NP-HPLC法测定重组肿瘤坏死因子单克隆抗体寡糖含量的研究_490

NP-HPLC法测定重组肿瘤坏死因子单克隆抗体寡糖含量的研究_490 NP-HPLC法测定重组肿瘤坏死因子单克隆抗体寡糖含量的研究 程速远，毛歆，李晶，梁成罡 (中国药品生物制品检定所 北京 100050) 摘要 目的 研究肿瘤坏死因子单克隆抗体寡糖含量测定 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。 方法 采用N-聚糖酶酶解消化后释放出 -氨基苯甲酰胺(2-AB)进行标记，标记后的寡糖可用正相高效寡糖，释放出的寡糖可以被一种荧光标签2 液相色谱(NP-HPLC)方法进行分离，用荧光检测器进行检测。 结果 二天线果糖寡糖含量分别为87%， 89%，87%，寡甘露糖含量分别为3%，3%，3%。结论 本方法可用于寡糖的含量测定方法，灵敏度高，重 现性好。 关键词:寡糖 2-AB标记 NP-HPLC法 Study on determination of the oligosaccharide of a recombinant monoclonal antibody by NP-HPLC CHENG Su-yuan , MAO Xin, LI Jing, LIANG Cheng-gang Abstract Objective: To establish an NP-HPLC method for the determination of adalimumab with pre-column derivatization( Methods: Oligosaccharides in adalimumab are released by PNGase F and derivatised with 2-AB. The derivatives were then separated by NP-HPLC with ProPacWCX-10Can (250mm×4.0mm，10um ).The column temperature was 30?，with fluorescence detector and the excitation wavelength at 330nm; emission wavelength at 420nm(Results:Fructooligosaccharides are 87%,89% and 87% and oligomannose are 3%,3% and 3% respectively. Conclusion:The method is sensitive, specific and reproducible. It can be applied to quantitative determination of oligosaccharide in adalimumab. 重组肿瘤坏死因子单克隆抗体(adalimumab)是用于治疗类风湿性关节炎的一种重组 DNA技术生产的药物，能够识别结合并阻断肿瘤坏死因子(TNF)。与其他单抗一样，重组肿 瘤坏死因子单克隆抗体是一种糖蛋白，糖基化位点常常为其Fc段的赖氨酸(lys)，为N端 连接糖。为了更好的控制其质量，我们对其寡糖含量测定进行了研究。 本文寡糖含量测定采用N-聚糖酶酶解消化后释放出寡糖，释放出的寡糖可以被一种荧 光标签2-氨基苯甲酰胺(2-AB)进行标记，标记后的寡糖可用正相高效液相色谱(NP-HPLC) 方法进行分离，用荧光检测器进行检测。 1 仪器与试药 Waters高效液相色谱仪(包括2996PAD检测器，717Plus自动进样器，在线脱气机， 321525二元梯度泵，柱温箱，Millennium液相色谱工作站)，美国Waters公司;岛津10-AD 高效液相色谱仪(包括RF-10AXL荧光检测器，SIL-10ADVP自动进样器，在线脱气机，二 元梯度泵，柱温箱，Class-VP液相色谱工作站)，日本岛津公司;HZQ-F全温振荡培养箱， 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;干式加热器， 公司;冷冻干燥离心机，美国热电公 司;Eppendorf离心机，Eppendorf公司;pH计，梅特勒公司。 N-聚糖酶，NEB公司，SignalTM2-氨基苯甲酰胺标记试剂盒，Glyco公司; GlycoClean S Cartridge Glyco公司;重组肿瘤坏死因子单克隆抗体原液三批， 雅培公司;重组肿瘤坏死因子单克隆抗体对照品(12.4mg/ml)，雅培公司;其他试剂均为分析纯。 2 方法 2.1 N-聚糖酶量确定 按照2.2酶解方法制备阿达木单抗对照品消化产物及阴性对照(不含酶的阿达木单抗对照品)，酶解后按照阳离子交换色谱法分析每种酶解产物。计算酶解产物 酶解产物。 的Lys2面积与阴性对照的Lys2面积，至少需要95%的 酶量的初步摸索:分别考察了酶量为2uL，4uL，8uL，12uL时的酶解情况。 阳离子交换色谱条件:色谱柱:ProPacWCX-10Can(250mm×4.0mm，10um)色谱柱，预柱(50mm×4.0mm，10um);流速:1.0ml/min;柱温:30?;进样量:100ul;流动相A:10mM磷酸氢二钠，流动相B:10mM磷酸氢二钠与500mM氯化钠(pH5.5)，0,20分钟时B相由6%?16%，20,22分钟时B相由16%?100%，100%B相洗脱4分钟，26,28分钟时B相由100%?6%;荧光检测器 ;激发波长为330 nm，发射波长为420 nm。 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 色谱图。色谱图见图1。 1、NGA2F-GlcNAc 2、NGA2F 3、M5 4、NA1F 5、M6 6、NA2F 2.2 N-聚糖酶酶解 对照品溶液制备:吸取对照品50ul置0.5ml离心管中，加入制剂缓冲液12ul，混匀，即得。供试品溶液制备:取供试品50ul，加入制剂缓冲液325ul，混匀即得。对照品溶液和供试品溶液各取40ul分别置两个离心管中，每管中加入10%TritonX-100 5ul，G710ul,N-聚糖酶4ul，纯水41ul，使总体积达到100ul，混匀。37?摇床150rmp转速振荡18h。 酶解后产物置95?加热块加热5min，隔一分钟振荡使蛋白沉淀，各管以1000rmp的转速离心5min，将50ul各管上清液转入1.5ml离心管中，离心浓缩仪冷冻干燥2h。 2.3 2-AB标记 向上步干燥后样品中加入5ul2-AB试剂，充分混匀，离心甩打，65?水浴孵育3h，离心甩打，放冷。将上述标记后样品用GlycoClean S萃取小柱进行洗脱，(GlycoClean S萃取小柱先后用1ml水、5ml 30%乙酸溶液、3ml乙腈和1ml乙腈冲洗，上样后先用1ml乙腈冲洗一次，再用1ml 96%乙腈溶液冲洗5次，滤液弃去。0.5ml水洗脱3次，滤液用1.5ml离心管收集，离心浓缩仪冷冻干燥至体积约为0.8ml。 2.4 NP-HPLC色谱条件 色谱柱:GlykosepTM N-Plus色谱柱(4.6mm×150mm);激发波 ?;进样量:150ul;流动相:长:330nm;发射波长:420nm;流速:1.25ml/min;柱温:50 100%乙腈-50mM甲酸铵(pH4.4)梯度洗脱，0,22min时50mM甲酸铵30%?42.5%，22,22.5min时50mM甲酸铵42.5%?100%，100%50mM甲酸铵洗脱2min，24.5min,25min时50mM甲酸铵100%,30%，每次实验重复3次，面积归一化法计算寡糖含量。 3 结果与讨论 3.1 N-聚糖酶量的确定4uL、8uL及12uL的酶量均可以得到95%以上的酶解产物，考虑到酶试剂较昂贵，故选取4ul酶对400ug蛋白进行酶解。并对酶解前后的样品进行了SDS-PAGE电泳，从电泳结果能看出切糖后的样品条带分子量比没切糖的要小，初步确定切糖成功。 3.2 N-聚糖酶酶解 N,聚糖酶试剂盒的反应条件是20ug糖蛋白在糖蛋白缓冲液中100?煮沸10min使糖蛋白变性，加入G7缓冲液和10%NP-40，加入适量N,聚糖酶，37?条件下温育1h。按照试剂盒程序操作过程中发现，加入变性缓冲液后有白色沉淀生成;不加变性缓冲液，加入G7和10%NP-40后100?仍出现白色沉淀;不加变性缓冲液和10%NP-40，100?，90?，80?，70?，60?，50?，均有白色沉淀生成，37?反应无沉淀，故操作过程不按试剂盒步骤而是选择不加变性缓冲液和10%NP-40，加入10%TritonX-100增溶，加入G7 37?振荡孵育18小时。分析原因是因为变性缓冲液和10%NP-40以及加热的条件使蛋白变性沉淀，酶无法与活性位点反应进行酶切反应，所以用阳离子交换色谱监测时没有色谱峰出现。 3.3样品处理除了用试剂盒方法还考察了透析的方法，步骤如下:1.透析:样品及对照品用RCM缓冲液透析过夜，截留分子量为3500D，透析后溶液以10uL/mL加入1M DTT溶液，37?孵育1h。2.羧化:加入碘乙酸溶液至25uL/mL,室温避光反应30min，加入50uL/mL的1M DTT溶液终止反应。3.缓冲液替换:将上述已还原/羧化样品溶液置透析袋中(3500D),以N-聚糖酶缓冲液室温透析4h。4.酶切:离心浓缩干燥样品，使样品约为0.5mL，取200uL干燥后样品加入8uLN-聚糖酶。5.寡糖的分离与纯化:切糖后样品取8uL电泳，其余加3倍体积乙醇，-20?孵育1h，3000rmp离心10min，取上清至1.5mL离心管中，通风橱风干。6.透析:干燥样品加入适量去离子水溶解，转入透析袋(500D)，去离子水透析12h，离心干燥。 该方法因为多步透析，且加入碘乙酸氧化，步骤复杂，操作繁琐，且结果没有试剂盒方法理想，故未经采用。 3.4寡糖含量 糖蛋白寡糖测定首先需要进行寡糖的释放，寡糖释放分酶法和化学法两种方法，本文选择了特异性更高的酶法。阿达木单抗为N端连接糖蛋白，故选用N-聚糖酶进行切糖;释放出的寡糖由于没有紫外吸收，无法直接进行测定，检测往往需要进行衍生化，本文选用2-AB进行标记，荧光检测器检测。色谱柱选用了适用于单抗的GlykosepTM N-Plus色谱柱，比普通GlykosepTM N色谱柱分析时间大大缩短，由120分钟缩短至35分钟。 ，87%，寡甘露面积归一化方法计算后三批样品的二天线果糖寡糖含量分别为87%，89%糖含量分别为3%，3%，3%。