猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定 猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜 血清型鉴定 《上海畜牧兽医通讯》2012年第2期?19? 猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定 李富祥宋建领李华春胡骑 (云南省畜牧兽医科学院云南昆明650224) 【摘要】从病死母猪肺脏中分离到一株革兰氏阴性小杆菌,用生理生化鉴定,药敏试验,致病性试验和PCR鉴定 方法对分离菌株进行鉴定,并用多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物对分离株的荚膜血清型进行鉴定.结果表明:本茵为 猪多杀性巴氏杆菌,对多种抗生素高度敏感,对小白鼠有强致病性;PCR扩增16SrDNA基因获得1415bp片段,分 离株的16SrDNA核苷酸序列与多杀性巴氏杆菌(AY078999)的同源性为99,因此该分离菌株被鉴定为致病性巴 氏杆茵,命名为YN20110122株;本茵分离株为荚膜A型血清型多杀性巴氏杆菌. 关键词:多杀性巴氏杆茵;分离;鉴定;16SrDNA;荚膜血清型 多杀性巴氏杆菌是引起畜禽及人的巴氏杆菌病的病原 体,它属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属的成员,多杀性巴氏杆菌 分为三个亚种:多杀性巴氏杆菌多杀亚种(P.multocidassp, multocida),败血亚种(P.multocidassp,septica)和杀禽亚种 (P.multocidassp,gallicida).多杀性巴氏杆菌是普遍存在的 致病菌,能够引发动物的各类疾病,如牛的出血性败血症,猪 的萎缩性鼻炎,兔的脓血症,野生和家养鸟类的禽霍乱,以及 人类各种与动物叮咬有关的疾病,包括皮下感染,脓毒性的 关节炎,脑膜炎,心内膜炎,腹膜炎,肺炎和败血症等". 猪巴氏杆菌病又称猪肺疫或猪出血性败血症,是猪的一种急 性,热性传染病,给世界养猪业造成极大的经济损失,我国将 其划分为二类动物疫病.近年来,我国海南,湖北,湖南,广 东,广西,上海,海南,四JII,青海和辽宁等省份时有猪肺疫病 例报道".猪肺疫的发病率呈现上升趋势,在某些规模化 猪场其发病率高达5O,死亡率高达170,严重威胁着现 代养猪业的健康发展.因此猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴 定,以及流行株的血清型鉴定,对猪肺疫的诊断和防控具有 重要意义. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1病料来源 云南省某规模化养猪场病死后备母猪的肺脏和肝脏. 1.2主要试剂 细菌基因组提取试剂盒购自上海生工;Taq酶购自宝生 物;2kDNAMarker购自北京全式金生物技术有限公司;营 养琼脂,麦康凯琼脂,细菌生化鉴定管,细菌革兰氏染色液和 细菌瑞氏染色液均购自杭州天和微生物试剂有限公司. 1.3引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 设计巴氏杆菌鉴别引物",引物序列如下:Pm种特异 性引物Pm—Pf:5'.ATCCGCTATTTACCCAGTGG3'和 PHl_Pr:5,一GCTGTAAACGAAcTcGCCAC一3'(扩增片段为 457bp);PmA型荚膜引物:Pm-A—Pf:GATGC— CAAAATCGCAGTCAG和Pm—A—Pr:TGTTGCCATCAT— TGTCAGTG(扩增片段为1048bp);PmB型荚膜引物Pm— B-Pf:CATTTATCCAAGCTCCACC和Pm-B-Pr:GC— CCGAGAGTTTCAATCC(扩增片段为758bp);PmD型荚 膜引物Pm—D-Pf:TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC和 Pm一【)_Pr:CATCTACCCACTCAACCATATCAG(扩增片段 *为通讯作者. 基金项目:(1)云南省农业科技创新工程(2008LA019);(2)云南 省现代农业生猪产业技术体系生猪疾病控制研究项目. 为647bp).设计细菌16SrDNA通用引物",引物均由上 海生工合成. 1.4实验动物 昆明系小白鼠购自昆明医学院. 1.5细菌分离培养 将病料划线接种于营养琼脂平板,37?培养过夜,再挑 取典型单菌落接种于营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板, 37?培养过夜,观察本菌在营养琼脂和麦康凯琼脂上的生 长情况. 1.6细菌形态观察 挑取营养琼脂平板上单菌落,涂片,革兰氏染色和瑞氏 染色,镜检,观察细菌形态. 1.7生化鉴定和药敏实验 将本菌纯培养物接种于32种细菌鉴定生化管,观察细 菌的生化特性,方法按照使用说明书操作步骤进行.再将本 菌纯培养物用灭菌生理盐水稀释后涂布于营养琼脂,按美国 临床试验 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 研究所CLSI/NCCLS1999,2005年颁布的药 敏实验标准和规定进行实验和判定结果.判定标准为抑菌 圈直径在15,20mm为高敏,1O,14mm为中敏,10mm以 下为低敏,0mm为不敏感(耐药). 1.8小白鼠致病性实验 将纯培养细菌稀释于灭菌生理盐水制成菌液,用细菌平 板记数法测定菌液的浓度为1×10.CFU/ml,腹腔注射4只 小白鼠,0.2ml/只,并设肉汤作空白对照, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 发病和致死 情况,观察本菌对小白鼠的致病性,剖解病死小白鼠,无菌采 肺脏,肝脏做细菌分离培养,同时观察病理变化. 1.916SrDNA核苷酸序列扩增及序列分析 按试剂盒操作说明,提取细菌基因组DNA作为PCR模 板,用细菌16SrDNA引物扩增细菌16SrDNA基因片段. 5Ol反映体系:ddH2O38.51,10×Taqreactionbuffer(Mg - +-plus)5l,dNTP(2.5mM)4/,I,上下游引物各1l,模板 0.25l,Taq0.25l.扩增条件为96?预变性3min(94? 30S,57?30S,72?90s)30个循环,72?延伸10min.扩 增产物送上海生工测序,将测序结果与GenBank上其它细菌 的序列进行同源性分析. l_10分离株PCR鉴定及荚膜血清型PCR鉴定 用Pm种特异性引物对分离株进行PCR鉴定.分别用 多杀性巴氏杆菌的3对荚膜鉴别引物对分离株进行荚膜血 清型PCR鉴定,反应体系(50l体系):ddH2O38.5l,lO× Taqreactionbuffer(Mg+plus)5"l,dNTP(2.5rrlM)4"l, 上下游引物各1/,1,模板0.251,Taq0.251;反应条件: ? 20?《上海畜牧兽医通讯》2012年第2期 95?变性5rain,(94?30s,56?30s,72?45s)35个循 环,72?延伸10min,将PCR产物用1.2琼脂糖凝胶电泳 检测. 2结果 2.1细菌培养特性 在营养琼脂上形成直径1mm灰白色小菌落,菌落光滑, 湿润,边缘整齐.在麦康凯琼脂上不生长. 2.2细茵染色特性 革兰氏染色呈阴性小杆菌,常成对,单个或均匀分散排 列,两级着色,形似双球菌;瑞氏染色可见明显的两极着色. 2.3生化试验 本菌氧化酶和过氧化氢酶阳性;分解葡萄糖,蔗糖,甘露 糖,产酸不产气;分解果糖,纤维二糖,侧金盏花醇,卫茅醇丙 二醇,产酸产气;硝酸盐还原阳性;不分解乳糖,半乳糖,麦芽 糖,甘露醇,木糖,棉籽糖,山梨糖,菊糖,曹糖,阿拉伯糖,鼠 李糖,水杨素,七叶苷;MR试验阳性,VP试验,HS,淀粉, 马尿酸盐,精氨酸脱羧酶,鸟氨酸脱羧酶,赖氨酸脱羧酶试验 阴性.依据分离菌株的生化特性将其鉴定为侵肺巴氏 杆菌. 2.4药敏试验 本菌对青霉素G,阿莫西林,氨苄西林,头孢唑啉,头孢 噻吩,阿米卡星,诺氟沙星,氧氟沙星,红霉素,氯霉素,庆大 霉素,四环素,卡那霉素高度敏感,抑菌圈直径分别为25,22, 23,26,27,27,3O,3O,27,33,22,23,18mm,仅对磺胺甲唑 耐药. 2.5致病性试验 小白鼠腹腔接种2×10cvu/只,在接种菌液后,4只小 白鼠均在4h出现精神沉郁,被毛逆立,站立不稳,呼吸急促 等典型临床症状,4只小白鼠均在18h以内死亡,剖检病死小 白鼠可见肺脏充血,出血.再次从病死小白鼠肺脏和肝脏分 离到相同细菌,表明该株细菌对小白鼠有较强的致病性. 2.616SrDNA核苷酸序列扩增及序列分析 扩增片段大小在1o002ooobp之间,与预期片段 l415bp大小相符,将测序结果与GenBank上其它细菌进行 同源性分析,结果表明扩增序列与GenBank公布的荚膜A 型多杀性巴氏杆菌(登陆号为AY078999)同源性为99,进 一 步证实该菌株为致病性多杀性巴氏杆菌. 1】jI【 图1分离株16SrDNA基因PCR扩增 1:16SrDNAPCR产物,M:15kDNAMarker 2.7分离株荚膜血清型鉴定 1234M 图2分离株荚膜血清型PCR鉴定 1:Pm种特异性引物PCR产物,2:PmA型荚膜引物PCR产 物.3:PmB型荚膜引物PCR产物,4:PmD型荚膜引物PCR产物, M:15kDNAMarker. Pm种特异性引物扩增片段大小在250,500bp之间, 与预期片段457bp大小相符,表明分离株为多杀性巴氏杆 菌.3对Pm荚膜血清型引物中,仅有PmA型英膜引物扩 增出条带(2号泳道),且扩增条带大小在10002000bp之 间,与预期片段1048bp大小相符,表明分离株为荚膜A型 多杀性巴氏杆菌. 3讨论 该病例发生在云南某规模化养猪场,2011年该场从外 地新购买一批后备母猪,于隔离区饲养,每过几天就死亡1 头,口鼻流出血红色泡沫,共死亡4头母猪,对病死猪剖解可 见肺脏出血,肝脏肿大,肾脏无病变,淋巴结肿大,脾脏有出 血点,喉头无病变.采集病料研磨成组织匀浆,分别用BBI 公司的病毒RNA提取试剂盒和病毒DNA提取试剂盒提取 RNA/DNA,进行病毒核酸检测,结果CSFV,PRRSV,PRV, PPV病毒核酸呈阴性,排除了csFV,PRRSV,PRV,PPV病 毒感染的可能性.同时取肺脏组织进行细菌分离培养,结果 在营养琼脂上长出大量针尖大小的均一菌落,革兰氏染色为 两端钝圆的阴性小杆菌,瑞氏染色呈两极着色小杆菌.对分 离株进行细菌生理生化鉴定和16SrDNA核苷酸序列分析 比对,结果分离株与AY078999为代表的诸多多杀性巴氏杆 菌同源性在98,99之间,因此将分离株鉴定为多杀性巴 氏杆菌. 目前,我国猪流行的多杀性巴氏杆菌主要是荚膜A,B 和D型,没有E型报道.其中A和B型引起猪肺疫,D型引 起猪传染性萎缩性鼻炎.本研究用Townsend等人的研究 方法对细菌的荚膜血清型进行鉴定,结果为荚膜A型,与我 国主要流行的荚膜A型相一致,因此将本病例确诊为猪肺 疫.荚膜分型PCR方法已得到国内学者的认同,它替代了 繁琐的传统的血清学方法,并克服了传统血清学方法受培养 条件等因素影响的缺点".. 药物敏感试验表明,该分离株对13种常用抗生素高度 敏感,但对磺胺耐药情况与前人研究结果不符",未呈现 出多重耐药情况,这给该病的药物治疗提供重要的参考价 值,本猪场选用敏感抗生素进行治疗,取得了很好的治疗 效果. 《上海畜牧兽医通讯》2012年第2期 小反刍兽疫病毒H蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 孙洁杨俊兴吕建强阮周曦陶虹陈兵秦智锋花群义 (深圳出人境检验检疫局动植物检验检疫技术中心广东深圳518001) 【摘要】用基因工程表达的小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus,PPRV)H 蛋白免疫Balb/C小鼠, 取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗PPRVH蛋 白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C6和4B10),其细胞培养上清液ELISA效价分别为1:256和1:128,腹水 ELISA效价分别为1:128000和1:64000.亚型鉴定表明,2C6和4B10分别为IgG2b和IgG2a.ELlSA结果显示, 2株单克隆抗体仅与PPRVH蛋白和PPRV反应,不与其它相关病毒反应,表明2株单克隆抗体特异性良好.这2 株单克隆抗体的获得为研究PPRVH蛋白生物学特性及建立PPRV免疫学检测方法奠定了基础. 关键词:小反刍兽疫病毒;H蛋白;单克隆抗体 小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus, PPRV)属于副黏病毒科麻疹病毒属,可以引起小反刍兽疫 (pestedespetitsruminants,PPR)..对羊,尤其是山羊危 害严重,野生动物也可感染.世界动物卫生组织(OIE)将 PPR列为法定报告传染病..自1940年首次报道以来,该 病先后在大多数非洲国家,中东地区以及亚洲的印度,尼泊 尔,巴基斯坦等国广泛流行,对我国养羊业构成了严重威 胁.2007年7月,我国西藏首次暴发PPR疫情,并对当地 养殖业造成巨大的经济损失".PPRVH基因全长 1852bp,由H基因编码的H糖蛋白含有609个氨基酸,具 有神经氨酸酶活性和血凝素活性,H糖蛋白是主要的保护性 免疫原,能够诱导机体产生中和抗体.本研究用原核表达 的PPRVH蛋白免疫小鼠,制备抗PPRVH蛋白特异性单 克隆抗体,有助于进一步研究PPRVH蛋白的生物学活性 和建立PPRV免疫学检测方法. *为通讯作者. 基金项目:国家863计划项目(2012AA100501和2006AA10Z445). 1材料与方法 1.1材料 1.1.1PPRVH蛋白:原核表达的PPRVH蛋白为本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 组前期制备,经SDPAGE和Westernblot鉴定,H蛋白具 有免疫学活性. 1.1.2抗原与细胞系:小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsru— minantsvirus,PPRV),蓝舌病病毒(Bluetonguevirus, BTV),鹿流行性出血病病毒(Epizootichaemorrhagicdisease virus,EHDV),赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKV), 水泡性口炎病病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)等灭活 抗原,BHK一21细胞,SP2/0骨髓瘤细胞均由深圳出入境检验 检疫局动植中心动检实验室保存,0型口蹄疫病毒(footand mouthdiseasevirus,FMDV)灭活抗原购自兰州兽医研 究所. 1.1.3主要试剂及试剂盒:PEG-4000,RPMI一1640液体培 养基,新生胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品,弗氏佐剂, HAT和HT选择性培养基,HRP标记的羊抗鼠IgG,石蜡油 'm?,'''',llll','l',m,,l''''m,,''','',lm,'''ml,l'''mm'''?mm'm,,,,'',,,m,'' 参考文献 [1]RuizdelaHermosaA,Amunategui—PratsI,Hurtado—Caballero E,eta1.PsoasabscessduetOPasteurellamult0cida[J].RevGas— troenterolMex,20H,76(4):366,369. 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