东北红豆杉中10-DABⅢ的提取纯化及多西紫杉醇的半合成(可编辑)

东北红豆杉中10-DABⅢ的提取纯化及多西紫杉醇的半合成(可编辑) 东北红豆杉中10-DAB?的提取纯化及多西紫杉醇的半 合成 东北林业大学 硕士学位论文 东北红豆杉中10-DAB?的提取纯化及多西紫杉醇的半合成 姓名:李双明 申请学位级别:硕士 专业:生药学 指导教师:付玉杰 20070601摘要 摘要 本文以东北红豆杉枝叶为原料,对多西紫杉醇的前体化合物??. 脱乙酰基巴卡 亭简称一 的提取纯化工艺进行了研究,并以. 为原料与合成的 侧 链前体进行了酯化缩合,合成了抗癌药物多西紫杉醇。并得出以 下结论: 确立了用于定性和定量 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 的条件:色谱柱. . × ,检测波长. ,流速 /,进样量吐,流动相为. 乙腈?水/,. 乙腈一水/体系。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,在此色谱条件下 进行. 的检测,精密度高,重现性好,准确度高,适用于红豆杉及其他制剂中 . 的质量分析检验。 确立了东北红豆杉枝叶中一 的最佳提取工艺参数:提取 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 为超声提 取;提取溶剂为%;提取固液比为:;提取时间为 ;提取次数为次。在 此提取工艺下,. 提取率为.%。 确立了东北红豆杉枝叶中. 的最佳纯化工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 :首先对东北红豆杉枝 叶粗提物进行醇提水沉比例为:,将紫杉醇和三尖杉宁碱等弱极性物质沉淀除 去,将 留在水相中,用氯仿萃取含有. 的水相萃取比例为: ,萃取次数为次,将水相中的. 转移到有机相中,进行硅胶柱层析,以 乙酸乙酯:石油醚:,为洗脱剂,收集硅胶柱层析富含. 的馏分, 可以得到含量为%. 的粗品,收率为.%。再通过乙腈结晶、乙酸乙 酯/ 石油醚重结晶的方法,可以得到纯度为%的. 白色粉末。整个纯化过程. 的收率为%。 以纯化后的. 为原料,合成了多西紫杉醇,在参考文献基础上对合成路 线进行了部分改进。 首先,合成其侧链前体,以舡甲基苯甲胺和苯甲醛为初始原料合成亚胺,以羟基乙 酸和乙酰氯为初始原料合成烯酮,再将亚胺与烯酮进行四元环合反应,合成.内酰胺。 将.内酰胺进行脱乙酰和酸催化开环反应得到具有两个手性中心的开环产物,开环产物 在钯炭的催化作用下氢化脱苄,然后利用试剂对活泼氨基进行保护,再利用.甲氧 基苯甲醛二甲缩醛对缩合氨基与羟基形成嚼唑烷,最后进行水解后得到最终的多西紫杉 醇侧链前体,.叔丁氧羰基..’.甲氧基苯基..苯基.,.氧氮杂戊环. 甲酸,纯度为%,收率为.%。 其次,利用三氯乙氧基乙酰氯对. 的位和位羟基进行保护,然后在 缩合剂与催化剂的存在下与侧链进行酯化反应。在经过和 两步脱保护反应后,得到最终目标物多西紫杉醇,纯度为%,步反 应总收率为 %。 摘要 关键词东北红豆杉;. ;多西紫杉醇;半合成 , .,? .. .圮 ? : . ; . , /, ,//,/ , //,彻. . .. 一.: ; %; :; ; . . .%... :; ;% , %; 晰% . %. . . ,, . 、】, .圮 ?.?. 、】,.%. .’ %. , 嬲 仃 :肋., 哪.?麟 %.%. .’ 岫 哆 ,【 ;砷:? 懈;. ??独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得丕匕挞些太堂或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:棚 签字日期:?炉年月牛目 学位论文版权使用授权书 有关保留、使用学位论文的规 本学位论文作者完全了解 壅星挞些太堂 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和借阅。本人授权壅盐些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师签名:协矽 学位论文作者签名:棚 签字日期:一年月竹日 签字日期:玩叼年侈月,日 , 学位论文作者毕业后去向: 诹博 电话:秘卅 工作单位: 青水疡啪 邮编:?卵 通讯地址:瞻嘶和卷蜘以绪论 绪论 癌症已经成为当今社会仅次于心血管疾病、危及人类生命健康的第二大疾病,目前 世界癌症患者总数已逾多万,我国国内每年新发生癌症患者万人。并有万 人死于癌症。发达国家美、欧、日等国每年新增的癌症患者达万人左右,全世界癌 症死亡人数每年达万人【”。消灭癌症已经成为无数代人心中的梦想,也成为无数科 研人员毕生奋斗的目标。各种各样的抗癌药物也相继被发现,并应用于临床。紫杉醇、 喜树碱、长春碱被称为世纪最伟大的三种抗癌药,为治疗癌症做出了巨大的贡献, 紫杉醇更加地被称为抗癌药之首。 .紫杉烷类化合物的研究概况 紫杉烷类是从紫杉属植物中得到的一类具有三环十五碳烯骨架的二萜类化 合物图“,多数具有高度含氧取代基。最初开始对紫杉次生代谢产物的研究可以 追溯到世纪中叶,年德国药剂师卢卡斯获得了紫杉类的混合物,卢卡斯称这些 特殊结构的化合物为紫杉碱】。然而,由于紫杉碱结构的复杂性以及现代光谱技术的缺 乏使得当时的研究步伐非常缓慢。 图紫杉烷类化合物母核结构 . 迄今为止,共从国内外多种红豆杉植物,如:东北红豆杉. .;云南红豆杉 足;西藏红豆杉 .;欧洲红豆杉 .;加拿大红豆杉 ;短叶红豆杉 ;佛罗里达红豆杉 .;直立杂种红豆杉 ; ; 工砒肋阳几个变种,如美丽红豆杉南方 . . 红豆杉 足: 和 . 堙等的树皮、叶、树 ; 枝、树根、种子、心材等中分离多个紫杉烷类二萜化合物,并对 这些化合物的东北林业大学硕士学位论文 骨架进行了研究【】。由和的不同结构将此类化合物分为四个类 型:具 环外双键或具基者;具环氧乙烷者;具环氧 丙烷者以及其它类型如重排型。 紫杉醇,商品名和多西紫杉醇,商品名是 紫杉烷类化合物家族中的两个重要成员。这两种药物对卵巢癌、 非小细胞癌、乳腺癌等 都具有很好的疗效,是目前临床化疗药物中的一线用药。而.脱乙酰基巴卡亭. 贝是合成的前体中,一个非常重要的紫杉烷类化合物。‰。把化。尹。人人。 图紫杉醇、多西紫杉醇和. 的结构式 .紫杉醇的研究概况。 ..紫杉醇的发现、抗癌活性及其抗癌机理 和博士发现,太 年,美国北卡罗来纳州三角研究所的 平洋紫杉短叶红豆杉 树皮的提取物在细胞株的试验中显示很强 的细胞毒活性,发现其对离体培养的肿瘤细胞,包括和白血病、肉 瘤及黑色素瘤细胞都具有很强的抑制作用【。。年,他们分离到足够量的活性 物质??紫杉醇。由于紫杉醇能用醇解法分解为可结晶的两部分,通过对该两 个化合物即对溴苯甲酸衍生物和双碘乙酸酯衍生物的射线结晶衍射分析,紫杉醇的结 构得到最后确定。紫杉醇结构研究的结果于年首次发表,其结构如图所示 【, ?】。年开始临床前实验,在美国、法国进行的临床试验证明,以红豆杉植株为主 要原料提取的紫杉醇具广谱的抗肿瘤活性,可用于晚期乳腺癌、晚期卵巢癌、鼻咽癌、 膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤和头颈部肿瘤、上胃肠道癌、小细胞性和非 小细胞性肺癌的治疗,被称为“晚期癌症的最后一道防线”,被认为是近十年来发现的 ~种最有希望的抗癌药物。此外,紫杉醇还被发现有许多的新用途,可用于结直肠癌、 膀胱癌和乳腺癌、肺癌、头颈部癌、软组织癌、白血病和胃肠道癌等一系列治 疗棘手的肿瘤,且其副作用相应小于其他抗肿瘤药物化疗药。年完成了制剂研绪论 究,年开始了临床。年紫杉醇获得了美国食品药品监督管理局的新药 批准,并于该年月日,美国批准紫杉酵上市,商品名为。在上市的 短短几年内,紫杉酵制剂的全球销售额突破了亿美元大关,刨下了单一抗癌药销量 之最。现在已在欧洲、美洲、南非等多个国家上市】。由于它独特的抗癌机 理和广谱高效的抗癌活性,成为继阿霉素和顺铂后最热点的抗癌药物。预测在今后 ?年内,紫杉醇将成为主要的抗癌药物之一【切。 紫杉醇的抗癌机理是其能与微管蛋白结合,促进其聚合形成稳定的微管,并抑制微 管的解聚,最终导致形成维管束的功能丧失.从而抑制了细胞的有丝分裂,促进癌细胞 的死亡。最近研究发现紫杉醇除了具有抑制肿瘤细胞有丝分裂的功能外,还具有强大的 促进肿瘤细胞凋亡的能力,原因是影响了参与细胞凋亡的酶并激活了与细胞凋亡有关的 蛋白质】。 ..紫杉醇的化学结构、性质及构效关系 紫杉醇的结构十分复杂,它是由母核巴卡亭和苯基异丝氨酸侧链两部分组成图 .。母核部分由、、、四个环构成,其中、环为六元环,环为八元环. 为含氧的四元环。苯基异丝氨酸侧链与环的位羟基相连,环位连接苯甲酰基。 紫杉醇分子中共有个手性碳,其中九个手性碳位于母核部分,另外两个位于侧链部 分。 图紫杉醇的结构式 紫杉醇的系统命名为:,环氧.,,,,,.六羟基紫杉烷.烯. .酮.,.二乙酸酯.苯甲酸酯一【’,’.苯甲酸.’.苯基异丝氨酸酯】。分子式为 相对分子质量.,元素百分比%:.,:.,:., :.。为白色晶体或无定性粉末,..:.?,..,。 紫杉醇是一个非极性白色固状物,难溶于水,易溶于有机溶剂【。 虽然紫杉烷类化合物种类繁多,而且都具备紫杉烷的基本骨架,但只有极少部分物 质显示出细胞毒性。研究表明,除了紫杉烷基本骨架外,一些必须的官能团也是拥有细 胞毒性所不可缺少的。根据文献报道:紫杉醇的母核结构、侧链和位的苯甲酰基 是紫杉醇具有活性所必须的基团,侧链的’乃’的立体构型、’位羟基、’位的酰胺 取代也都是保持活性所必须的,而,,位的氧取代基的有无对紫杉醇的活性并东北林业大学硕七学位论文 无太大的影响,位羟基对紫杉醇活性的影响至今并无定论【。 图紫杉酵的结构 ..紫杉醇的植物资源 红豆杉是第四纪冰川后遗留下来的物种,被称为植物王国的“活化石”,是世界珍稀 濒危植物,我国将其列为一级保护檀物。红豆杉果实成熟时红果满枝,艳丽多姿,因酷似南 方的“相思豆”而得名。它不仅是重要的用材树种、观赏树种,更是珍贵的药用植物。实 验证明:红豆杉植物中含有的紫杉醇具有独特的抗肿瘤机制和显著的抑制肿瘤作用,被认 为当今最有开发前途的抗癌药物【”】。 含有紫杉醇的红豆杉科植物,全世界目前已知共有种一变种,除澳洲的彳觚泐 一种产于南半球之外,其它均产于北半球。我国红豆杉有种变种,即东北红 埘 弧 豆杉 ,云南红豆杉 ,南方红豆杉【足】,西藏红豆杉 ,中国红豆杉【 】,分布于我国西南、东北、东南及台湾等地【”。 紫杉醇和其它紫杉烷类化合物主要存在于红豆杉科植物,最近发现亦分布于红豆杉 近缘科属植物中。近来报道,红豆杉科的榧树.茎叶及自豆杉僻 叶和茎皮中都存在紫杉醇及其类似化合物,后者紫杉醇含量高于前者,自豆杉可 能成为新的资源代用品。 此外,美国俄勒岗大学化学系的研究人员报道,野生的山榛子树也有望成为提取紫 杉醇原料药的新植物资源。而且美国研究人员已在这种漫山遍野生长的野生植物的树叶绪论 和树皮中成功提取紫杉醇。早在几十年前,植物学家即已发现, 野生山榛予 树从不被植物病虫害侵犯。他们推测,山榛子的枝叶和树皮中肯定含某种或某些抗病 虫害的特殊化学成分。年,美国科学家在山榛子枝、叶的醇提物中分离出“紫杉 烷”与“紫杉醇”等活性成分,从而证实了原先的推测是准确的。 图紫杉醇的构效关系 ..紫杉醇的来源 红豆杉属植物全世界仅有种,生长缓慢,种群密度小,自身繁殖度低。紫杉醇 多从树皮中提取,但含量极低,只有...%。据估计,仅用于其它药物治疗无效的 癌症,每年即需紫杉醇 。如果考虑到药物配伍应用等其他方面,年需求量可能超过 ,约合万株树木/年。以目前的提取分离方法,这样大的供应量无疑会威胁到红 豆杉属植物的长期存留和地区分布,因此,寻找它的新来源显得非常重要。美国农业部 于年就批准了和等用细胞培养法生产紫杉醇及其类似物的专利,但 这方面的研究仍方兴未艾,研究机构和研究人员有增无减。 据文献报道,目前紫杉醇主要有以下几种来源:植物提取:目前所 用的紫杉醇 几乎%都来自于植物提取,虽然目前报道通过很多方法都可以获得紫杉醇,但都只处 在理论研究阶段,面临着成本高、技术不成熟等各种各样的问题,无法大规模地生产紫东北林业大学硕士学位论文 杉醇【】。细胞培养法:细胞培养生产紫杉醇虽然也是一种较理想的方法,但是其最 高产率仅为 /。而且还面临着一系列的难题:?紫杉醇低水平表达;?由于植物 细胞易于变异,长时间培养后,紫杉醇含量降低;?细胞对放大培养中的剪切耐受力低; ?产量不稳定。只有这些问题解决之后,才能实现工业化生产。另一方面,细胞培养产 出的细胞材料尚需下游工艺分离纯化,其工艺过程与植物提取紫杉醇方法完全相同。这 样,两项成本的叠加,将使终产品紫杉醇在价格上失去市场竞争能力【孙。半合成法 , :年,法国等首次报道了以.去乙酰巴卡亭 . 为原料半合成紫杉醇。其后,美国教授和法国的教授等也以 巴卡亭为原料半合成了紫杉醇。.去乙酰巴卡亭是从欧洲红豆杉 的枝叶中分离出 来的,其含量可达.%,由于枝叶再生能力强,因此紫杉醇半合成可有较丰富的原料。 年在主持召开的第二次红豆杉与紫杉醇研讨会上,等报道了紫杉醇的 半合成路线,即利用紫杉醇侧链.苯甲酰.,..苯基异丝氨酸经酯化后与巴卡亭 相连接的方法。 此外,还有报道利用生物合成、植物细胞、真菌等方法来生产紫杉醇,但都由于种 种原因,无法从根本意义上提供紫杉醇【”。 ..紫杉醇的全合成 合成紫杉醇这一复杂的天然分子是有机合成化学家所面临的严峻挑战。紫杉醇合成 工作主要集中在多功能化的紫杉烷三环、环及侧链的建造上尤其是高度官能化 的中央八元环的建立。虽投影在环上、甲基彼此间不太接近,但预先构建 环的多数反应在环闭环反应中却使其太靠近,加上环的刚性和立体障碍以及 环和位立体中心的不稳定,致使环进一步立体选择性官能化的可能性非常有限。 直到最近,大多数紫杉烷骨架合成中都缺少个甲基。如甲基确实存在,则以后很难引 入必需的功能基?,。 全世界共有多个第一流的研究小组从事于紫杉醇的全合成工作。他们的合成主要 分为两种合成战略:线性战略,即由环到环和由环到环。会聚战 略,即由环和环会聚合成环。 年初,和几乎同时宣告紫杉醇的全合成获得成功牡州。他们 的成功标志着有机合成化学登上了一个新的台阶?】。迄今为止,已有条不同的路线全 合成了紫杉醇。 对这两条合成路线进行比较,我们可以发现,虽然的合成路线非常简明, 但是其总产率.%却远远低于:的合成路线.%。对于的合成路线来 讲,至少在缩合这一步反应可望得到进一步的改进。这两条合成路线都可能用 于紫杉醇衍生物的制备。但是要达到实用的程度,还需要进一步地改进合成路线,以提 高产率和立体选择性。 尽管和研究组所相继完成的紫杉醇全合成工作十分出色,但由于绪论 紫杉醇的合成路线太长而不具有商业价值跚。 一昧一~.坟 ~?国卜一~?印 巴一”吼一一’馘 一一蹿一~”秘 壁苎黜??日 蜘豁萼 图 全合成路线东北林业大学硕士学位论文 ’幛‰ 髂? 一 洲 图 全合成路线 . . 的研究概况 . 的全称为.去乙酰基巴卡亭,又称为.去乙酰基浆果赤霉素., .脱乙酰浆果杉亭。是紫杉烷家族中一个极为重要的成员,可用于 紫杉醇和多西 紫杉醇的合成?。 自年等从太平洋红豆杉树皮中分离鉴定出抗癌新药紫杉醇之后, 红豆杉 资源的开发受到了极大的关注,同时也造成了大量天然红豆杉资 源的不当利用甚至毁 坏。虽然植物细胞大规模培养等现代生物技术方法是解决紫杉醇供应并能最终摆脱天然 资源限制的最有前途的方法,但目前紫杉醇的来源除了从红豆杉植物中直接提取紫杉醇 和巴卡亭,然后再通 外,还主要依靠红豆杉的可再生的枝叶,从中提取 过半合成制备紫杉醇和多西紫杉醇【。由于. 在红豆杉属植物中的含量要比 紫杉醇丰富的多,分离提取的牧率也比紫杉醇的高,树时又是可再生资源,这些都使得 半合成方法越来越受到重视。 .. . 的发现和应用 . ,是紫杉醇生物合成、人工半合成以及多西紫杉醇人工半合成的一个重 要的前体,于年在欧洲红豆杉针叶中分离得到?】,含量也很高。年,在太平 .?绪论 洋紫杉的树皮中也找到了. 。 与紫杉醇和多西紫杉醇相比,几乎没有细胞毒性,然而.?却是 紫杉烷类化合物中最重要的合成前体。预计今后扛年,以. 为前体的半 合成将逐步代替短叶红豆杉树皮作为紫杉醇的主要资源【】。 . .. 的化学结构及性质 一 也是一个二萜类紫杉烷衍生物,化学结构式与紫杉醇的母核非常相近, 与紫杉醇相比,缺失了苯基异丝氨酸侧链,另外位由羟基取代了乙酰基。分子式为 ,相对分子质量.,元素百分比%:.,:.,:.。 . 为极性白色固状物,易溶于水、甲酵、乙醇等极性溶剂。 图 去乙酰基巴卡孕结构式 .. 的植物资源 . 广泛分布于红豆杉属植物的树皮、枝条、叶子、根、种子和心材等中, 其中在枝叶中. 的含量较高。. 除了存在于红豆杉科植物中外,也有 文献报道在松科植物马尾松 和三尖杉科中国粗榧 的存在【】. 中也发现了 .. ?的提取纯化 对于. 的提取有很多文献都有报道,其中所用的溶剂、方法大同小异。作 为提取用的溶剂主要有几个体系:甲醇.二氯甲烷】、甲醇例、%乙醇【卸等。 对 的提取检测的文献较多,但却很少有对其纯化的报道。其中的纯化方 法主要有:利用硅胶柱层析对粗榧和马尾松叶%乙醇提取物中的. 进行纯 化,柱层析馏分经甲醇重结晶后可得到%的. 。:利用高效逆流色谱法,以 正己烷.乙酸乙酯.乙醇.水:::/为两相溶剂体系对中国红豆杉针叶提取物 进行粗分离,后以正己烷.氯仿.甲醇.水:::,/为溶剂体系对粗分部分进行纯 化,经检测, 的含量可达%:将紫杉植物的树叶、树皮或树枝的 醇提取物用乙酸乙酯溶解后,用碳酸氢钠溶液发萃取除去杂质,萃取后有机相除去溶剂 哪。 后,用乙腈溶解冷冻析晶得到%的. 文献报道中. 的提取纯化的整体流程大致如下;东北林业大学硕 士学位论文 机械粉碎溜剂提取 过滤碱压浓缩 红豆杉树皮、枝叶????????????????啼 滤液?????, 硅胶柱层析 溜剂萃取 重结晶 纯化广???... 高效逆;色借 ???有机相浓缩???, ????? 亘司 图 提取纯化沉程 .多西紫杉醇的研究概况 多西紫杉醇又称为泰索帝、艾索、紫杉特尔、多帕菲等是法国罗 纳普朗克乐安 公司..和法国国家自然科学研究中心于年以. 作为母核骨架,通过半合成的方法合成出来的【”。已广泛上市的 一种紫杉烷类 经人 抗癌药物,是由浆果紫杉 , 针叶中提取物 工半合成所得的产物。由于多西紫杉醇以.丁氧羰基取代了紫杉醇中的苯甲酸基团,因 而水溶性略大于紫杉醇。其抗癌作用机制是促进微管蛋白聚合及抑制微管解聚,“冻 结”微管的组成部分??细胞内骨架的合成,导致形成稳定的非功能性微管束,因而破 坏肿瘤细胞的有丝分裂,从而达到抑制癌症的效果”。 多西紫杉醇被认为是迄今疗效最显著的抗癌药物之一。世纪年代末期陆续在 乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌等方面通过临床测试,年经确认开始用于临 床,具有广谱的抗白血病和抗实体肿瘤活性,现在临床用于晚期的卵巢癌、乳腺癌以及 非小细胞性肺癌。试验表明它们对肺癌、皮肤癌以及头颈部恶性肿瘤也具有极强的抗癌 活性,市场需求日益增大。而且,在临床研究中发现,多西紫杉醇抑制微管解聚、促进微 管二聚体聚合成微管的能力是紫杉醇的倍。在相同的键合位点上,多西紫杉醇与紫杉 醇似乎存在着竞争,但是多西紫杉醇的亲和性为紫杉醇的倍。在体外抗癌活性试验 中,已证实多西紫杉醇活性可达紫杉醇的倍。 由于紫杉醇类化合物结构复杂、多官能团和手性中心等,全合成难度极大,很难达 到降低成本的目的。自从发现欧洲红豆杉 的针叶中提取到含量较高的 以来,紫杉醇和多西紫杉醇的行之有效半合成研究开始’。已报道的紫杉醇 类化合物的半合成方法有多种,如利用刚性环的立体选择性和手性诱导基团的立体选择 性将.内酰胺环直接引入到. 中;又如由顺式的肉桂醇出发,经不 对称环氧化等特定反应完成其合成目的,但都存在各种各样的缺点,如条件苛刻、产率 低、副产物多等,很难适应工业化生产的需求。因此探索多西紫杉醇工业化生产的方法 和通过结构修饰得到活性更好的新一代抗肿瘤药物成为研究的热点。..多西紫杉醇的发现与抗癌活性 是通过半合成的方法得到的一种紫杉醇类似物,其抗癌活性 及水溶性均优于紫杉醇”。多西紫杉醇具有广谱的抗自血病和抗实体肿瘩活性,现在临 床用于晚期的卵巢癌、乳腺癌以及非小细胞性肺癌。试验表明它们对肺癌、皮肤癌以及 头颈部恶性肿瘤也具有极强的抗癌活性。 ..多西紫杉醇的化学结构与性质 多西紫杉醇化学结构与紫杉醇相似,和紫杉醇的区别为:母核位置为羟基,侧 链,位的苯甲酰基被一叔丁氧羰基取代。多西紫杉醇的分子式为,相对分 子量为.,为白色或近似白色粉状物。..,【】.。.,。 图.多西紫杉醇结构式 系统命名为:,?环氧,旺,,,,一六羟基紫杉烷.烯.酮 乙酸酯..苯甲酸酯..【’’.叔丁氧羰基.’.苯基异丝氨酸酯】【。 图.多西紫杉醇的结构 ..紫杉醇和多西紫杉醇的半合成 紫衫醇的化学研究已成为世界各国科学家关注的中心课题。其中教授领导的 研究组最杰出的成果是以易得的有充足可靠来源的半合成前体紫杉烷类化合物巴卡亭?东北林业大学硕士学位论文 和. 为原料合成紫杉醇及其类似物多西紫杉醇图呱‘那。紫杉醇和多西紫杉醇的 母核的保护,侧链与母核 半合成主要包括三个部分:侧链的合成,? 链接。 黝? 甜. 保护巴卡亭 紫杉醇 紫杉醇侧链 删,, 。天..少 /\/\十 ‘’ 、?????、,???一 保护. 多西紫杉醇 多西紫杉醇侧链 图.紫杉醇与多西紫杉醇合成中母核与侧链的对接 ...侧链的合成研究概况 紫杉醇和多西紫杉醇分子中连接在位的苯基异丝氨酸侧链,对紫杉醇和多西紫 杉醇的抗肿瘤活性至关重要,去掉该侧链时,活性基本丧失;侧链的’/’的立体构 型、’位羟基、’位的酰胺取代也都是保持活性所必须的。在半合成紫杉醇和多西紫杉 醇的过程中,该侧链通过化学合成法得到。对紫杉醇和多西紫杉醇侧链部分的处理有两 种方式:一种是先合成出光学活性的侧链再与母核对接:另一种是合成出侧链前体物, 再与母核连接后或是在连接的过程中产生所需的立体构型。 光学活性侧链的合成方法主要有以下几种: 丛 詈 入:/洲 ??入:/业冬 三 兰 绪论 / 吖‖?/、。 『, 一 ,一 ? / . 三 ?业型竖一。 图.光学活性侧链合成的几种方法 但是。制备光学活性紫杉醇侧链的过程比较复杂,一般需要用到 手性试剂,导致最 终合成成本过高。此外,反应的收率也较为有限,难以实现大规模生产。另外,光学活 性的直线型侧链前体与保护后的母核进行酯化反应,合成紫杉酵或多西紫杉醇时,存在 一些不利因素,例如反应条件苛刻、转化率低、形成大量差向异构物、保护的羧酸 侧链不稳定等。因此,人们开发了环状侧链前提物用于紫杉醇或多西紫杉醇的合成。文 献报道的环状侧链前体主要有.内酰胺型、嚼唑烷型和嗯嗪酮型三种。 % ,“ ,? \ 芦 \ 厂\ 厂、 弋/ 一×。 .’ 尺” 。 .内酰胺型 嚼唑烷型 嚼嗪酮 图.环状侧链前体类型 文献中报道的具体的侧链有删: 趣东北林业大学硕士学位论文 图几种侧链与侧链前体 在报道的多种侧链和前提物中,环状侧链前提物嗯唑烷是十分重要的一类。它可以 由多种方法制备出来,合成过程比较简单。很多紫杉醇和多西紫杉醇的合成文献中都选 用嚼唑烷作为侧链前体【纠。而且在与保护的巴卡亭和. 进行酯化 时,立体选择性和收率也是比较高的。这样合成紫杉醇和多西紫杉醇时就避免了使用手 性试剂,大大简化了合成过程,降低了成本,使合成过程更具产业化可能。 ... .母核保护研究概况 半合成紫杉醇的原料巴卡亭在、、位有三个游离羟基,而. 在 位还有一个游离羟基。游离羟基的反应活性顺序为..。. 由于空间位阻的影响,反应活性很低,而其他三个羟基的活性接近,如何选择性地 保护,.,而保留.以便与侧链进行反应,是合成紫杉醇与多西紫杉醇 的关键步骤。文献报道的母核保护试剂主要有三种:三乙基氯硅 烷、, ,.三氯乙氧羰基氯【】和氯甲酸苄酯。 \厂 、?一 。入。八。 三乙基氯硅烷 ,,三氯乙氧羰基氯 氯甲酸苄酯 图?母核保护试剂 ...侧链与母核酯化及脱保护基的研究概况 半合成紫杉醇和多西紫杉醇的过程中,侧链或侧链前体与选择性保护的母核进行酯 化反应,也是半合成的关键步骤。在酯化反应过程中需要用到缩合剂和催化剂,文献报 道的缩合剂和催化剂主要有以下几种:,,,。如果是用 .内酰胺型侧链前体与母核进行酯化,则可以用正丁基锂作为碱来活化一 ‘ ?蛔。 侧链与母核对接之后需要将母核或侧链上的保护基团除去,这个过程一般在较温和 的还原条件下就可以除去,所用的条件有:体系,?体系 ,.毗啶体系【,体系,.体系【。绪论 .超声波提取技术 超声波提取技术是近年来应用到中草药有效成份提取分离的一种最新的较为成熟的 手段。其原理主要是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取。另 外,还利用其次效应,如机械振动,扩散,击碎等,使其加速被提取成份的扩散和释 放。 ..超声波的工作原理 超声波萃取中药材的优越性,是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电 换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固一 液萃取分离。 加速介质质点运动。高于 声波频率的超声波的连续介质例如水中 传播时,根据惠更斯波动原理,在其传播的波阵面上将引起介质质点包括药材重要效 成分的质点的运动,使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。质点的加速度经计算 一般可达重力加速度的二千倍以上。由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分 质点上而使之获得巨大的加速度和动能,迅速逸出药材基体而游 离于水中。 空化作用。超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”,“空化效应”不 断产生无数内部压力达到上于个大气压的微气穴并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波 作用在中药材上,使其中药材成分物质被“轰击”逸出,并使得药材基体被不断剥蚀,其 中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来。加速植物有效成份的浸出提取。 超声波的振动匀化使样品介质内各点受到的作用一致,使整个 样品萃取更均匀。 综上所述,中药材中的药效物质在超声波场作用下不但作为介质质点获得自身的巨 大加速度和动能,而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击,所以能高效率并充分分离 出来。 ..超声提取的特点 超声提取适用于中药材有效成份的萃取,是中药制药彻底改变传统的水煮醇沉萃取 方法的新方法、新工艺。与传统的水煮、醇沉工艺相比,超声波萃取技术具有如下突出 特点: 无需高温。在?一?水温超声波强化萃取,无水煮高温,不破坏中药材中 某些具有热不稳定,易水解或氧化特性的药效成份。超声波能促使植物细胞地破壁,提 高中药的疗效。 常压萃取,安全性好,操作简单易行,维护保养方便。 萃取效率高。超声波强化萃取~分钟即可获最佳提取率,萃取时间仅为水 煮、醇沉法的三分之一或更少。萃取充分,萃取量是传统方法的二倍以上。据统计,超 声波在~作效率非常高。而温度在度内中草药植物的有效成份基本没有 受到破坏。加入超声波后在度条件下,植物有效成份提取时间约分钟。而蒸东北林业大学硕士学位论文 煮法的蒸煮时间往往需要两到三小时,是超声波提取时间的倍以上时间。每罐提取 次,基本上可提取有效成份的%以上。 具有广谱性。适用性广,绝大多数的中药材各类成份均可超声萃取。 超声波萃取对溶剂和目标萃取物的性质如极性关系不大。因此,可供选择的 萃取溶剂种类多、目标萃取物范围广泛。 减少能耗。由于超声萃取无需加热或加热温度低,萃取时间短,因此大大降低能 耗。 药材原料处理量大,成倍或数倍提高,且杂质少,有效成分易于分离、净化。. 萃取工艺成本低,综合经济效益显著。 .柱层析技术 柱层析也称为柱色谱技术,是将待分离混合物均匀地加在装有固定相常用硅 胶或氧化铝的柱子中,再加适当的溶剂称洗脱剂冲洗,由于固定相和洗脱剂对各组 分的亲和力不同,因此试样中各组分在两相中的分配也不同,在柱中随洗脱剂移动的速 度就不同,对固定相亲和力最弱的组分首先随洗脱剂流出,对固定相亲和力较强的组分 后流出,通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。 柱层析技术原理与薄层层析原理相同。薄层层析是将作为固定相的支持剂吸附剂 或其他涂于支持板上一般是玻璃板,上样后,用展开溶剂推动而进行物质分离的一种 层析技术。硅胶薄层层析的支持剂是硅胶,主要的分离依据是吸附力和分配力的平衡关 系。而硅胶柱柱层析可以被看作是硅胶薄板朝内面卷曲后,中间用硅胶填实的一种状 态,具体分离原理与薄层层析相同,优点是可以进行大批量的分离薄层层析只能用于定 性检测等。 .研究目的和意义 以红豆杉属植物的枝叶为原材料,对其中的紫杉烷类化合物进行提取和利用。将提 取紫杉醇等弱极性物质后的母液,进行开发利用,从中提取分离紫杉醇和多西紫杉醇的 通过一系列方法进行纯化,使其纯度达 合成前体. ,并对低含量的 到半合成紫杉醇和多西紫杉醇的要求。 此外进行多西紫杉醇的合成。先合成多西紫杉酵的侧链,然后将侧链与纯化后的 进行连接,最终得到目标产物多西紫杉醇。 众所周知,紫杉醇和多西紫杉醇对多种癌症乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等 都具有很好的疗效,是目前临床化疗一线用药。自紫杉醇和多西紫杉醇投放市场以来, 所产生的社会和经济效益令人惊奇和兴奋,全球市场需求快速增长。然而,由于紫杉醇 药原植物红豆杉生长缓慢且资源有限,加上植物体内紫杉醇含量极低,造成紫杉醇供应严 重紧缺,限制了临床广泛的研究应用。另外,由于紫杉醇和多西紫杉醇化学结构复杂、 多官能团和手性中心等,全合成难度极大,很难达到降低成本的目的。因此,目前的首绪论 是紫杉醇和多西紫杉醇的合 要问题是如何解决紫杉醇和多西紫杉醇的来源。一 成前体,存在于各种红豆杉属植物以及红豆杉属的近缘植物中,而且含量丰富。以 为母核进行紫杉醇和多西紫杉醇的半合成是目前解决这一问题的可行途径。本 文正是以此为目标,着手于产业化,从降低成本出发进行研究,为解决紫杉醇和多西紫 杉醇的来源问题提供可行性依据。东北林业大学硕士学位论文 . 定量分析方法的确立 高效液相色谱作为天然产物成份分析的检测方法,不仅具有速度快、灵 敏度高、准确性好、自动化程度高、对样品适用范围广等特点,还必将在提高检测质量 和速度上有更大的发展前景,现已成为当代分析化学中最主要的 检测方法,美国、日 本、英国药典中药物的含量、溶出度等项中用方法占大部分,我国药典中用 方法也逐版增加。 目前关于红豆杉中. 的定量检测分析几乎全部都采用来实现, 主要的流动相体系有甲醇.乙腈.水体系【】、甲醇.乙酸.水体系【】、乙腈.水体系 、乙睛.冰醋酸.水体系。 本论文在综合文献基础上采用法测定东北红豆杉中. 的含量,以乙 腈.水体系作为为流动相,分离度和准确度均较高。 .实验部分 ..实验仪器与试剂 无水乙醇 分析纯 哈尔滨化工试剂厂 无水甲醇 分析纯 沈阳东兴试剂厂 乙腈 色谱纯 百灵威公司 甲醇 色谱纯 百灵威公司 双重蒸馏水 色谱纯 自制 乙酸 分析纯 天津市光复科技发展有限公司 四氢呋哺 分析纯 北京化工厂 石油醚 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 分析纯 天津光复精细化工研究所 乙酸乙酯 三氯甲烷 分析纯 北京化工厂 微孔滤膜 孔径. 上海市新亚净化器厂 ?% 上海金和生物技术有限公司 东北红豆杉枝叶 生药 东北林业大学种植园 型高速离心机 德国 公司 高效液相色谱仪 日本公司 高效液相色谱泵 美国公司 型二极管阵列检测器 昆山市超声仪器有限公司 .型数控超声机 旋转蒸发仪 上海青浦沪西仪器厂 瑞士 型电子天平 型烘干箱 重庆四达实验仪器厂 .三用紫外分析仪 上海精科实业有限公司 . .广州菲罗门科学仪器有限公司 .. 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液的制备 精密称取 对照品. 容量瓶中,用色谱乙腈定容, ,加入到 配制成. /的溶液,作为对照品母液溶液。然后逐级稀释配制.,.,., .. 一 定量分析方法的确立 .,.,.,. /的系列标准溶液,进行检测。 ..样品溶液的制备 称取东北红豆杉鲜枝叶粉末 %乙醇溶液,超声提取 后, ,加入 过滤,残渣中再加入 %乙醇,平行反复次,将次滤液合并后浓缩, 脱脂 后,用孔径.岫微孔滤膜过滤,进行分析。 .结果与讨论 ..检测波长的选取 选取最佳的检测波长可以保证. 达到最大的紫外吸收和最小干 扰,提高检 【】, 测的灵敏性和准确度。根据文献报道, 的检澳波长为. 衄,在实验过程中,利用高效液相色谱仪结合型二极管阵列检测器, 进行 对. 的全波长扫描,扫描结果如图?,从图中可以看出在 . 有最大紫外吸收,因此,在实验中我们以. 作为的检测波长。 图 紫外扫描图 ..流动相的选择 为优化最佳的分离条件,进行了一系列不同溶剂体系的选取。用到的溶剂体 系有:甲醇.水、乙腈.水、甲醇.乙腈.水。此外还考虑了加入乙酸或四氢呋喃的不同 对分离效果和峰形的影响。结果显示,溶剂体系中增加乙腈或甲醇的比例能显著 缩短样品保留时间。此外,向溶剂体系中加入乙酸或四氢呋喃对样品的色谱行为并无显 著的影响。综合考虑样品保留时间和分离效果,选取乙腈.水/体系。但是由予 提取样品中含有很多弱极性物质,在上述比例的流动相下难以流出色谱柱,造成样品在 色谱柱中残留积累,影响目标物的检测,因此,在. 出峰后,进行梯度洗脱 、流 乙腈.水/,将弱极性物质快速冲出色谱柱。结果表明,在检测波长. 可在 速. /,进样量为 的条件下,. 内出峰,而且达到了 基线分离。 对照品和样品色谱图见图.。 内 时 从图中可以看出在 达到了很好的基线分离,在. 显示出对称、尖锐的色谱峰。由于. 没有紫杉烷类化合物的侧链部分,东北林业大学硕士学位论文 而且母核位乙酰基的缺失,使得 在很短的时间就可以流出色谱柱。 图 埘对照品和样品色谱图 ..标准曲线的绘制 在上述检测条件下,每个样重复测定次,以对照品溶液浓度为横坐标, 色谱峰面积平均值为纵坐标进行线性回归,得到 的标准曲线图? . .,检测限和定量检 与回归方程:. /和. /。 测限分别为. 。 定量分析方法的确立 蓄 尊 器 . . . . . 一浓度/ . 图. 对照品标准曲线 ..方法精密度 在上述检测条件下,将同一样品溶液重复测定次,分析每次测定 的. 的保留时间和峰面积的相对标准偏差...。结果表明,在此检测条 件下 保留时间和峰面积的...分别为.和.,均小于%. .方法稳定性 在上述检测条件下,将同一样品溶液每隔 测定一次,测定两天, 分析结 果表明样品在 内稳定....%。 ..方法加样回收率 将,和 的对照品溶液与 粗提样品液混合,减压浓缩至干, . 用 色谱乙腈溶解,按上述色谱条件及测定方法进行检测。 按下列公式计算回收率,结果见下表: % 一脚最,,助日样回收率:。,..一 朋 总量 :测得的. :样品中. 的量 以加入.?的量 表 加样回收率 结果表明:在上述检测方法下,. 的回收率为.%.%。平均 为.%,说明本文中所用的测定方法具有良好的回收率。东北林业 大学硕士学位论文 .本章小结 确定了反相高效液相色谱法检测东北红豆杉中一 的色谱条件。 色谱柱. . ,检测波长. ,流速 /进样量 皿,,流动相为 乙腈水/, 乙腈一水/体系。 . 标准曲线的相关系数为.,精密度和稳定性实验的..均小于 %。 本章建立的分析方法精密度高、重现性好、准确度高、可靠性强, 适用于东北红豆 的开发提供了 杉及其他制剂中. 的质量分析检验,为天然植物中. 快速、简便、准确的测定方法。 提取工艺条件的确立 . 提取工艺条件的确立 从植物中提取天然活性成分的方法有溶剂法。水蒸汽蒸馏法以及升华法。后两种方 法的应用范围十分有限,大多数情况下采用溶剂提取法。该法选用适当的溶剂通过回流 提取法或连续提取法将活性成分提取出来。一般首先将药材干燥并进行适当的粉碎,以 利增大药材与溶剂的接触面积,提高浸出率。为极性物质,易溶于水、乙醇、甲醇等极性溶剂。在实际的工业生产 中,不仅要充分利用原辅材料,最大限度地提高经济效益,同时必须考虑生产的安全性 以及对环境的影响。甲醇毒性大,不利于安全生产,乙醇比较来说,它对溶质的渗透性 好,对环境无污染,又具有较低的毒副作用、价廉、易于回收的优点,利于工业化生 产。为了最大限度、最有效地提取植物材料中的 ,对提取方法、提取溶剂和 提取时间、提取温度、固液比等因素进行了考察。 实验中常用的常规提取方法有浸渍法、热回流提取法、索氏提取法等,而超声提取 技术则是近年来应用到中草药有效成份提取分离的一种最新的较为成熟的手段。在中药 有效成分提取等方面已有了一定的应用。其原理主要是利用超声的空化作用对细胞膜的 破坏,有助于溶质扩散,对原料有水浴作用。超声波提取与传统的回流提取、索氏提取法 等比较,具有提取速度快、时间短、收率高、无需加热等优点,己被许多中药分析过程 选为供试样处理的手段。东北转业大学硕士学位论文 .实验部分 ..实验仪器与试剂 无水乙醇 分析纯 哈尔滨化工试剂厂 无水甲酵 分析纯 沈阳东兴试剂厂 乙腈 色谱纯 百灵威公司 甲醇 色谱纯 百灵威公司 双重蒸馏水 色谱纯 自制 石油醚 分析纯 天律市科密欧化学试剂开发中心 乙酸乙酯 分析纯 天津光复精细化上研究所 三氯甲烷 分析纯 北京化厂 微孔滤膜 孔径. 上海市新哑净化器厂 一% 上海金和生物技术有限公司 东北红豆杉枝叶 生药 东北林业大学种植园 型高速离心机 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中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多东北林业大学硕士学位论文 糖、油脂和腊等外,大多能在乙醇中溶解。而且还可以根据被提取物质的性质,采用不 同浓度的乙醇进行提取。而且乙醇毒性小,价格便宜,来源方便,易于回收。因此,在 本文选用不同浓度的乙醇来选取最佳提取溶剂。结果如下: . . 窖 静 簦. 掣 . . . /乙醇%乙醇%乙醇%乙醇 乙醇 甲醇 圈提取溶剂的选取 由上图可以看出,提取的最佳溶剂为%乙醇溶液,而浓度过低或过高的乙醇溶液 则无法将 提取完全。此外还对甲醇溶液进行了考察,我们发现,用甲醇作为 提取溶剂并没有显示出更大的优越性,而且考虑到甲醇还有很大的毒性,最终选取% 乙醇作为提取溶剂。 ..固液比的选取 结果如下: \静苷嗽兽。占 昕?;宝??毗毗 : : : : : : 固液比 图提取固液比的选取 如图所示,固液比对东北红豆杉中. 提取会产生很大的影响:当固液比低 于:时,有部分. 并没有进入到提取溶剂中,而是在原料与提取液之间形 成了动态平衡。当固液比为:时,对原料中. 的提取率达到了最大 值,而:竺呈竺堡坠三堇叁丝塑塑兰 当固液比继续增加时,提取率并没有继续增加,而是有下降并趋于稳定的趋势。说明提 取率与固液比之间存在着最佳的比例,只有当固液比为最佳比例时,才能使. 的提取率达到最大值。因此,在本文中的固液比选择:。 ..提取时间的选取 在药材细胞内外有效成分的浓度达到平衡以前,随着提取时间的延长,提取出的量 也随着增加。当细胞内外有效成分达到平衡时,提取液中的有效成分含量将不再增加。 所以,提取的时间没必要无限延长,只要合适,提取完全就行。在本文中,对提取时间 进行了考察。结果如下: . . 嚣 甚 害. . 舌 . 提取时间 图提取时间的选取 结果显示,在前述提取条件下,提取溶剂在 就可以最大限度地将. 从植物原料中浸提出来。 ..提取次数的选取 用提取溶剂提取目标产物时,提取次数越多。目标产物总提取量 也越多,这是提取 . 女. 静 蜃. “. 占. 次 次 次 次 提取次数东北林业大学硕士学位论文 图提取次数选取 所希望的,但同时提取溶剂消耗量也越多。不利于以后蒸发溶剂 进行浓缩的操作。因此 有必要确定合适的提取次数,以求用最少的溶剂量提取出最多的 目标产物。结果如上 图。 从图.我们可以看出,在前述的提取条件下进行提取时,提取次数 的不同,提取 出的. 也不同,提取到次,无法将 完全提出,当经过第次 提取后,原料中的. 基本已经提取完全。 .本章小结 的提取条件进行了优化,对影响提取率的各 本章对东北红豆杉枝叶中的. 个因素进行了考察,确定了最佳的提取工艺参数。 、通过对超声提取和常规提取方法的比较,超声提取法提取率最 高,此外,超声 提取所用时间短,大大地提高了提取工作的效率。 、超声提取法的最佳工艺参数为: 溶剂:%乙醇 固液比:: 提取时间: 提取次数:次 、在上述工艺条件下,. 的提取率为:.%。:::竺:::量丝丝窒篁墼 苎兰 . 分离纯化方法的确立 .实验部分 ..实验仪器与试剂 无水乙醇 分析纯 哈尔滨化工试剂厂 无水甲醇 分析纯 沈阳东兴试剂厂 乙腈 色谱纯 百灵威公司 甲醇 色谱纯 百灵威公司 双重蒸馏水 色谱纯 自制 石油醚 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 乙酸乙酯 分析纯 天津光复精细化工研究所 三氯甲烷 分析纯 北京化工厂 微孔滤膜 孔径. 上海市新亚净化器厂 一% 上海金和生物技术有限公司 东北红豆杉枝叶 生药 东北林业大学种植园 硅胶 目 青岛美高集团有限公司 硅胶 薄层层析 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂 型高速离心机 德国 公司 高效液相色谱仪 日本公司 高效液相色谱泵 美国公司 型二极管阵列检测器 昆山市超声仪器有限公司 .型数控超声机