗 水 解 产 物 ，而 没 有 进 行 分 离 、纯 化 ，另 外 其 水 解 度 及 生 理 活 性 也 不 明确 。本 研 究 的最 终 目的就 是 通 过 酶 水 解 制 备具 有 降 血 压 、降胆 固醇 、防 止 骨质 疏 松 和 抗 氧 化 活性 的 肽 ，然后 分 离 纯化 制 得 精 品 。由于 大多 活 性 肽都 是 寡 肽 (一 般 几 个 氨 基 酸 )，因 此 要 在 工 业 上 生 产 具 有 生 理 活 性 的肽 段 就 要求 我 们 X'-t酶进 行 筛 选 时要 尽 可 能 选 用 水 解 速 度快 、水 解 能 力强 的酶 类 ，另 外 考 虑 到 经 济 因素 ，还 要求 酶 的价 格 要相 X'-t便 宜 。本 文 的 目的就 是选 出水 解 反 应 所需 的 酶类 ，并 通 过 正 交 实验 确 定 其最 适 作用 条 件 。 1 材料与方法 1．1 实验材料 大 豆 分 离 蛋 白 黑 龙 江 省 三 江 食 品 公 司 ；胰 蛋 收稿 日期 ：2002—12—26 作者简介：王吉庄(1979一)，男，在读硕士，研究方向：生物技术在食品 中的应用。 白酶 华 美 生物 工程 公 司 ，上 海 ；胃蛋 白酶 华 美 生 物 工 程 公 司 ，上 海 ； 木 瓜 蛋 白 酶 广 西 化 工 学 院 ； Alcalase NOVO 公 司 ；AS1．398 中 性 蛋 白 酶 无 锡 酶 制 剂 厂 ；其 它 化 学 试 剂 均 为 分 析 纯 。 1．2 实验方法 1．2．1 酶活 的测 定旧 采 用改 进 的福 林 酚法 。各个 酶 在 推 荐 的最 适 条 件 下 (见 表 1)，以 酪 蛋 白为 底 物 (胃 蛋 白酶用 牛血 清 蛋 白做 底 物 )进行 测 定 。酶活 力 单位 定 义 为 在 特定 的实 验 条 件 下 ，每 min水 解 酪 蛋 白产 生 1 g氨基 酸 的 酶量 为 一个 酶 活 单位 。 1．2．2 大 豆 蛋 白溶 液 的配 制 及 预 热 处 理 I3J 将 大 豆 蛋 白溶 于水 ，配 成 8％的 溶液 ，并调 整 其 pH 至 7．0，然 后 在 90~C预 热 处 理 30min。 1．2．3 大 豆 蛋 白质 的水 解 将 经 过 预 热 处 理 的大 豆 蛋 白溶 液 的 pH(用 2mo NaOH 或 HCl调 节 )和 温 度 调 至 酶 作 用 的最 适 条 件 (如 表 1所 示 )，加 入 蛋 白 酶 进行 水 解 ，并 采用 pH—star法 控 制体 系 的 pH，待反 应 结束 后 在 1oo℃水浴 中灭 酶 10min。 1．2．4 酶 解 蛋 白质 水 解 度 的测 定 在 中性 和 碱性 条 件下 采 用 pH-stat法嗍；在 酸性 条 件下 采用 TNBS法阿。 2 结果与讨论 2．1 五种蛋白酶对大豆蛋白的水解作用 一 琏 繁 时间 (min) 图 1 四种酶的水解进程曲线 为 了 筛选 出适 宜 于制 备 高 水 解 度 大 豆 短 肽 的蛋 白酶 ，本 研 究 首 先 考察 了在 相 同 的酶／底 物 比 的条 件 下 ，五 种 蛋 白酶 对 大 豆 蛋 白的水 解 进 程 曲线 ，结果 见 图 1。 由 图 1可 见 ，胰 蛋 白 酶 对 大 豆 蛋 白 的 水 解 能 力 极 差 ，而 通 过 对 标 准 底 物 的 酶 活 测 定 证 明 ，酶 是 有 活 力 的 (约 16万 )，这 说 明从 专 一 性 来 说 ，大 豆 蛋 白是 控加 H m8642o 维普资讯 http://www.cqvip.com ． ，No,9，2003 表 1 五种酶推荐 的最适 pH和温度 其 不 良底 物 ，另 外 其 价 格 tE比较 昂 贵 ，因此 ，胰 蛋 白 酶 不 足 以 作 为 制 备 高 水 解 度 大 豆 肽 的理 想 酶 制 剂 。 AS1．398 和 木 瓜 蛋 白 酶 价 格 相 对 便 宜 ， 酶 活 又 很 接 近 ，4h后 单 位 酶 活 对 大 豆 蛋 白 质 的 水 解 能 力 (水 解 度 ) 分 别 约 为 ：0．ooO131％ ，0．0o0o467％ 。 可 见 ， AS1．398对 大 豆 蛋 白的作 用 能 力 要 强 于木 瓜 蛋 白酶 。 在 所试 用 的五 种 蛋 白酶 中 ，Alcalase单 位 价 格 的 酶 活 最 高 ，水解 能 力 最 强 。胃蛋 白酶 的 作用 情 况 没有 出现 在 图 中 ，用 1’NBS法 测 定 ，在 2h和 5h时 它 的 水 解 度 都 是 2．61％ ，可 见 它 水 解 能 力 也 很 差 ，这 一 方 面 可 能 是 因为 其 酶 活 比较 低 ，可 以 通 过增 加 酶量 的方 法 给 予 提 高 ，但 这会 大 大提 高 生 产 成 本 ；另一 方 面可 能 是 因为 大 豆蛋 白是 其 不 良底 物 。综 合 以上 各个 因素 ，决 定 选 用 水 解 能 力 强 而 又 价 格 相 对 便 宜 的 Alcalase和 AS1．398两 种 酶作 为 制 备高 水 解度 大 豆 肽 的制 剂 。之 所 以要选 用 两种 酶 ，是 因为 二 者 作 用 的肽 键性 质 不 同 ，如 Alealase是 内 切 肽 酶 ，水 解 的 肽 键 是 羧 基 端 含 有 Tyr、Phe、Tyr等 残 基 ，而 AS1．398水解 的 肽 键 却 具 有 广 泛 的 专 一 性 ，因 此 在 相 同 的 水 解 度 情 况 下 ，两 种 酶 的 水 解 产 物 可 能 具 有 不 同 的 功 能 性 质 。 2．2 Alcalase水解大豆蛋白质最佳条件的确定 由 于 同 种 蛋 白 酶 对 不 同 的 底 物 具 有 不 同 的 最 适 温 度 和 pH，因 此有 必要 对 酶 作 用 于大 豆 蛋 白时 的最 适作 用 条 件进 行 讨论 。本 文 采用 了正交 试 验 ，试 验方 法 和 结 果 见 表 3，反 应 时 底 物 浓 度 是 8％ ，底 物 ／酶 比 为 80(g ／mL)，反 应 时 间 为 4h，正 交 表 中 的 水 解 度 即 为 4h 的 水 解 度 。 表 3 正交实验表 从 正 交 表 的 分 析 可 以 看 出 ， 最 适 作 用 温 度 为 55oC，但 在 实 验选 定 的 pH 内 水解 度 却 一 直 在 增 加 ， 为 了寻找 最 佳 的 pH 条件 ，在 温 度 为 55oC，pH 为 8．8 的条 件 下 ，进 行 了大 豆 蛋 白的 Aealase酶 水 解 。实 验 结 果 是 4h的 水 解 度 为 20．08％ ， 比 温 度 55oC，pH8．5 的值 低 ，因此 我 们 可 以说 在 pH8．5时 水 解 度 取得 最 大值 ，所 以确定 最 适 pH为 8．5。 在 确 定 的 最适 温 度 和 pH 下 ，保 持 底 物 浓 度 、底 物 总 量 (8Og)不 变 ，改 变 酶 的使 用 量 ，分 别 加 入 0．5、 1．0、1．5和 2mL酶 ，得 到 水 解 进 程 曲 线 如 图 2所 示 。 一 琏 ·饕 时间 (min) 图 2 酶 的添加量对水解度 的影 响 从 图 中可 以看 出 ，随着 酶 量 的增 加 ，水 解 度 是 上 升 的 ，但 酶 的添 加 量 从 lmL增 加 到 2mL时 ，最 终 水 解 度 增 加 不 是 太 大 ；加 酶 量 从 0．5mL增 加 到 lmL时 。 酶 反 应 速 度 增 加 明显 ，因此 ，从 经 济 上 考 虑 选 用 酶 的 最 佳 添 加 量 为 8Og底 物 蛋 白 中 加 入 lmL 的 酶 液 ，即 底 物 ／酶 量 比 为 80：1。 2．3 AS1．398酶水解大豆蛋白最佳条件的确定 AS1．398是 中性 蛋 白酶 ，它 可 以被 钙 、镁 离 子 激 活 ，因此 本 实 验在 考 察 酶 的最适 温 度 和 pH 的同 时 ． 考 察 Ca2+添 加量 对 水 解 进 程 的影 响 ，正 交 实验 结 果 见 表 4。实 验 时 采 用 的底 物 浓 度 为 8％，总量 为 8Og， 底 物 ／酶 比 为 4o(g／g)。 由正交 表 的极 差 分 析 可 知 ，在 其 取 值 范 围 内 A 是 主 要 的影 响 因素 ，而 B和 C是次 要 因素 ，因此 从节 省 能 源 的角 度 考 虑 ，取 水 解 温 度 为 40~(3；C 因素 在 lmL添 加 时 水 解 度 取得 最 大值 ，可 见 Ca2+对 AS1．398 有一 定 的激 活 作用 。 由于 pH 对 水解 的影 响 极 大 ，所 以在 选 定 的 温 度 和 激 活 剂 的 情 况 下 ，继 续 考 虑 pH 的 影 响 。实 验 测 定 了 pH 为 6．5和 6．2的 酶 水 解 进 程 。结 工 艺 技 ，|{ 勰；号 挖∞ H坨 8642o 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com