绿色荧光蛋白细胞的保存及细胞周期分析

绿色荧光蛋白细胞的保存及细胞周期分析 绿色荧光蛋白细胞的保存及细胞周期分析 第36卷第6期第798页 2007年12月 华中科技大学(医学版) ActaMedUnivSciTechnolHuazhong VoI_36No.6P.798 Dee.2007 绿色荧光蛋白细胞的保存及细胞周期分析* 刘双又李小兰肖薇陶德定罗学来高霞胡俊波?龚建平 华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中心,武汉430030 摘要目的探讨在绿色荧光蛋白(GFP)质粒转染后的细胞中,既能最大限度地保存GFP阳性细胞又有利于细胞 周期分析的固定方法.方法以胃癌MKN一28和乳腺癌MCF一7细胞为模型,脂质体Lipofectamine20OO转染细胞,转染 后的细胞分别用:?8O乙醇固定;?0.1,0.25,0.5和1.0的多聚甲醛固定;?0.1,0.25,0.5,1.0多聚 甲醛4?固定30min后再用8O%乙醇固定等3种方法固定细胞,然后用含0.1triton的PI染色,在流式细胞仪上检 测GFP的自发绿色荧光及行细胞周期分析.结果单纯乙醇固定的细胞中GFP均消失.单纯0.25,1.0的多聚 甲醛固定后的细胞不能得到有效的DNA直方图,单纯0.1的甲醛固定的细胞虽可得到良好的直方图,但PI染液中的 triton破坏了大部分的GFP.先甲醛再乙醇固定的细胞中,0.5,1.0的甲醛可较好地防止乙醇和triton对绿色荧 光蛋白的破坏作用,保留下2/3的GFP阳性细胞,0.5的甲醛固定的细胞可得到CV值<8的G./G期峰,而1.0 甲醛固定后的细胞CV值>8.结论在GFP质粒转染后的细胞中,先用0.5的多聚 甲醛固定细胞30min后再用乙 醇固定,既能最大限度地保存GFP,又可得到CV值良好的DNA直方图.若不考虑 保留GFP,或普通细胞作细胞周期 分析时,单纯0.1的多聚甲醛固定细胞,即可得到与传统的单纯乙醇固定细胞相似 的CV值很小的DNA直方图. 关键词绿色荧光蛋白;流式细胞术;细胞周期;细胞固定;多聚甲醛 中图法分类号R34-33 PreservationofGreenFluorescentProteinandAnalysisofCellCycle LiuShuangyou,LiXiaolan,XiaoWeietal CenterofMolecularMedicine,TongJiHospital,TongJiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 Abstract0bjectiveToinvestigateaneasyandusefu1fixationintransfectedadherentcellswithaGFP—encodingplasmid. whichallowedthecellsnotonlytomaintainmostofGFPbutalsotoacquireadequateDNAhistogram.MethodsThegastric tumorMKN一28andbreastcancerMCF一 7cel11ineswereusedasthemodels.Cellsweretransfectedwithlipofectamine2000. ThetransfectedcellswerefixedwithA(8Oethano1),B(0.1,0.25,0.5,1.0formaldehyde),C(0.1,0.25, 0.5,1.0formaldehydefor30minfollowedby8Oethano1),respectively.FixedcellswerestainedwithPIandanalyzed byflowcytometryforGFPfluorescenceandDNAcontent.ResultsAl1GFPdisappearedincellswithethano1only.Ingroup B,cellsfixedwith0.25一 1.0formaldehydedidn'tobtainadequateDNAhistogramtoanalyze,cellsin0.1formalde— hydehadgoodDNAhistogrambut0.1tritoninPIdestroyedmostofGFP.IngroupC,0.5一 1.0formaldehydecould preventdamagetoGFPfromethano1andtriton,preservingmostofthem(2/3),theCVofG0/G1peakinDNAhistogramwas 1essthan8in0.5formaldehydecellsbutmorethan8in1.0formaldehydecells.ConclusionAd herentcellstransfect— edwithaGFP—encodingplasmid,afterfixedwith0.5formaldehydebeforeethano1,couldmaintainmostof GFPandacquire adequateDNAhistograminflowcytometry.Itwasalsofoundthatcellsfixedwith0.1formald ehydeonlycouldobtainthe goodDNAhistogram1ikeethano1onlydidwhendon'tcareifpreservingGFP. Keyw0rdsgreenfluorescentprotein;flowcytometry;cel1cycle;fixation;formaldehyde 绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein, GFP)在激发光下可自发地发射内部的荧光,不需要 再做其它标记即可在流式细胞仪上和荧光显微镜下 被检测到,故近年来已被作为 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因广泛地应用 于基因的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达,调控,细胞分化及蛋白质在生物体内 国家自然科学基金(No.30300338,No.30471673),国家"973"计划 (No.2002CB513100—2),教育部留学回国人员启动基金[教外司 (2003)143资助项目 刘双又,女,1965年生,助理研究员 通迅作者,Correspondingauthor,E—mail:jbhu@tih.tjmu.edu.en 定位的研究中].但因其分子量较小,常用的透膜 固定剂乙醇会使其漏出细胞外,从而检测不到荧光, 给进一步分析GFP阳性细胞的一些特性如检测 DNA的含量带来困难.本研究探讨了一种简便易 行的,既有利于其荧光保存又有利于进行细胞周期 分析的固定方法. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1主要材料 质粒pEGFP-C1由美国马里兰大学Greenebaum 刘双又等.绿色荧光蛋白细胞的保存及细胞周期分析?799? 肿瘤中心夏献民博士惠赠.脂质体转染试剂Lipo— fectamine2000购自Invitrogen公司.胃癌MKN一28 细胞株和乳腺癌MCF_7细胞株为本室传代培养.流 式细胞仪为美国BectonDickson公司的FACSort. 1.2细胞培养和转染 MKN一28和MCF一7细胞均在含10%小牛血清 和抗生素(青霉素10万U/L及链霉素100mg/L) 的DMEM/F一12培养液中常规培养,取对数生长期 细胞转入6孔板后在仅含10小牛血清而无抗生 素的培养液中继续培养,待细胞长至融合度为60 左右时在无血清无抗生素的DMEM培养液中进行 转染,步骤按 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行.先将3g的质粒DNA 稀释于250tA培养液中,再将7.5l的Lipofecta— mine2000稀释于250tA培养液中,4,5min后将 二者混合,混匀后室温放置20min.更换待转染细 胞的培养液为无血清无抗生素的培养液,加入DNA 和Lipofectamine2000的混合物,培养5h后更换 培养液为含10小牛血清而无抗生素的培养液,继 续培养至48h收集细胞做进一步检测. 1.3不同方法固定转染后细胞 ?单纯乙醇固定:以80%冷乙醇固定细胞;? 单纯多聚甲醛固定:以0.1,0.25%,0.5和1.0 的多聚甲醛固定细胞;?多聚甲醛+乙醇固定:以 0.1,0.25%,0.5%,1.0多聚甲醛4?固定30 min后再用80冷乙醇固定细胞. 1.4转染效率和固定后细胞中GFP阳性细胞比例的测定 以未转染细胞做阴性对照,在流式细胞仪上检 测GFP的自发绿色荧光,应用Cellquest软件根据 荧光强度计算转染率及GFP阳性细胞率. 1.5细胞周期分析 固定后细胞用PBS洗1遍,室温,避光下PI染 色(PI50ffg/ml,RNase100ffg/ml,0.1triton) 至少30min后上样,流式细胞仪上检测DNA含量, Cellquest软件分析结果. 2结果 本研究以MKN一28以及MCF一7细胞模型进行 相关研究,二者结果相似,在此仅对MKN一28的结 果予以总结,分析. 2.1细胞的转染效率 以转染后活细胞中GFP表达阳性率反映转染 效率,MKN一28细胞的转染效率为20,28.见 图1. 2.2不同方法固定细胞后GFP的保留情况 ?单纯乙醇固定:未见GFP阳性细胞,细胞内 FL1.H Marker%Gated All100.00 M11.03 FL1.H Marker%Gated All100.00 M127.43 A:对照,未转染细胞;B:转染后活细胞 图1用质粒pEGFP-C1转染MKN一28细胞后 活细胞中的GFP阳性率(M1) 的GFP均消失.?单纯多聚甲醛固定:GFP阳性 细胞略减少,细胞内的GFP基本上被保留下来. 但PI染色后,0.5%,1.0的多聚甲醛固定的细 胞不能得到有效的DNA直方图,无法分析,0.25 的多聚甲醛固定后的细胞G./G期峰的CV值也> 8%,而0.1的多聚甲醛固定的细胞虽可得到< 5的良好的CV值,但PI染液中有利于其进入细 胞核的0.1triton对GFP的破坏作用明显,使得 大部分的GFP消失.?多聚甲醛+乙醇固定:多 聚甲醛的浓度越低,GFP阳性细胞越少.0.1%的 多聚甲醛固定后的细胞经后续处理后GFP几乎消 失,而0.5,1.0的多聚甲醛可较好地防止乙醇 和PI染液中的triton对GFP的破坏作用,保留下 大部分(2/3)的GFP阳性细胞.见图2. 2.3不同方法固定后MKN-28细胞的DNA直方图 0.5的多聚甲醛+乙醇固定后的细胞可得到 G0/G期峰的CV值<8%的DNA直方图,1.0 多聚甲醛+乙醇固定后的细胞CV值不理想,> 8.故在流式细胞仪上分析GFP阳性细胞的 DNA含量时,在乙醇固定前先用0.5的多聚甲醛 固定细胞,既可较好地保留细胞内的GFP又可得到 良好的G./G期峰的CV值.不考虑保留GFP情 况时,或普通细胞作细胞周期分析时,单纯0.1的 多聚甲醛固定细胞后PI染色可得到与传统的单纯 乙醇固定后细胞相似的CV值很小的(<5)DNA 直方图.见图3. 3讨论 GFP来源于可自发荧光的海洋水母,其cDNA 所编码的蛋白质受到蓝光照射时可自发地发出绿色 荧光,由于其具有可在生物活体内表达和在流式 ? 800?华中科技大学(医学版)2007年12月第36卷第6期 善 S FL1.H Marker%Gated AU10o.00 M11.51 FL1.H Marker%Gated AU10o.00 M114.48 兽 舌 FL1.H Marker%Gated A11100.00 M10l25 FL1-H Marker%Gated An100.00 M11833 FL1.H Marker%Gated An10o.00 M15.92 FL1.H Marker%Gated An10o.00 M116.81 A:未转染细胞;B:单纯乙醇固定后细胞;C:0.1%多聚甲醛+乙醇固定;D:0.25%多聚 甲醛+乙醇固定;E:0.5多聚甲醛+乙醇固定;F:1.0%多聚甲醛+乙醇固定 图2不同方法固定MNK一28细胞后绿色荧光蛋白保留情况 石.Cn 0 ,中? 0 ??? 一 砉鸯. 8? --? A:0.5多聚甲醛+乙醇固定,/G期峰的CV值<8;B:1.0多聚甲醛+乙醇固定,Go/G. 期 峰的CV值>8;C:单纯乙醇固定,G./G期峰的CV值<5;D:0.1多聚甲醛固 定,G./G.期峰 CV值<5 图3不同方法固定后MNK一28细胞的DNA直方图 细胞仪上或荧光显微镜下易于检测的特性,已被作 为一种生物标记物越来越多地用于基因的表达和亚 细胞的定位研究中口].如果要进一步研究GFP阳 性细胞的其它特性,如细胞周期,细胞中其他抗原 的表达等,则需对细胞进行固定.而由于GFP的分 子量较小,仅约27kD,细胞周期分析时常用的透 膜固定剂乙醇往往使其消失殆尽,从而检测不到荧 光l3],故无法在转染后的细胞中分出GFP阳性细 胞.国外有人采用了几种方法解决这个问题:如将 GFP和第2种可将其固定在细胞膜上的蛋白融合, 再与目的基因共转染l4],或用可将GFP固定在内 质网上的ER—GFPESI,这两种方法操作比较麻烦, 稳定性也不好.也有用Hoechst33342活染细胞而 (下转第820页) ? 820?华中科技大学(医学版)2007年12月第36卷第6期 力,改善血液流变学,提高红细胞的变形能力,全面 降低血液黏度,减少纤维蛋白原含量,增加纤维蛋 白溶解度,有利于侧枝循环的建立.高氧液中含一 定浓度的活性氧(O.),有较强的杀灭多种细菌和病 毒作用,并能调节细胞Ca浓度,稳定粒细胞和溶 酶体,提高机体免疫能力,增加机体对缺血,缺氧的 耐受力,减少中性粒细胞生成MMP-8等炎性介 质].本实验结果也反映使用舒氧康治疗后肺组织 MMP-8表达明显下降. 本实验表明:多功能撞击机撞击所致家兔ALI 应用高氧溶液治疗,可以增加机体对缺血,缺氧的耐 受,稳定粒细胞和溶酶体,减少炎性细胞因子生成, 从而达到减轻肺损伤作用.但其具体作用机制还需 要进一步研究. 参考文献 [1]GEBHARDF,KELBELMW,STRECKERW,eta1.Chest traumaanditsimpactonthereleaseofvasoactivemediators EJq.Shock,1997,7(5):313—317. E2]闵家新,朱佩芳,王正国,等.不同致伤条件撞击对兔钝性胸部 创伤伤情影响的实验研究[J].第三军医大学,2000,22 (6):509—511. 13lZHENGL,LAMWK,TIPOEGL,eta1.Overexpressionof matrixmetalloproteinase-8and一9inbronchiectaticairwayin vivo[J].EurRespirJ,2002,20(1):170-176. E4qSCIUTOAM,LEERB,FORSTERJS,eta1.Temporal changesinrespiratorydynamicsinmiceexposedtophosgene EJq.InhalToxicol,2002.14(5):487—501. (2007—05—17收稿) (上接第800页) 不需要做细胞固定,但对流式细胞仪的要求较高,需 要用能激发紫外光的流式细胞仪,这在国内不容易 做到. 甲醛是一种交联固定剂,能较好地保存细胞中 的蛋白质,但也使得PI染料难以进入细胞核,在流 式细胞仪上不能得到有效的用于细胞周期分析的 DNA直方图,故经典的用于检测细胞周期的细胞 通常是采用乙醇固定的.我们的研究表明,对用 GFP质粒转染后的细胞,先用0.59/6的多聚甲醛4 ?固定30min后再用乙醇固定,既可保存大部分 (约2/3)的GFP阳性细胞,又有利于PI透入细胞 核,在流式细胞仪上得到令人满意的G./G期峰的 CV值<80A的DNA直方图.Chu等L3认为0.5 , 1.75的甲醛固定都可得到满意的DNA直方 图,但我们的观察显示用1.0的多聚甲醛固定后 已不能得到较好的CV值,这可能与细胞不同有关, 他们用的鼠白血病细胞系32Dc13为悬浮细胞,而我 们所用的MKN一28和MCF一7细胞均为贴壁细胞. 此外,在本实验过程中,我们还发现,若不考虑 保留GFP的情况,或普通细胞作细胞周期分析时, 用0.1的多聚甲醛固定细胞后PI染色,可得到与 传统的乙醇固定后同样良好的<5的G./G期峰 的CV值. 参考文献 r1]CHALFIEM,TUY,EUSKIRCHENG,etal_Greenfluo— rescentproteinasamarkerforgeneexpression[J].Science, 1994,263(5148):802—805. Ez]CHALFIAM.GreenfluorescentproteinEJ].Photochem Photobiol,1995,62(4):65卜656. r3]CHUYW,WANGR,SCHMIDI,eta1.Analysiswithflow cytometryofgreenfluorescentproteinexpressioninleukemic cellsEJ].Cytometry,1999,36(4):333—339. 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