栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂杂交子一代与其双亲同工酶的比较研究

栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂杂交子一代与其双亲同工酶的比较研究 栉孔扇贝?×虾夷扇贝?杂交子一代与其 双亲同工酶的比较研究 第27卷第5期 2006年10月 海洋水产研究 MARINEFISHERIESRESEARCH Vo1.27,NO.5 oct.,2006 栉孔扇贝旱×虾夷扇贝杂交子一代 与其双亲同工酶的比较研究 何斌杨爱国王清印卜刘志鸿周丽青 (农业部海洋渔业资源可持续利用重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071) (上海水产大学生命科学与技术学院,200090) 摘要采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对栉孔扇贝(Chlamysfarreri)旱,虾夷扇贝(Pa— tinopectenyessoensis)及其杂交子一代的ADH,MDH,SDH,IDH,ME和SOD共6种同工酶的酶 谱进行分析,以探讨双亲遗传物质在杂交子代中的表达情况及杂交子代基因的表达特征.结果表明, 杂交子代的同工酶酶谱与母本栉孔扇贝的相似,而与父本虾夷扇贝的明显不同,说明父本虾夷扇贝的 同工酶在杂交子代中没有表达.幼虫阶段的同工酶酶谱亦表明,父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代 的幼虫阶段仍然没有表达.另外,在对母本栉孔扇贝群体和杂交子代群体的同工酶酶谱进行比较研 究时发现,在杂交子代中出现了一定比例的杂合子,因此不能确定杂交子代是由雌 核发育而来. 关键词栉孔扇贝虾夷扇贝 中图分类号$968.313;Q321.2 杂交同工酶 文献识别码A文章编号1000—7075(2006)05—0023—05 ComparativestudyonisozymesinthehybridsofChlamys farreri旱XPatinopectenyessoensisandtheirparentstocks HEBin,YANGAi—guoWANGQing—yin LIUZhi—hongZHOULi—qing (KeyLaboratoryforSustainableUtilizitionofMarineFisheriesResources,MinisterofAgriculture, YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071) (CollegeofAqua—lifeScienceandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,200090) ABSTRACTZymogramsofsixisozyme,suchasAlcoholdehydrogenase(ADH),Malatede— hydrogenase(MDH),Sorbitoldehydrogenase(SDH),Isocitratedehydrogenase(IDH),Malic enzyme(ME)andSuperoxidedismutase(SOD),inChlamysfarreri 旱,Patinopectenyessoensis andtheirhybridswereanalyzedbyverticalpolyacrylamidegele1ectrophoresisinordertoin— vestigatehowparents'geneticmaterialwasexpressedintheirhybridsandthecharacterofthe hybrids'gene.Theresultsshowedthatisozymezymograms0fChlamysfarreri早 andhybrids weresimilar,butthezymograms0fPatinopectenyessoensisandhybridswereobviouslydif一 国家科技攻关计划项目(2004BA526B0103)和海水养殖种苗培育技术标准平台技 术项目(2oo4AA6O332O)共同资助 *通讯作者.E—mail:qywang@public.qd.sd.ca 收稿日期:2006—01—20;接受日期:2006—04—17 作者简介:何斌(1980一),男,硕士研究生,主要从事水产动物遗传育种研究.E— mail:bhe8010@126.corn,Tel:(0532)85811982 海洋水产研究第27卷 ferent.whichindicatedthattheisozymesofPatinopectenyessoensiswerenotexpressedinthe hybrids.ThezymogramsoflarvalstagealsoindicatedthattheisozymesofPatinopectenyes — soensiswerenotexpressedinlarvalstageofthehybrids.Otherwise,thereappearedsome proportionalheterozygosityinhybridswhenwecarriedoutthecomparativestudiesonisozy mes ofChlamysfarreripopulationandhybridpopulation.Sowecouldtmakesurethatthehy— bridswerethefilia1generationofgynogenesis. KEYWORDSChlamys{arreriPatinopectenyessoensisHybridizeIsozyme 扇贝属软体动物门(Mollusa),瓣鳃纲(Lamellibranchia),翼形亚纲(Pterimorphia),珍 珠贝目(Pterioida), 扇贝科(Pectinidae).其闭壳肌大,肥嫩鲜美,营养丰富,深受广大人民群众欢迎.其中, 栉孔扇贝(Chlamys farreri)和虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)同科不同属,双方的生物学特征差异显 着,在主要经济性状方面 所表现出的优缺点具有互补性,杂交后代可供选择的变异幅度广泛,有可能通过杂 交途径获得新的优良品种. 为解决制约扇贝养殖业发展中的瓶颈问题,培育生长快,抗逆性强的扇贝养殖新品 种,课题组将栉孔扇贝和虾 夷扇贝进行杂交,所得杂交子一代抗逆性强,在第2年度夏时无异常死亡,生长速度 比对照组提高23,目前 已经在生产中推广应用(杨爱国等2004). 同工酶是基因表达的直接产物,它反映了编码酶蛋白的DNA序列信息,酶谱的变 化反映了等位基因和位 点的变化.因此许多学者都利用同工酶技术来研究亲本等位基因在杂交子代中的表达情况.从目前的研究状 况来看,亲本的等位基因在杂交子代中一般有4种表达模式:(1)两亲本基因的同步表达;(2)父本基因相对于 母本基因延迟表达;(3)母本基因相对于父本基因延迟表达;(4)两亲本基因均受到抑制(吴玉萍等2000). 陈景等(1998)在对普通栽培稻×小粒野稻F1酯酶同工酶进行研究时发现,杂交F1集中显示双亲的所有酶 带,并认为F1的酶带是由于双亲互补的多个结构基因通过一系列调控机制而表达的结果.叶星等(2001) 对广东鲂,团头鲂及其杂交子一代肌肝眼3种组织的4种同工酶进行分析,发现杂交子一代同工酶表型有些具 有来自双亲的区带总和,有些则单独表达父本或母本的基因,更有些出现父母本没有的表型.王小虎等(2002) 利用同工酶技术研究鲤鲫人工多倍体谱系中同工酶和蛋白的基因表达时发现,多数情况下,在杂种二倍体 (CA)中,其二倍体亲本双方大部分基因都是共同表达,偶尔也观察到母本和父本基因在杂交子代中的表达受 到完全抑制而优先表达对方基因的情况,如红鲤Ldh-C基因和镜鲤中的Mdh—A和Mdh—B基因,甚至出现了双 亲的等位基因在杂交子代的表达均受到抑制的情况,如红鲤,红鲫和镜鲤的Mdh-B基因. 有关同工酶技术在栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交育种研究中的应用,目前还未见报道.作者应用ISSR技术 已证实栉孔扇贝和虾夷扇贝的杂交子代在幼虫阶段确实为杂交种,但无论正交或反交,杂交子代在遗传上都偏 向于各自的母本(另文发表).为了进一步了解双亲遗传物质在杂交子代中的表达情况以及杂交子代基因的表 达特征,本文对栉孔扇贝旱×虾夷扇贝杂交子一代与其双亲的同工酶酶谱进行了比较研究. 1材料与方法 1.1材料 栉孔扇贝和虾夷扇贝的杂交实验于2004年4月在山东胶南育苗场进行.亲贝产卵排精后取闭壳肌于超 低温冰箱(--85?)中保存,杂交子代培育至次年4月取闭壳肌于超低温冰箱中保存.亲贝和杂交子代成贝均 取35个个体用于分析.. 1.2方法 1.2.1样品的制备 制取酶液时,取闭壳肌于酶提取液(预冷重蒸水含0.05巯基乙醇)中冰浴匀浆(v/w=3:1),匀浆液在 第5期何斌等:栉孔扇贝早×虾夷扇贝杂交子一代与其双亲同工酶的比较研究25 冷冻离心机中以12000r/min4?离心30rain,取上清,加入适量溴酚蓝后分装,放入超低温冰箱中保存备用. 1.2.2电泳 采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法.分离胶浓度为8.2(pH8.9),浓缩胶浓度为3.6%(pH6.7), 电泳在4?冰箱中进行.TG缓冲系统(pH8.3)恒压230V,TC缓冲系统(pH7.0)恒压80V,电泳时间4, 5h.同工酶的显色方法参考胡能书等(1988),并略作改动.染色完毕后用7.5冰醋酸溶液固定,生物电泳 图像系统进行摄影记录. 1.2.3同工酶的命名 同工酶的命名以各酶带的相对迁移率(Rf)从小到大依次命名,即从阴极向阳极运动的酶带开始依次命名 为a,b,C……,Rf=1/L,其中:l为阴极端至各谱带中点的距离,L为阴极端至指示剂终 点的距离.基因位点以 它所编码的同工酶的缩写斜体字母表示,按同样顺序分别命名为1,2,3……. 2结果与分析 2.1栉孔扇贝,虾夷扇贝及其杂交子代同工酶酶谱比较 栉孔扇贝,虾夷扇贝及其杂交子代肌肉组织的同工酶酶谱比较见图1和图2. 由图1可知,栉孔扇贝的ADH有两个位点编码,均单态纯合.杂交子代的ADH一1单态纯合,而ADH一2 多态杂合,由3个等位基因控制表达,且杂合子可见.虾夷扇贝的ADH只有1个位点编码,位于栉孔扇贝和 杂交子代稚贝ADH两个位点之间,且单态纯合;栉孔扇贝和杂交子代的MDH都只有1个位点编码,栉孔扇 贝的单态纯合,而杂交子代的多态杂合,且杂合子可见.虾夷扇贝的MDH有两个位点编码,均单态纯合;3种 贝的IDH均有两个位点编码,且单态纯合;3种贝的SDH均只有1个位点编码,且单态纯合;栉孔扇贝和杂交 子代的SOD都有两个位点编码,它们的SOD-2都多态杂合,都由两个等位基因控制表达,且杂合子可见.虾 夷扇贝的S0D共有4个位点编码,这4个位点均单态纯合;栉孔扇贝和杂交子代的ME有3个位点编码,均单 态纯合.虾夷扇贝的ME只有1个位点编码,且单态纯合.总的来说,双亲之间的酶谱相差较大,杂交子代的 酶谱与母本栉孔扇贝的酶谱基本一致,而与父本虾夷扇贝的酶谱完全不同,没有出现"杂交酶带"或"互补酶 带",表明父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代中没有表达.由图2可知,在幼虫的各个不同发育阶段,杂交子代 的酶谱仍与母本栉孔扇贝的酶谱相似,父本虾夷扇贝的特异酶带(图2中箭头所指)在杂交子代中并没有发现, 表明父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代的幼虫阶段仍然没有表达. 1.母本栉孔扇贝的酶谱IsozymezymogramofChlamysr早,2.杂交子代的酶谱 Isozymezymogramofthehybrids,3.父 本虾夷扇贝的酶谱IsozymezymogramofPatinopectenyessoensis;A,F依次为同工 酶ADH,MDH,IDH,SDH,SOD和ME 的酶谱A, FarethezymogramofisozymeADH,MDH,IDH,SDH,SODandMErespectively;a,f为 酶带的名称;向上箭 头所指的是杂合子Thenameofisozymebands;uparrowheadsrepresentheterozygote 图1栉孔扇贝早,虾夷扇贝及其杂交子代的同工酶酶谱 Fig.1IsozymezymogramofChlamysr早,Patinopectenyessoensisandtheirhybrids 26海洋水产研究第27卷 1,4,7,1O,13,16依次为栉孑L扇贝的4细胞期,32细胞期,囊胚期,原肠胚期,担轮幼 虫期和D形幼虫期的酶谱.2,5,8,l1,14, 17依次为杂交子代的4细胞期,32细胞期,囊胚期,原肠胚期,担轮幼虫期和D形幼 虫期的酶谱.3,6,9,12,15,18依次为虾 夷扇贝的4细胞期,32细胞期,囊胚期,原肠胚期,担轮幼虫期和D形幼虫期的酶 谱.A为同工酶SOD的酶谱,B为同工酶 ADH的酶谱.A和B中的箭头所指的是父本虾夷扇贝的特异酶带 1,4,7,1O,13,16:zymogramofChlamysfarr旱 'S4cellsstage,32cellsstage,blastulastage,gastrulaestage,trochophore larvaestageandD-shapelarvaestagerespectively.2,5,8,11,14,17:zymogramofhybrids'4cellsstage,32cellsstage,blastula stage,gastrulaestage,trochophorelarvaestageandD-shapelarvaestagerespectively.3,6,9,1 2,15,18:zymogramofPatin— opectenyessoensis'S4cellsstage,32cellsstage,blastulastage,gastrulaestage,trochophorel arvaestageandD-shapelarvae stagerespectively.A:zymogramofisozymeSOD.B:zymogramofisozymeADH.ArrowheadsinAandBrepresentspecial isozymebandsofPatinopectenyessoensis~ 图2栉孔扇贝旱,虾夷扇贝及其杂交子代不同发育时期的同工酶酶谱 Fig.2IsozymezymogramofdifferentgrowthstagesofChlamysfarr旱andPatinopectenyessoensisandtheirhybrids 2.2母本栉孔扇贝群体和杂交子代群体同工酶酶谱比较 母本栉孔扇贝群体和杂交子代群体肌肉组织的同工酶酶谱如图3所示.由图3可知,在杂交子代群体和 母本栉孔扇贝群体中均出现了一定比例的杂合子,这虽然不能从根本上否定杂交子代由雌核发育而来的可能 性(抑制第二极体产生的雌核发育个体也可能是杂合的),但提示我们,存活下来的杂交子代个体是否为雌核发 育而来值得深入研究. A和B为同工酶ADH的酶谱,C和D为同工酶SOD的酶谱;A和C为母本栉孑L扇贝群体的同工酶酶谱,B和D为杂交子代 群体的同工酶酶谱;A,D中的向上箭头所指的是杂合子 AandB:zymogramofisozymeADH,CandD:zymogramofisozymeSOD;AandC:isozyme zymogramofChlamfarreri 旱population,BandD:isozymezymogramofthehybridspopulation;uparrowheadsinA,Drepresentheterozygote 3讨论 图3母本栉孔扇贝群体和杂交子代群体的同工酶酶谱 Fig.3Isozymezymogramo{Chlamysfarreri早populationandthehybridspopulation 近年来,随着贝类杂交育种研究的不断深入,亲本的遗传物质在杂交子代中的表达方式及其相互作用研究 已成为杂交育种研究的热点之一.本文在对栉孔扇贝,虾夷扇贝及其杂交子代的同工酶酶谱进行比较研究时 发现,父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代中没有表达.关于在杂交过程中父本基因在杂交子代中没有表达的 第5期何斌等:栉孔扇贝旱×虾夷扇贝杂交子一代与其双亲同工酶的比较研究27 现象并不多,但也有相关的报道.如吴清江等(1997)在研究酶的基因剂量效应及其对鱼类远缘杂交的影响时 发现,无论是草鲂杂交种或草鲤杂交种胚胎的各个时期都只见母本(草鱼)的基因表达,父本(团头鲂或鲤)的基 因都未见活动.在草鲂杂种胚胎中也只发现母本草鱼的G一6一PDH基因的表达.Whitt等(1973)在研究等位 基因非同步表达时也观察到某些种间和属间杂种的父本同工酶座位一直到成体也未表达.那么是什么原因导 致父本的同工酶在杂交子代中不表达呢?Ohno(1996)曾提出了一个假说,即父本基因表达延迟或受抑制是由 于母本基因效应子与父本基因之间的部分不亲和,降低了基因识别效率因而推迟基因激活和调控.Whitt等 (1997)对其假说进行了补充和修正,指出双亲基因效应子具有不同的亲和力和阀值才导致等位基因非同步化 表达.李刚等(1983)在对合浦珠母贝,长耳珠母贝,大珠母贝及其种间人工杂交子代的同工酶谱进行比较研 究时也发现,杂交子代的同工酶酶谱与母本合浦珠母贝的酶谱相同,父本基因在杂交子代中没有表达,他认为 造成这种现象的原因有可能是因为杂交子代是由雌核发育而来.但作者在对母本栉孔扇贝群体和杂交子代群 体的同工酶酶谱进行比较时发现,在杂交子代中出现了一定比例的杂合子(如图3所示),因此不能确定杂交子 代是由雌核发育而来.ISSR技术已证实幼虫阶段的杂交子代确为栉孔扇贝和虾夷扇贝的杂交种(另文发表), 但作者对幼虫阶段的同工酶酶谱进行分析时发现,父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代中仍然没有表达(如图2 所示).那么造成这种现象的原因是不是因为父本虾夷扇贝基因在杂交子代中的表达受到抑制呢?而父本虾 夷扇贝基因的表达受到抑制的根本原因又是什么?是不是还有其他的原因导致父 本虾夷扇贝基因在杂交子代 中不表达?这些问题有待于进一步研究. 参考文献 王小虎.叶玉珍,吴清江.2002.鲤鲫人工多倍体谱系中同工酶和蛋白的基因表达.水生生物,26(5):425,432 叶星,谢刚,许淑英,庞世勋,祁宝伦,潘德博.2001.广东鲂(旱)×团头鲂()杂交子一代及其双亲同工酶的比较.上海水产大学,lO (2):118,l22 朱新产,张涌.2000.胚胎发育合子型基因激活(ZGA)的调控机制.西北农业大学,28(2):91,97 吴玉萍,叶玉珍.吴清江.2000.基因组叠加生物型的基因表达特征.遗传,27(2):lO8,113 吴清江,付洪拓,叶玉珍.1997.酶的基因剂量效应及其对鱼类远缘杂交的影响.水生生物,21(2):143,151 张红卫主编.2001.发育生物学.北京:高等教育出版社 李刚,姜卫国,魏贻尧.1983.合浦珠母贝,长耳珠母贝和大珠母贝种间人工杂交的研究?.同工酶谱的比较研究.热带海洋,2(4):32l,328 杨爱国,王清印,刘志鸿,周丽青.2004.栉孔扇贝与虾夷扇贝杂交及子一代的遗传性状.海洋水产研究,25(5):1,5 苏秀榕,吕振明,李太武,林志华,柴雪良.2005.泥蚶(Tegillarcagranosa)个体发育过程中同工酶基因表达与调控的研究.海洋与湖沼,36(1): 8l,87 陈景,张建中,刘康平.1998.普通栽培稻×小粒野稻Fl酯酶同工酶研究.湛江海洋大学,18(1):7O,72 胡能书,万贤国.1988.同工酶技术及应用.长沙:湖南科学技术出版社 徐成,王可玲,徐永立,张培军.2002.雌核发育牙鲆同工酶基因的重组及父方基因的表达.海洋与湖沼,33(1):62,67 Ohno,S.1996.Thepreferentialactivationofmaternallyderivedallelesindevelopmentofinte rspecifichybrids.InDefendi.V.ed.HeterosDecific genomeinteraction.WistarInstitutePress,Philadelphia.137,150 Schmidtke,J.eta1.1976.Geneactioninfishoftetraploidorigin. chem.Genet,13:301 Whitt,G.S.eta1.1973.Allelicexpressionatenzymelociinanintertribalhybridsunfish. 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