利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定研究（可编辑）

利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定研究（可编辑） 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定研究 分类号 学校代码 ? 学 密 级 彦商犬学 学 论 位 文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 甄鹏 专业名称 蔬菜学 学院名称 农学院 指导教师 黄如葵研究员 龙明华教授 士 申请学位级别 硕 论文提交日期 年月 .. 论文答辩日期 学位授予日期 年月 答辩委员会主席 方锋学 论文评阅人 李立志 论文评阅人 刘政国,二 :。?..、 攀雾 ,:。::‘。:?薯 广西大学学位论文原创性和使用捋极亩 阴本人声明所呈交的论文,是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除已特另:以标注和致谢的地方外,论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的研究成果,也不包含本人或他人为获得 广西大学或其它单位的学位而使用过的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 。与我一同工作的同事对本 论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。 本人在导师指导所完成的学位论文及相关的职务作品,知识产权 归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权,即:学 校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索和传播,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 本学位论文属于: 口保密,在 年解密后适用授权。 阻不保密。 请在以上相应方框内打“?” 日期:幻、、/叶 论文作者签名:蜘懈 日期:咖,多?玎 指导教师签名:糨 作者:十砷?。 电子邮箱:孙叩叼??‘.帆? : 挚:誊鬻篝 鼍, 。. ,?’一:., 一鼍二、。:一.;。?:善多耋声二?毒 爹爹?豢褰蒸攀菱蘩 蠢萋警墨雾。土毒”?誊?薯意鬈,一.。一。, 鬻 警。?爱?:‘...二。‘:、一,::‘羔’:一.蠢毒??簟:.; 鎏一滋攀鬻?: .’?曼?叠:参?溪霪饕渗 爹鎏: :拳羹麓鬻?楚??羹攀?荔妻?霉; 誊鎏鬻辫豢::? ?攀?豢.?.,: 蒸黎鬻??』 簿攀誉《簿攀攀攀爹攀.?爹?拳鬻鬻爹攀?。 一,’. 鬻鼙 一’; ’,?一‘ 。一一:: 蔓美?萼尊 :~‘.:鼍。 二 .。一。 一’ 一~,: 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利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 识 , ,, .. . . 、、 ? ? . 、、、,? . ? ., , , 、、 ?. ./,. , , . 、 :? . ; . 一?;. .; 。; . 、 ?? . ? , . 堕查兰塑主兰堕鲨奎 型旦塑墨星董皇墨墨鱼鲞塾堡量垦查登 丝壅鳖窒塑堡壅 ? , ., .、 , , .,’、 . . : ; ; ;? ? /.西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进于?篙:瓜? 杂度鉴定的研究 目 录 .苦瓜? ..苦瓜的分类?.. ..食用价值??.. ..药用价值??一 .种子纯度检验?. ..种子形态检验法??一 ..幼苗形态检验法??一 ..田间小区种植检验法.. .. 分子标记技术检验法?. ..蛋白质电泳技术检验法??.. .苦瓜种子纯度检验现状. .种子贮藏蛋白的研究?. .蛋白质电泳??. ..蛋白质电泳的发展?一 ..我国种子蛋白电泳发展??一 .超薄层等电聚焦电泳?. .超薄层等电聚焦电泳在品种纯度鉴定中的应用??. 课题的意义??. 不同苦瓜种子贮藏蛋白超薄层等电聚焦电泳. .材料与方法..供试材料..实验方法.样品的提取 /.西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进苦瓜杂种纯 度鉴定的研究 .电泳. .结果分析与讨论 ..苦瓜种子球蛋白电泳图谱? ..苦瓜种子谷蛋白电泳图谱? .苦瓜种子醇溶蛋白电泳图谱 .小结苦瓜水溶蛋白超薄层等电聚焦电泳条件的优化??. .材料与方法..实验材料..凝胶制备的筛选。.水溶蛋白提取与上 样优化? ..试验条件.结果分析与讨论 ..不同厚度凝胶电泳效果对比 ..脱脂处理对电泳效果的影响 ..不同提取温度对电泳效果的影响? ..蛋白质提取时间对电泳效果的影响 ..上样量对电泳效果的影响? ..样品浓度对电泳效果的影响 .小结. 利用超薄层等电聚焦电泳对几个苦瓜杂交组合的品种纯度和真 实性鉴定. .材料与方法..供试材料..试验方法.结果与分析..水溶蛋白超 薄层等电聚焦电泳鉴定结果? ..田问种植鉴定结果? 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 .小结. 全文讨论与结论. .全文讨论 ..不同贮藏蛋白的超薄层等电聚焦电泳..超薄层等电聚焦电泳条件的优化? ..利用超薄层等电聚焦电泳对广西农科院个苦瓜杂交品种进行纯度鉴定.全文结论 ..不同贮藏蛋白的超薄层等电聚焦电泳..超薄层等电聚焦电泳条件的优化? ..利用超薄层等电聚焦电泳对广西农科院个苦瓜杂交品种进行纯度鉴定后续研究 致谢??. 参考文献 附图??. 攻读硕士学位期问发表的论文?. 广西大掌硕士掌位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 前言 .苦瓜 苦瓜砌 .葫芦科苦瓜属。一年生攀援状草本,有分枝,茎、 枝被柔毛,卷须纤细,叶片掌状。雌雄异花同株,果实呈纺锤形或圆锥形,多瘤皱。 幼果绿色或白绿色,成熟后橙黄色,由顶端瓣裂。每瓜约含粒左右 种子,种子 盾状,稍厚,黄褐色、黑色,有雕刻状花纹;外有鲜红色肉质果瓤包裹,果肉组织甜 味可以使用。据刘政国 报道,苦瓜种子黑色受一对显性基因控制,可用于种 子纯度鉴定。蒋先明的《各种蔬菜?苦瓜》中说明苦瓜原产于亚热带地区,日本、印 度、东南亚和中国栽培历史悠久。明代《救荒本草》称其为锦荔枝,癞葡萄;《淇南 本草》中最早使用苦瓜一词。《本草纲目》中描述为:“苦瓜以味名,瓜及荔枝、葡萄, 皆以实及茎、叶相似而得名”。 ..苦瓜的分类 苦瓜的分类,按栽培方式,有野生型和栽培型;按果实形状,有短圆锥形,长圆 锥形,长圆筒形的三类:按瓜皮颜色,有白皮绿白色和青绿皮苦瓜两种类型;按 果实大小,有大型和小型苦瓜两种类型。按果瘤形状,有刺瘤和平瘤两种类型。张长 远根据苦瓜果皮表面的粒刺状瘤的形状和大小,将苦瓜分为滑身苦瓜和麻点 苦瓜。苦瓜的品种类型分布按种植和消费习惯有明显的地域性。 ..食用价值 明代徐光启的《农政全 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 》提到南方人“甚食苦瓜”。苦瓜的营养成分全面而丰 富,有多种维生素和氨基酸。苦瓜含糖和脂肪较低,同时还含有苦瓜素和类胰岛素等 多种药用成分王先远,;严启新,;力.新建,。另外苦瓜中含有、 、、、、等多种人体必需微量元素。苦瓜是我国食品工业的重要加 工原料,通过深加工开发出的苦瓜饮料、苦瓜果脯等增值产品,受到广大消费者的青 睐。广西大学硕士掌位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 ..药用价值 苦瓜不仅营养价值丰富,其种子还具有药用价值许红心,。我国传统医 学认为,苦瓜药性苦、寒,具有清热去火、消肿止痛功效,可用于中暑发热、烦热口 渴、痢疾、眼痛和胃气痛等病症黄勇,。现代医学研究发现,苦瓜除了具有降 血糖、抗菌、调节免疫等作用,还有抗肿瘤、抗等功效。迄今已分离鉴定的多种 药用成分如生物活性蛋白和多肽等,其中核糖体失活蛋白具有抗癌、抗艾滋病等功效, 已引起人们的广泛关注。 ...苦瓜的降血糖作用 苦瓜含有的一些天然物质能够激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶,该酶能够调控体内 能量代谢及促进葡萄糖摄取。根据刘秀英等报道,苦瓜降血糖作用与其影响 葡萄糖的吸收、贮存、代谢及对抗自由基攻击等功效有关。何新益等对苦瓜多 糖进行了过氧化物酶体增殖物激活受体体外激活实验,结果表明,苦瓜多糖 对和的激活倍数分别可达.和.倍。据等报道, 苦瓜水提物对?型糖尿病?小鼠骨骼肌中磷酸腺苷激活蛋白激酶具有 很强的激活作用。苦瓜的辅助降血糖功能与、葡萄糖转运蛋白一、磷脂酰肌醇 激酶和等有关,通过对它们的有效调节,促进葡萄糖的异生作用,阻碍其 吸收和生成,进而降低血糖水平陈敬鑫等,。 ...抗氧化作用 据吴笳笛等报道,苦瓜水溶性多糖对超氧化物、羟自由基的半抑制质量 浓度分别为../和./。苦瓜叶水提取物清除,一二苯基.一三硝基 苯肼自由基和还原高价铁离子的能力最强;苦瓜嫩果提取物清除羟自由基能力、抗氧 化指数以及总的抗氧化能力最强 .,。苦瓜多糖成分含有一定量的还 原糖,陈红漫等研究表明,苦瓜多糖可提高小鼠肝脏、大脑和血清过氧化氢酶、 超氧化物歧化酶含量,并能降低小鼠丙二醛含量。苦瓜的主要抗氧化成分是三萜化合 物,等从苦瓜茎中分离出三种萜类化合物,这种化合物能够清除二铵 盐自由基正离子活性的及抑制黄嘌呤氧化酶的。 广西大掌硕士掌位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 ...提高免疫功能 苦瓜含有的抑制剂、苦瓜素等活性成分可通过抑制机体异常免疫反应、保护正常 免疫系统来提高防御机能,从而增强机体免疫力。等发现苦瓜抑制剂 具有免疫、调节活性作用。等研究表明,【.苦瓜素含有的尿嘧啶、亮 氨酸和胸腺嘧啶核苷具有抑制癌细胞、促进小鼠巨噬细胞吞噬肥细胞的功效。 苦瓜果汁可促进有益白细胞介素一的产生,其调节细胞生长、分化且具有免疫 活性的细胞因子作用,并能降低肿瘤坏死因子和不良白细胞介素的水平 等研究发现,苦瓜素可通过诱导细胞表面的膜免疫 .,。 球蛋白活性而激活细胞,促使其分裂增殖,激活细胞亚群中细胞靶点,进而引 发体液免疫反应;经过共培养后,苦瓜素还可以触发脾细胞分泌非特异性免疫球蛋白, 进行免疫调节。 等研究表明,苦瓜汁能显著提高小鼠血清中干扰 素水平,增强细胞的免疫反馈作用,其中苦瓜果肉提取液对干扰素吖的诱导作 用最强。 ...抗病毒病作用 据林育泉等报道,苦瓜提取物蛋白能够直接作用于病毒基因组, 使其、丧失复制、转录功能,抑制与病毒复制有关的逆转录酶和病毒整合 酶的活性;蛋白还可以作用于病毒感染细胞内的核糖体,干扰细胞蛋白质的 合成。同时有研究报道,具有抗单纯疱疹病毒和人类免疫缺陷病毒 的作用。 ...抗肿瘤作用 可以调控与肿瘤相关病毒基因在细胞内的表达,在治疗与病毒相关的肿 瘤方面具有巨大的潜力。等研究表明,蛋白能够抑制肿瘤形成 与转移的关键基因的表达,并促进与细胞凋亡直接相关的基因的表达,干扰病毒的复 制,从而抑制肿瘤细胞的生长。据骆抗先等报道,蛋白对细胞内 基因的表达有明显的抑制作用。据袁祖华等报道,一苦瓜素能够抑制肿瘤细 胞的蛋白质合成,选择性杀伤黑色素瘤细胞和绒毛膜癌细胞;.苦瓜素能够抑制广西大学司旺学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 亮氨酸、尿嘧啶和胸腺嘧啶结合到人舌喉鳞状上皮癌细胞中。 ...经济意义及发展前景 随着社会经济的发展和人民生活水平的提高,中国人越来越关注健康和保健,苦 瓜作为一种优质的药食兼用的加工资源,无论在医药、保健食品、食品加工等领域都 有非常广泛的应用前景,受到欧美等发达国家的高度重视。 .种子纯度检验 种子是农业生产最基本的生产资料,是农作物各种优良性状的载 体张淑玉, 。种子在农业生产上,能否获得优质、高产、高效除了取决于品种好坏夕外, 还取决于种子的质量,因此保证种子的质量是进行安全生产的关键因素。种子检验是 应用科学方法和按国家标准对种子样品进行检测,并根据检测结果判定种子质量的优 劣、纯度及真实性,评定其价值。品种纯度是是体现产量高低的决定因素,种子质量 的重要指标谭嘉兴,。 随着育种技术的进步,越来越多的优良品种为农业高产、增产、稳产作出了重大 贡献,深受广大农民的欢迎。然而,近年来一些不法分子盲目追求经济利益大量销售 假冒伪劣利,子,危害极大,致使农业减产甚至绝收,给农民和国家造成了严重的经济 损失。因此,研究探索出一系列快速高效实用的种子检验技术成为亟待解决的问题段 乃彬等,。 目前已有的种子纯度检验技术有:种予形态检验法、种苗形态检验法、田间小区 种植检验法、分子标记技术检验法、蛋白质电泳技术检验法。 ..种子形态检验法 种子形态指标包括:粒形、粒色、光泽、结构、种皮。 苦瓜种子形态鉴定的指标有:种子颜色、种皮花纹、种子形状、种子长度、种子 宽度、种子厚度、种皮质地、千粒重。种子颜色有白色、棕黄色、黑褐色;种子花纹 分有花纹和无花纹两种。 种子形态鉴定应用范围有限,主要用于鉴定种子体积较大、形态性状丰富的作物, 对于母本相同、粒型色差不大的种子难以准确鉴定。 广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进于苦瓜杂种纯度鉴定的研究 ..幼苗形态检验法 苦瓜幼苗的形态指标包括叶形、叶色、叶片大小、株高、生长势等。利用幼苗形 态鉴定纯度简便、省时,但结果易受环境的影响,误差较大。 ..田问小区种植检验法 一般选择杂交种当年收获后到第二年种植前进行。在问设置一个小区,定量抽 取种子,按标准株行距进行种植,对照标准样品,标准样品一般是育种家种子。主要 根据株形、株高、叶片数、叶色、叶片宽窄、花药颜色等为评价 标准。阳问小区种植 鉴定往往周期较长,成本比较高,结果受环境影响比较大。 ...苦瓜种子纯度的田间种植检验指标 叶:叶尖、叶缘、叶色、叶片形状、叶片边缘、叶片角度、裂片数,叶片 形状有近圆形、心形、掌状,叶片裂刻强度有弱、强、极强。 植株:盛花期分枝量,有弱、中、强三种。 瓜:瓜皮颜色、瓜形、瓜瘤形状、瓜棱。瓜皮颜色有:白色、浅绿色、绿 色、深绿色;瓜形有:长圆筒形、圆锥形、长纺锤形、纺锤形、卵圆形;瓜瘤:瓜瘤 形状有圆瘤、刺瘤、平瘤,瓜瘤密度有无、稀、中、密,瓜瘤大小有小、中、大;瓜 棱有无、小、中、大。 .. 分子标记技术检验法 作物品种问形态和生理上的差异,本质是品种间层面的差异。分子标 记技术即是通过分析品种序列的差异,来鉴别不同品种。目前,应用于作物品 种鉴定的有技术、技术、技术和技术等。分子标记技术检 测对象一般是种子片段,基本不受环境的影响,准确性、稳定性和 重复性较高; 同时也存在成本高、步骤繁杂、不易普及等缺点赵婷,。 ..蛋白质电泳技术检验法 同类作物的不同品种问存在基因水平的差异,引起的部分蛋白质种类、结构、数 广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进于苦瓜杂种纯度崔;定的研究 量的变化,利用电泳技术将具有差异的蛋白质组进行分离比较,从而达到鉴定纯度的 目的刘淑艳,。蛋白质电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、同工酶电泳、淀粉胶 电泳和等电聚焦电泳等多种技术,具有快速、准确,重复性、稳定性强等特点。 .种子贮藏蛋白超薄层等电聚焦电泳 种子贮藏蛋白超薄层等电聚焦电泳是以等电聚焦电泳为基础发展出来的一种电 泳技术,其原理是利用不同品种之间蛋白指纹的差异实现种子纯度鉴定。携带不同电 荷量的蛋白质,在电场中泳动到不同位点,经过电泳、染色,电泳图谱蛋白 质条带的位置、数量和颜色深浅,构成品种的“指纹”特征赵婷,。 .苦瓜种子纯度检验现状 根据我国农作物种子检验规程,瓜类种子纯度检验采用的标准方法是田间小区种 植鉴定/.? ,农作物种子检验规程。该方法的优点是直观准确,适 用性强,缺点是周期长,成本高。苦瓜采用日问小区种植鉴定需?个月,漫长的检 验周期影响了种子的流通和质量控制,因此,苦瓜种子纯度的室内快速鉴定方法成为 生产上迫切需要的技术。国内已有采用标记等方法进行苦瓜种子纯度鉴定的研 究张菊平等,,但在准确性、可重复性、实用性等方面均存在缺陷,未被生 产实践广泛采用。 .种子贮藏蛋白的研究 种子蛋白可分为贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂和凝集素等。贮藏蛋白是种子的主要蛋 白成分,是基因表达的产物,根据其特性可分为球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白, 根据蛋白溶解性的不同,球蛋白又称:为盐溶蛋白,谷蛋白称为碱溶蛋白,清蛋贝称 为水溶蛋白。贮藏蛋白也是影响种子品质的关键因素之?一,而种子品质的优劣很大程 度上又决定幼苗的质量。贮藏蛋白在种子发育过程中形成,为种子的萌发及幼苗生长 提供氮源,也是人类和动物所获取种子营养的重要组成部分 ,。不 同作物其贮藏蛋白比例不同,如禾谷类含有较多的醇溶蛋白,豆科则含有较多的球蛋 白。 等分别利用醇溶蛋白、谷蛋白电泳技术对大麦、小麦等几种禾西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 谷类植物进行品种分析鉴定,认为电泳较电泳鉴定更适用于植物种,但不适 合进行品种纯度鉴定。种子贮臧蛋白的数量、成分稳定,基本不受外界条件影响曲 延英等,。 种子蛋白作为生化遗传标记已被广泛应用于种内遗传多样性分析,种属问关系及 品种鉴定及植物繁育系统的鉴定。严敏等研究表明,贮藏.个月的两系杂 交水稻。种子中父本特征谱带依然清晰,贮藏了个月的杂交水稻品种,新陈代谢旺 盛,不断分解蛋白质、脂肪、糖类等大分子物质,使种子中的特征 蛋白不断被降解, 部分种子中的父本特征谱带变得模糊。等研究表明,玉米种子 醇溶蛋白是由许多分子量相似、等电点不同的多肽组成。张春庆等,利 用.和对玉米种子贮藏蛋白进行电泳,分别得至?条谱带和条谱 等利用酸性电泳对玉米种子球蛋白进行分析,得? 带。 条蛋白谱带。宋同明等对玉米种子清蛋白、球蛋白进行电泳,结果表明杂交种或自交系一般约有条谱带,清晰可辨的蛋白谱带达条。据 等 报道,利用种子贮藏蛋兰电泳技术分离出个大豆品种的条特征性谱带, 并认为这项技术可作为豆科鉴别的标准化技术。陈景堂等利用清蛋白电泳谱 带对玉米种子进行纯度鉴定和自交系类群划分的研究。陈景堂等研究表明醇 溶蛋白、球蛋白、谷蛋白提取液中含有水,因而在提取这些贮藏蛋白时,清蛋白也会 被提取。大豆水溶蛋白在室温下能与偶氮胭脂红在酸性介质中迅速结合生成复合物, 其最大吸收波长为,在出大豆水溶蛋白的浓度至少~/,与吸光 度成正比鲁秀恒等,。 种子贮藏蛋白常作为异花授粉植物的生化标记,原因是贮藏蛋白在遗传进化的过 程中表现稳定毛培胜,。胡志辉等对个辣椒品种种子内种贮藏 蛋白:谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白进行了含量测定?电泳分析, 结果表明辣椒种子贮藏蛋白以谷蛋白和清蛋白含量最高,其次是球蛋白,醇溶蛋白含 量最低,各品种都能通过谷蛋白、清蛋白和球蛋白的蛋白质亚基组成信息区别出其差 异性。苏萍等对比了种玉米的盐溶蛋白和乙酸蛋白、水溶蛋白、醇溶蛋白 以及胚乳和胚蛋白酸?佳的谱带。结果发现盐溶蛋白和水溶蛋白、乙酸蛋白、醇 溶蛋白以及胚胚蛋白酸性谱带极为相似,均可以用于品种鉴定。张志芬等 利用?电泳技术研究糜子籽粒贮藏蛋白组分,可以得到糜子籽粒球 蛋白、清蛋白和符蛋白的清晰谱带,而醇溶蛋白基本没有。 ., 广西大掌硕士掌位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 研究表明,种子贮藏蛋白可用作异花授粉植物的生化标记,因其在遗传进化过程中极 少发生改变,因而具有较强的特异性。 .蛋白质电泳 ..蛋白质电泳的发展 年,首次利用蛋白质电泳技术进行植物品种鉴定 ,。 经过将近年的发展,目前已有包括一聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳、聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳、种子贮藏蛋白薄层等电聚焦电泳和同工酶电泳等方法 相继开发出来并应用于农作物、蔬菜、牧草等种子的品种纯度和真实性鉴定。 到年问,、、等人相继在小麦、大麦的?和电泳 .,利用等电聚 鉴定方法方面取得成功,,,。焦电泳进行菜豆品种的蛋白质电泳鉴定研究。 等利用种子 贮藏蛋白等电聚焦电泳技术分离出条特异性谱带,可以将个大豆品种鉴别开来, 并得出可以将此项技术作为豆类鉴别的标准技术的结论。 ..我国种子蛋白电泳发展 种子蛋白电泳是一项简单、快速的种子纯度鉴定方法,近年来,国际种子检验协 会陆续将多种作物贮藏蛋白电泳鉴定技术列入国际种子检验规程,我国 /.《农作物种子检验规程》也已将规程的鉴定小麦和大麦品种的 聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法列入应用,从此以后蛋白质电泳技术迅速发展起 来,所鉴定的植物种类也日益增多。 .超薄层等电聚焦电泳 种子贮藏蛋白电泳在作物种质亲缘起源、演化、分类、关系等方面都有所应用。 种子贮藏蛋白超薄层等电聚焦电泳方法具有检验方法易于标准化、检验结果易于判 别、可重复性好、适用的种及品种范围广泛,操作相对简单、快速等特点,是国际种 子检验协会积极推行的品种纯度检验技术刘敏轩等,。发 展出基于等电聚焦原理,并能够应用二二鉴定作物品种真实性和纯度的超薄层等电聚焦广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进于苦瓜杂种纯度鉴定的习祀 电泳技术,此后在实际运用中不断改进发展成的一种非常实用的电泳技术 ,。种子贮藏蛋白超薄层等电聚焦电泳作为一项简单、快速的种子纯度鉴定方 法已在国外许多先进种子检验实验室广泛应用。与常规等电聚焦电泳相比, 超薄层等电聚焦电泳有以下优点:试剂如甲叉双丙烯酰胺,丙烯 酰胺,两性电解质 等使用减少,降低了成本;电泳时问缩短到,节省了时间;蛋白质条带分离 的更细、更精确,蛋白质用量减少,电泳图谱间隙清晰、基本无背景,分辨率提高到 .;能够制成干燥的膜片长期保存,烘箱里放置一夜即可彻底干燥。 .超薄层等电聚焦电泳在品种纯度鉴定中的应用 等利用同工酶电泳技术和等电聚焦凝胶电泳贮藏 蛋白技术对的个冬大麦和春大麦品种进行鉴定得到种蛋白指纹,可以鉴 定出其中的个品种,同时认为同工酶电泳和贮藏蛋白电泳技术是一种快速鉴 定大麦的品种纯度的方法。 等进行杂交水稻品种谷蛋白淀粉酶 电泳鉴定,分离出条主要蛋白谱带,可用于全部参试品种的鉴定。王晓峰等 利用超薄层等电聚焦电泳技术对个品种的水稻进行了鉴定,发现有条蛋白质带 在不同品种之间表现出多态性。黄为平等利用等电聚焦电泳技术对个大白 菜一代杂种及其亲本幼苗的过氧化物同工酶进行分离鉴定,结果 表明,利用过氧化物 同工酶可鉴别由自交引起的假杂种。年将鉴定杂交玉米种子纯度 列为列为《国际种子检验规程》中的标准参考方法。黄为平等,分析了京抗 二号、京抗三号和京欣一号西瓜代杂交种和亲本种子的水溶蛋白电泳图谱, 表示用此方法可以鉴别出由自交引起的假杂种。 广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 课题的意义 种子纯度和真实性在农业生产中占据着重要地位,而种子纯度和真实性是否符合 规定的标准,必须通过检验才能得出结论,因此种子检验与种子纯度、真实性密不可 分。种子纯度和真实性检验的结果与所采用的检验方法关系极为密切,不同方法往往 得到不同的结果。为了使种子纯度和真实性检验获得普遍一致和快速准确的结果,必 须要探索出一个标准的、科学的检验方法。本研究通过探索电泳技术在苦瓜杂交种、 常规种鉴定中的应用,找出适用于苦瓜种子纯度鉴定的超薄层等电聚焦电泳方法,为 苦瓜种子纯度室内快速鉴定提供依据,使我国种质检验更好的与国际接轨方面具有重 要意义。 研究目标: 提取种苦瓜种子贮藏蛋白:球蛋白、谷蛋白、清蛋白、醇溶蛋白,进行超 薄层等电聚焦电泳,筛选出电泳效果最好,条带多,分布均匀的苦瓜种子贮藏蛋白种 类。 在前人的基础上,优化苦瓜种子贮藏蛋白超薄层等电聚焦电泳体系,对电 泳参数设置,凝胶浓度和厚度,贮臧蛋白提取条件进行优化,以期建立适合的电泳体 系,为后续研究打下基础。 选择几组苦瓜杂交品利一,采用半粒种子法,运用已建立的电泳体系,进行 苦瓜杂交品种纯度的室内快速鉴定,并进行田问对比实验,以验证超薄层等电聚焦电 泳鉴定结果的准确性。为实现超薄层等电聚焦电泳在瓜类品种纯度鉴定方面实现突破 打下基础。 鉴于目前种子纯度检验普遍采用间检验,存在成本高、周期长、 任务量 繁重等缺点,探索出一套以超薄层等电聚焦电泳技术为基础的一种简便、快速、低成 本的纯度检验体系。广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 不同苦瓜种子贮藏蛋白超薄层等电聚焦电泳 苦瓜种子发育划分为个阶段:快速膨大阶段,这时种子会吸收大量的水分和养 分,体积迅速增大,水分含量和干物质重量都会增加:干物质累积阶段,干物质含量 继续增加,水分含量则逐渐下降;脱水阶段,干物质不再增加,含水量逐渐下降。苦 瓜属于“湿”种子类型,其种子发育完成于水分含量高的果肉中,因此在脱水阶段种 子的含水量下降不明显。苦瓜种子的蛋白质、激素、脂肪等物质在第二阶段完成。孙 德利等研究表明,苦瓜种子在开花后开始具备生活力,充实成熟期在花 后左右,并具有最高的发芽率,此后时期会略有下降。 种子蛋白作为遗传标记已被广泛应用于种内遗传多样性分析、种属间关系,品种 鉴定及植物繁育系统的鉴定。种子蛋白包括:贮藏蛋白、蛋白酶 抑制剂和凝集素等。 贮藏蛋白是基因表达的产物,也是种子的主要成分,一般作物种子贮藏蛋白都具有特 异性。贮藏蛋白在种子发育过程中形成,是种子的萌发及幼苗生长的氮源基础,也是 人类和动物所获取营养价值的重要组成部分 ,。贮藏蛋白是影响种 子品质的关键因素之一,贮藏蛋白数量、成分稳定,且能从种子中直接提取,缩短了 实验周期,基本不受外界条件影响曲延英等,。种子贮藏蛋白在遗传进化过 程中表现稳定,因此具有较强的特异性,常用作异花授粉植物品种鉴定的生化标记 。同工酶也可用作异花授粉植物的生化标记,但往往需要多个同 工酶同时分析才能达到鉴定的目的 ,。 本研究通过对种苦瓜种予贮藏蛋白:球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、水溶蛋白的 提取,超薄层等电聚焦电泳实验,观察不同贮藏蛋白的电泳效果,筛选出适合进行 的苦瓜种子贮藏蛋白,为以后研究利用种子贮藏蛋白鉴定苦瓜品种纯度打下 基础。 .材料与方法 ..供试材料 由广西农业科学院蔬菜研究所提供的苦瓜品种。广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 ..实验方法 实验仪器 .型多功能等电聚焦电泳槽、恒温循环器、高压电源、 硅化玻璃板。 实验药品及配方 凝胶的机械性、弹性、透明度和黏着度取决于总浓度和交联度。聚丙烯酰胺 凝胶的孔径大小是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在凝胶中的总浓度,以及甲叉双丙烯 酰胺的百分含量即交联度决定的。通常凝胶的筛透明度、弹性和孔径随着凝胶浓度的 增加而降低,而机械强度则随着凝胶浓度的增加而增加。凝胶浓度不同,其交联度也 不同。交联度随着总浓度的升高而降低郭尧君,。因此,当总浓度一定时, 交联度增加将导致筛孔直径降低。聚丙烯酰胺凝胶胶太软难操作,太硬则脆易断。 计算公式是: 丁:竺竺×% :,一×% 为丙烯酰胺的克数,为甲叉双丙烯酰胺的克数,是水或缓冲液的体积。 :是影响凝胶的关键参数。当:时,凝胶呈乳白色;:时,凝胶呈糊状。 制备透明度高、弹性强的凝胶应控制:左右。 凝胶贮液:.聚丙烯酰胺母液.%,.%,含.尿素,.牛磺 酸,.两性电解质.?,肛四甲基乙二胺和,过硫酸铵 %。 样品提取液:球蛋白%蔗糖.%氯化钠.%甲基绿 谷蛋白.%氢氧化钠 醇溶蛋白%乙醇 水溶蛋白双蒸水 凝胶的制备选择两块 经过硅化处理的玻璃板,其中一块平放在桌面上,均匀 撒适量蒸馏水,然后放上一块比玻璃板稍长一点的塑封膜,用滚筒去掉中间的气泡。 塑封膜作为聚丙烯酰胺凝胶的托膜,将配制好混合均匀的凝胶液倒在膜的中问。另一广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 块玻璃板两侧长边贴有.厚的电工胶布,先将贴有胶布的一侧用 剥离硅烷处理。 然后将经过剥离硅烷处理过的一面压在凝胶上,使凝胶均匀分布,不能有气泡。室温 下?聚合,将凝胶剥下。 .样品的提取 脱脂:取粒去壳苦瓜种子,冰浴研磨,将种子粉末装入离心管。加入 冷丙酮,摇匀,放入.?冰箱冷冻脱脂常温下丙酮会导致苦瓜种子蛋白变性。 后取出,/离已,倒掉上清,重复三次。晾干待用。 提样:分别称取.样品装个.离心管,编号。依次加入.球蛋白提取 液、.谷蛋白提取液、.醇溶蛋白提取液、.水溶蛋白提取液,充分混匀。 球蛋白加入提取液后震荡提取.后取出。/离一,取上清液 一。保存。上样量为。 谷蛋白加入提取液后在。水浴锅中水浴后取出。/离, 取上清液一。保存。上样量为。 醇溶蛋白加入提取液后?冰箱低温提取后。/离心,取上 清液一。冷冻保存。电泳上样量为。 , 水溶蛋入提取液后放入?冰箱低温提取.。/离心 取上清液一。保存。上样量为.。 .电泳 放胶:在电泳槽的冷却板上撒一些蒸馏水,将带有凝胶的托膜平放在上面,使 膜与冷却板充分的接触,驱除气泡。电泳槽连接恒温循环器,温度设置为。。 条件:『负极缓冲液分别为:./的磷酸溶液,./氢氧化钠溶液。将 经『负电极缓冲液浸湿的滤纸条放于凝胶上,正负极之间距离为。 跑胶: 预电泳?,暂停。在离『极.的地方放置.的点 样滤纸块,点样量为。电压上限设为,电流上限设为,电压逐渐从 升至,后,聚焦完成。 固定、染色、脱色:%三氯乙酸中固定,考马斯亮蓝溶液中染色, 、、和。 染色液含. 、.利用超薄层等电聚焦电泳进彳苦瓜杂种纯度鉴定的研究 在含%、%和%的脱色液中脱色次,每次。 通风橱中烘干,分析图谱,也可密封保存。 .结果分析与讨论 ..苦瓜种子球蛋白电泳图谱 图?苦瓜种子球蛋白电泳图谱 .?图.显示苦瓜种子中球蛋白含量较为丰富,球蛋白属于盐溶蛋白,提取液中含 有、成分,电泳条带歪斜、模糊、拖尾、泳道不直。条带歪斜由 于提取液 中盐离子浓度过高,模糊条带则表明聚焦不完全,可能是电泳中的问题或蛋白质聚集 成大分子团,限制了其在凝胶中的迁移能力。李严在提取球蛋白过程中采用 相同的提取液配方,笔者认为提取液中含有的甲基绿成分影响了蛋白的正常泳动,是 引发拖尾的主要原因。泳道不直原因可能是凝胶聚合不均匀或蛋白样品有杂质。固定 后部分载体两性电解质仍残留于凝胶中,两性电解质在酸性条件沉淀并能被染色,导 致凝胶高背景,增加%含量的三氯乙酸固定可解决郭尧君,。 ..苦瓜种子谷蛋白电泳图谱 广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 图苦瓜种子谷蛋白电泳图谱 .?图一显示谷蛋白电泳条带歪斜,模糊,拖尾,分布不均,泳道不直。谷蛋白提 取液中含有钠离子,溶液中盐浓度过高正是条带歪斜的主要原因,另外产生模糊条带 则证明聚焦不完全,这是由于电泳中的问题或蛋白质聚集成大分子团,限制了其在凝 ,。。水浴提取可能会导致部分蛋白质变性, 胶中的迁移能力 残留在蛋白质样品里,导致电泳图谱模糊、拖尾、泳道不直。聂练兵在棉花 水溶蛋白提取条件优化效果最佳水浴温度为。,。蛋白电泳图谱结果表明, 可用作种子纯度检验的谷蛋白质条带少,且不够清晰。广西大学硕士学啦论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 ..苦瓜种子醇溶蛋白电泳图谱 图.苦瓜种子醇溶蛋白电泳图谱 .?图?可见蛋白质条带较少且模糊,不易辨认。经测定,醇溶蛋白含量为 ./,接近蛋白质电泳样品浓度.?. /范围。但电泳图谱条带数量少,可 能是蛋白条带发生丢失或未被固定变性。考马斯亮蓝染色时,醇溶蛋白在染色 和脱色过程中会溶解在染色液或脱色液中,应采用的考马斯亮蓝染色方 .,。蛋白质条带丢失或过淡可能由于蛋白质分子量较低或 法 蛋白质在固定中未被变性,增加三氯乙酸浓度或使用戊二醛固定 即可 .,。汪家政等研究表明,凝胶在固定液中时间过长也可能导致蛋白 质被洗脱下来,进而影响实验的重复性、一致性。 ..苦瓜种子水溶蛋白电泳图谱 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 图?苦瓜种子水溶蛋白电泳图谱.? 图 】可见蛋白质条带比较多,条带之问分离的比较清晰,含量较丰富,泳道 较直,背景浅,因此比较适合用来进行苦瓜品种纯度检验。双蒸水作为提取液,无盐 离二子影响,无杂质残留,不会与蛋白质发生反应导致其变性。 .小结 蛋白质样品是影响超薄层等电聚焦电泳结果的关键因素,蛋白浓度过高或过低、 盐离子浓度都会对电泳结果造成不利影响。电泳结果表明:球蛋白、谷蛋白提取液中 盐浓度过高导致电泳图谱中蛋白条带歪斜、拖尾、泳道不直;样品纯度不高,大分子 蛋白聚集成团或杂质出现导致条带出现不同程度的模糊。醇溶蛋白含量为./, 在含量上满足蛋白质电泳样品的浓度要求,电泳图谱条带少可能 是发生了蛋白丢失或 在固定过程中未发生变性,因此也不适合进行苦瓜种子品种纯度鉴定。水溶蛋白谱带 多,条带、泳道较直,背景清晰,适合进行超薄层等电聚焦电泳。用双蒸水做提取液, 这与孙海燕等研究苦瓜种子发育过程水溶蛋白组分采用的方法一致,双蒸水 无盐离子影响,为优良的溶剂。 电泳过程中应注意的问题有: 在样品的准备过程中,针对不同的作物,其 样品提取方法应在前人的基础上进一步优化、创新。如瓜类种子往往含有大量脂肪, 若脱脂不完全,脂肪可能与蛋白质相互作用,也会导致凝胶背景过深,最终影响鉴定厂。西大掌硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 结果。 应该注意的是,由于超薄层等电聚焦电泳对样品要求不高,样品提取方 法较为简单粗放,因此蛋白质长时间放置容易发生变性。所以,尽量缩短样品提取到 上样的时间,可以有效的避免蛋白样品变性带来的不利影响。西大学硕士学位论文 手超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的 研究 苦瓜水溶蛋白超薄层等电聚焦电泳条件的优化 苦瓜开花后时间左右果实中开始出现肉眼可见种子,.的时问里种子 蛋白含量逐渐增加,时种子基本发育成熟。孙海燕等对发育过程中苦瓜 水溶蛋白组分的研究表明,所有品种苦瓜种子均含有丰富的水溶蛋白。据孙德利 报道,苦瓜种子水溶蛋白在...分子量范围含量丰富。赵建宗 等,优化杂交油葵种子水溶蛋白电泳技术体系。结果表明,其水溶蛋白谱带表 现出丰富的多态性,可用于种子纯度鉴定。刘海顺等分析大豆水溶性蛋白影 响因子,并进行提取条件优化。结果表明,温度的影响最为显著,所得最优提取条件 为:每次加水,温度?,提取次,每次提取时问为。 种子方法操作简单、省时、易于标准化,检验结果稳定、易判别、适用 的种及品种范围广等特点,是积极推行的品种纯度检验技术刘敏轩等,。 是具有高分辨率的技术,运用该技术进行品种真实性鉴定,除了品种种子本 身具有差异蛋白指纹外,正确的实验操作也是鉴定成功的关键因素。本研究旨在通过 对苦瓜种子水溶蛋白的超薄层等电聚焦电泳条件的优化,探讨技术用于苦瓜 品种纯度鉴定的可行性,对苦瓜水溶蛋白电泳谱带进行特征分析,以期建立适合苦瓜 品种纯度鉴定的超薄层等电聚焦电泳技术体系。 .材料与方法 ..实验材料 苦瓜材料种子 ..凝胶制备的筛选 以塑封膜代替专用的聚酯托膜做胶,在基本达到预期效果的前提下,节省了成本。 超薄层凝胶的制备 凝胶溶液含..%,.%聚丙烯酰胺母液,.牛磺酸, ..?,“四甲基乙二胺和%的过硫酸铵 ,.尿素,室温下放爵.凝胶聚合完成。 利用超薄层等电聚焦..行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 采用薄片技术制备超薄层聚丙烯酰胺凝胶王晓峰等,。步骤:选择两块 ×经过硅化处理的玻璃板,其中一块平放在桌面上,均匀撒适量蒸馏水, 然后放上一块比玻璃板稍长一点的塑封膜,用滚筒去掉中间的气泡。塑封膜作为聚丙 烯酰胺凝胶的支持物,将配制好混合均匀的凝胶液倒在膜的中问。另一块玻璃板两侧 长边贴有.厚的电工胶布,先将贴有胶布的一侧用剥离硅烷处理。将经过剥离 硅烷处理过的一面压在凝胶上,使凝胶均匀分布,不能有气泡。室温下聚合, 将凝胶剥下。 普通薄层凝胶的制备 ,.%,%聚丙烯酰胺母液,尿素,. .? , , %。 凝胶制各:选择两块经过硅化处理的玻璃板,其中一块平放在桌 面上,均匀撒适量蒸馏水,然后放上一块比玻璃板稍长一点的塑封膜,用滚筒去掉中 问的气泡。放好压条,压条包括两个长边和一个短边,厚。另一块玻璃板一侧用 剥离硅烷处理,将涂有剥离硅烷的一侧面向膜放好,用文具夹夹好三个边。将配制好 的凝胶液从一侧慢慢倒进去,注意不要产生气泡。室温下聚合,完成凝胶。去 掉文具夹,将凝胶剥下。 电泳聚焦 设备:高压电源,一电泳槽,恒温循环器。 放胶:在电泳槽的冷却板上撒一些蒸馏水,将带有凝胶的托膜平放在上面,使膜 与冷却板充分的接触,驱除气泡。电泳槽连接恒温循环器,温度设置为?。。 电泳:将正负电极纸条放于凝胶两端,正负极相距。预电泳。 暂停,每个泳道上样量为。电流上限设为,电压上限。聚焦完成。 固定、染色、脱色:聚焦后的凝胶在%三氯乙酸中固定,然后在、 考马斯亮蓝溶液中染色。染色后的凝胶在含%乙醇、%乙酸溶液中脱色 次,每次。在烘干机里干燥过夜,图谱分析或密封保存。 ..水溶蛋白提取与上样优化 脱脂前处理:取粒去壳苦瓜种子,冰浴磨碎,装入离心管。加入冷 丙酮一。冷冻脱脂,/离心,倒掉溶液,重复三次。晾干,待 广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电墨塞皇墨整堡董坠墨登丝壅坚窒塑堡壅 用。 ..试验条件 不同脱脂处理 称取两份.样品,一份经过次脱脂处理,另一份是直接磨碎的苦瓜种子, 分别装入个.离心管,加入.,充分混匀,一份放入?冰箱,另一 份则在常温下提取。.后取出,/离心,取上清液一。保存。上样 量为。 不同提取温度 称取两份.脱脂样品装入个.离心管,加入.,充分混匀, 冰箱,另一份则在常温下提取。.后取出,/离心,取 一份放入 上清液一。保存。上样量为。 不同提取时间 称取份脱脂样品,每份.,装入个.离心管,各加入., 混匀后?冰箱分别提取.,,.,/离心,取上清液一。保存。 上样量。 不同上样量 /葛 称取. 脱脂样品加入.,混匀后?冰箱低温提取., 一,。。保存上清液。电泳上样梯度为,,,。 不同样品浓度 取份各装有.脱脂样品的.离心管,分别加入.,.,., 混匀后?冰箱提取.,/离心,取上清液.。保存。电泳上样量 为.。 .结果分析与讨论 ..不同厚度凝胶电泳效果对比西大掌硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 超薄层凝胶 普通薄层凝胶一 图?不同厚度凝胶对电泳效果的影响.? 从图.可见,.超薄层凝胶药品消耗少,无背景,条带分辨率高、数量多; 而普通薄层凝胶则药品消耗多,背景较深,条带分辨率低、数量少。凝胶太厚, 则在固定时候,凝胶里的两性电解质不能完全萃取出来,在染色的时候,残留在凝胶 里的两性电解质会被染色,进而导致背景加深。凝胶是蛋白质电泳的载体,若凝胶较 厚,导电率则会降低,蛋白质移动速度减缓。 ..脱脂处理对电泳效果的影响 脱目器次处理 无脱脂处理 图?脱脂处理对电泳效果的影响 .?从图?可以看出经过脱脂处理的电泳图谱清晰,基本无背景;而无脱脂处理的 对照则背景很深,影响了图片的美观及对图片的阅读,蛋白质谱带明显减少,表明脂 肪阻碍了蛋白质的提取。广西大学硕士学位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进于苦瓜杂种纯度鉴定的研究 ..不同提取温度对电泳效果的影响 室温提取样品 鸳警奠鬟蠹萋蕊 。 鹣攀“。霉, ?,菇缈嘲攀黪赫豢 臀~羹 鋈差蒜麓藿誊 慧盏麓鼙鼙鬻篱 图样品提取温度对电泳的影响 .? 图?可以看出,。条件提取的样品,蛋白电泳谱带整齐一致,条带细,泳道 直。说明该条件下提取出来的蛋白正常,并能较好的反映在电泳图谱上;常温下提取 的蛋白质样品的电泳图谱中基本没有正常的电泳条带,条带模糊,表明蛋白质样品发 生了变性。蛋白质条带呈波浪形,通常原因有样品中赫浓度过高、蛋白质变性,载体 两性电解质,电极液或电极不洁净也会产生波浪条带 .,。 ..蛋白质提取时问对电泳效果的影响利用超薄层等电聚焦电泳进于苦瓜杂种纯度鉴定的研究 图.不同蛋白提取时问对电泳效果的影响 .? 图?可见,在相同电泳条件不同提取时间对比中,提取时间为.的水溶蛋白 样品电泳图谱最差,蛋白质浓度低,条带最少,且部分区域蛋白条带发生缺失或不够 清晰;提取时间为的蛋白质样品虽然条带较清晰,但部分浓度低的蛋白还是没有 显现出来;提取时问为.的样品电泳图谱效果最好,蛋白质条带清晰,数量最多, 为最佳的蛋白提取时间。李春生等在红籽瓜种子水溶蛋白的最佳提取时问为 .。一定程度的延长提取时问会使蛋白谱带的条数增加,时问太长则蛋白质易水解 或变性。 ..上样量对电泳效果的影响 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜.杂种纯度鉴定的研究 图?不同上样量对电泳效果的影响 .?图?见,相同电泳条件不同上样量的对比中,,上样量电泳图谱效果最差,蛋 白质条带数量最少且部分区域不够清晰;、、上样量电泳图谱效果较好, 蛋白质条带数量上一致,清晰度高,但是、上样量泳道过宽,且不 够均匀, 原因是单个泳道上蛋白质含量超过标准值,影响总体点样数量; 上样量泳道窄, 分辨率符合要求,不影响上样,蛋白质条带清晰,是最佳的上样量。加样量取决于样 品中蛋白质的种类和含量以及检测方法的灵敏度,如用考马斯亮蓝染色时加样 量可为?,样品浓度以.?/为宜,最适加样体积为?郭尧君, 。 ..样品浓度对电泳效果的影响广西大掌硕士掌位论文 利用超薄层等电聚焦电泳进行苦瓜杂种纯度鉴定的研究 图水溶蛋白浓度对电泳效果的影响 .?从图?可见,相同电泳条件不同提取液量对比中,加.提取液和.提 取液处理电泳图谱正常,其中.效果更好,蛋白质条带分辨率高,泳道比较直, 条带也比较多,以.提取液处理的电泳图谱效果较差,蛋白质条带分辨率低,数 量基本与.提取液处理一致;.提取液处理电泳图谱不正常,泳道、条带歪 斜,数量少,最佳 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 是加.提取液。需要说明的是,并非提取样品中蛋白质浓 度越高越好,若浓度过高会致使电泳谱带收缩,条带模糊,背景色深。原因是提取液 过少导致得到的非蛋白质物质含量过高,影响了电泳谱带的质量,也会导致样品提取 不完全;当然提取液过多的则样品浓度被稀释,部分谱带不能显示出来。提取液的用 量以:或:为宜李严,。对考马斯亮蓝来说,每个泳道?的蛋白质 粗提物或.的蛋白组分是合理的上样浓度汪家政等,。 .小结 超薄层等电聚焦电泳受仪器、药品、实验操作等多种因素影响,任何条件设置不 当都会改变电泳的结果,甚至与原来的结果南辕