体外培养绵羊卵母细胞超微结构的变化

体外培养绵羊卵母细胞超微结构的变化 年 3 月 2000 ( )内蒙古大学学报 自然科学版 2000 Mar . 第 3 1 卷 第 2 期 Acta Scientiarum Naturalium Universitatis NeiMongol Vol . 31 No . 2 () 文章编号 :1000 - 1638 20000220230205 3 Ξ 体外培养绵羊卵母细胞超微结构的变化 刘 吉吉,李荣凤 ,旭日干 () 内蒙古大学实验动物研究中心 ,内蒙古 呼和浩特 010021 摘要 :实验利用透射电镜研究了根据卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后各类绵羊卵母细胞在 () 体外成熟培养前后超微结构的变化 ,结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 :小卵泡 直径小于 1mm卵经过体外培养其线粒 体 、皮层颗粒等细胞器均未达到成熟卵母细胞中这两种超微结构的分布状态 ; 大 、中两类卵泡() 直径大于 3 mm 和 13 mm卵经过体外培养细胞质成熟较好 ,但其线粒体的分布与体内成熟卵 稍有差异 ,说明当前的培养系统并不能支持卵胞质充分成熟 . 从线粒体 、皮层颗粒 、微绒毛 、脂 ) () ) () 滴等超微结构来看 ,3裸卵、4卵丘细胞已扩散类卵母细胞为退化的卵母细胞 ,其中裸卵 的退化程度更高 . 关键词 :绵羊卵母细胞 ;卵泡大小 ;卵丘细胞层多少 ;超微结构 中图分类号 :Q954. 44 ;Q954. 45文献标识码 :A Ultrastructural Changes of Ovine Oocytes Cultured In Vitro L IU Zhe , L I Rong2feng , BOU Shorgan ( )The Research Center f or L aboratory A nimal Science , NeiMongol University , Hohhot 010021 , PRC Abstract :This study was designed to examine the ultrastructural changes of ovine oocytes classified according to follicular size and layers of cumulus cells before and after in vitro culture . The results showed that compared with oocytes matured in vivo the distribution of mitochondria and CGs in small follicular oocytes is less ideal than those of oocytes from big and medium follicules. However , the distribution of mitochondria in big and medium follicular oocytes is not the same as that in oocytes matured in vivo , which indicated that the present cultural system can not support cytoplast to mature completely. According to the state of mitochondria , CGs , microvilli and lipid drop , the oocytes with no or expanded cumullus cells were identified as degenerated oocytes. Key words :ovine oocyte ;follicular size ;layers of cumulus cell ; ultrastructure 〔1〕〔2〕早在 1975 年 Tsafriri和 Bedirian等报道 ,卵母细胞受精后的发育能力与卵泡大小及卵丘细胞层 多少等因素有关. 作者曾利用醋酸地衣红和荧光染料 LCA2FITC 研究了来自不同大小卵泡及带有不同卵 丘细胞层数的卵母细胞在体外成熟培养过程中其核相和皮层颗粒的分布情况 ,发现若以核相到达 M ? () 第二次减数分裂中期及皮层颗粒单层分布于质膜下分别作为核和质成熟的指标 ,则卵泡大小和卵丘 细胞层多少均与卵母细胞的体外成熟能力存在相关关系 ,大卵泡卵的核质成熟能力高于小卵泡卵 ,卵丘 细胞层完整的卵母细胞核质成熟能力高于裸卵和带有已扩散卵丘细胞的卵母细胞. 但截止到目前 ,关于 卵泡大小及卵丘细胞层多少对体外培养卵母细胞的线粒体 、高尔基体 、微绒毛以及内质网等细胞器是否 存在影响尚未见报道 ,本实验首次对按这两种方法分类后的卵母细胞在成熟培养前后超微结构的变化 进行比较 ,从而探明卵母细胞质成熟及退化的细胞学机制 ,为选择能用于体外受精的高质量卵母细胞提 供理论依据. 1 材料与方法 1 . 1 卵母细胞的采集和成熟培养 实验 1 :将卵巢表面可见卵泡按其直径大小分为小于 1 mm 、13 mm 和大于 3 mm 三类 ,将卵泡用手术 刀片割开 ,用药匙取其内容物分别置于标明类别的三个装有采卵液的试管中 ,采卵液为含有 3 mg/ ml Ξ 收稿日期 :1999207206 基金项目 :八五攻关项目基金资助课题 () 作者简介 :刘吉吉 1973,女 ,内蒙古科右前旗人 ,博士生 . () 的 PBS 液 ,将回收的卵母细胞于 M199 培养液培养 含有 1 %雌二醇 、1 %FSH、1 %L H、10 %FCS,培养 件为 38 . 5 ?,5 %CO. 2 ) ( 验 2 :采集卵巢表面可见卵泡内卵母细胞 ,在光镜下根据卵丘细胞层多少将卵母细胞分为 1带三层 ) ) ) ) ) ( ) ( ) ( 上致密卵丘细胞、2带一至三层较疏松卵丘细胞、3裸卵和 4卵丘细胞已扩散四类卵母细 卵母细胞的电镜观察 将上述各类卵母细胞于成熟培养 0 h 及 24 h 取出 ,经 2 . 5 %戊二醇及 1 %的锇酸双固定后按常规方制成包埋块 ,经切片及醋酸铀2拧檬酸铅双染色 ,电镜下观察. 结果 粗面内质网和滑面内质网在各类卵母细胞之间以及成熟培养前后均无明显差异. () 线粒体 mt的形态在各类卵母细胞中成熟前后无明显变化 ,但其分布变化较大. 成熟培养前 ,小卵卵 mt 在细胞质内部成簇分布 ,中等卵泡卵 mt 聚集于细胞皮质区 ,大卵泡卵 mt 分散于细胞质内部. 成 培养后 ,小卵泡卵 mt 聚成小簇分布于细胞质 ,而大 、中卵泡卵 mt 均匀分散于细胞质. 以卵丘细胞层多 ) ) ) 而分的四类卵母细胞中 ,1、2类卵母细胞 mt 的变化同中等卵泡卵 ,3类卵子 mt 在成熟前后都随机 ) 布. 4类卵子培养前 mt 与脂滴相伴均匀分布 ,培养后 mt 失去与脂滴的伴随关系 ,随机分布于细胞质 高尔基体在卵母细胞成熟培养前位于皮质区 ,成熟培养后向胞质内迁移 ,体积变小且趋于退化. ) 、4类卵子培养前高尔基体已有退化趋势 ,培养后完全退化. 按卵泡大小进行分类的各类卵母细胞 ,在进行成熟培养前胞质内充满了不均匀的脂滴 ,成熟培养 ) ) 脂滴趋于均匀且数量有所减少. 3、4类卵子成熟前后均存在较大且形状不规则脂滴. 成熟培养前 ,小卵泡卵微绒毛伸入透明带 ,皮层颗粒于皮质深层成簇分布 ,大 、中卵泡卵微绒毛已 离透明带 ,皮层颗粒迁移到质膜下. 培养后三类卵子微绒毛消失 ,其中大 、中卵泡卵皮层颗粒单层分布 ) ) ) 质膜下 ,小卵泡卵皮层颗粒成簇聚在质膜下. 3、4类卵子培养前微绒毛消失 ,4类卵子皮层颗粒单层 ) 布于质膜下 . 培养后皮层颗粒聚于皮质深层. 3类卵子培养前皮层颗粒随机分布 ,培养后有聚集趋势. 讨论 利用透射电镜对根据卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后的不同卵母细胞进行超微结构的研究 ,结 表明 :各类卵母细胞之间以及成熟培养前后粗面内质网和滑面内质网均无显著差别 ,而线粒体 、高尔 体 、脂滴 、微绒毛及皮层颗粒无论在成熟培养前后还是在不同卵母细胞之间都有显著差异. () 线粒体 mt是细胞内的能量供给场所 ,在卵子发生及成熟过程中 ,其分布及形态均要发生较大的变 Cran 、Hyttel 在研究卵母细胞在体内发育的形态变化时发现 ,卵母细胞发生早期 ,mt 聚集于细胞质中 随卵母细胞的发育 ,mt 向皮层迁移 ,成熟的卵母细胞中 mt 与脂滴相伴均匀分散于胞质 . Hyttel 推测 : 与脂滴的这种伴行关系与卵母细胞受精后的发育潜力有关 ,脂滴中积聚着大量的脂类 ,这些物质在 〔3〕β 中发生氧化 ,氧化产物乙酰辅酶 A 通过三羧酸循环 、氧化磷酸化可以为胚胎发育提供能量. 本实中以卵泡大小所分的各类卵子以及带有致密卵丘细胞或 13 层较疏松卵丘细胞的卵母细胞均未表现 明显的 mt2脂滴伴行关系 ,而刚刚采集的卵丘细胞已扩散的卵母细胞 mt 与脂滴相伴分布 ,而这类卵经 质鉴定判断为体内已成熟卵 ,这进一步证明了 Cran 等的推论 ,同时说明本实验所采用的成熟培养系 不能支持卵母细胞 mt 充分成熟 ,这样有可能在以后的胚胎发育过程中出现能量供应障碍 ,从而导致 外胚质量下降. 许多学者在研究体内卵子发生过程中超微结构的变化时发现 :在即将排卵时 ,卵母细胞内脂滴数量 〔4〕 多,他们认为脂滴的增多以及脂滴与线粒体在分布上的联系与卵母细胞受精后的发育能力有关 ,脂中贮存着大量脂类 ,其作为胚胎发育中的内源性能源物质 ,为胚胎发育提供能量 ,但本实验中卵母细 成熟培养后脂滴数量减少 ,且体积趋于均匀 . Spector 认为脂滴中的脂类主要是甘油三酯和游离脂肪 在体外培养时 ,这些物质由培养基中添加的血清中获得 ,Spector 比较了在培养基中加入 20 %人血清 无血清培养基中培养的胚胎的脂滴情况 ,发现在有血清培养基中培养的胚胎脂滴数量明显高于培养 〔5〕 无血清培养基胚胎. 本实验中培养基内添加了 10 %胎牛血清 ,笔者推测 ,本实验中成熟卵母细胞内 图版说明 : 图版 1 1. 成熟培 养前小卵泡卵 ,示微绒毛伸入 透明带中 ,皮层颗粒成簇分布 () 于皮质深层 6 000 ×; 2. 成熟 培养前小卵泡卵 ,示皮层颗粒 () 成簇分布 10 000 ×;3. 成熟培 养前 大 、中 卵 泡 卵 , 示 微 绒 毛 脱出透明带 ,皮层颗粒于质膜 ( ) 下分布 6 000 ×; 4. 培养 24 h 后大 、中卵泡卵 ,微绒毛消失 , 皮层 颗 粒 单 层 分 布 于 质 膜 下 () 10 000 ×; 5. 成 熟 培 养 前 裸 卵 ,微 绒 毛 消 失 , 皮 层 颗 粒 随 机分布 ,胞质内有形状不规则 () 的大脂滴 6 000 ×; 6. 培养 24 h 后裸卵 , 皮 层 颗 粒 有 聚 集 趋 势 ,胞质中存在较大的不规则 () 脂滴 4 000 × Plate 1 1. Small follicular oocyte before mature culture . Microvilli were in zona and CGs aggregated ( in clusters in the cytoplasma 6 ) 000 ×; 2. Small follicular oocyte before mature culture . CGs aggre2 ) ( gated in clusters 10 000 ×; 3. Big and medium follicular oocytes before mature culture . Microvilli breaked off zona and CGs located () next to oolemma 6 000 ×; 4. Big and medium follicular oocytes af2 ter 24h′s culture . Microvilli disap2 peared and CGs lined up under ( ) oolemma 10 000 ×; 5. Oocytes without cumullus cells before ma2 ture culture . Microvilli disap2 peared and CGs located randomly and large lipid drops filled in cy2 ) ( toplasma 6 000 ×; 6. Oocytes without cumullus cells after 24h′s culture. CGs aggregated and large ( lipid drops are in cytoplasma 4 )000 × 脂滴数量减少的原因有可能是由于培养基中血清浓度过低 . 至于成熟后卵母细胞脂滴均匀化机制目前 还不清楚. 微绒毛是细胞膜形成的突起 ,常见于未成熟卵母细胞 ,它在透明带内与卵丘细胞突起形成的细胞间 连接使得卵丘2卵母细胞间物质 、信息的交流成为可能 ,而这种交流对于卵丘细胞调节卵母细胞的生长 、 发育 、成熟是必不可少的. 有学者报道 : 卵丘细胞将抑制卵母细胞核成熟的小分子如 cAMP 等通过细胞 〔6〕连接运至卵母细胞中 ,阻止卵母细胞恢复减数分裂,排卵前 ,微绒毛断裂 ,细胞耦联终止 ,同时卵母细 胞恢复减数分裂 ,由此可见 ,微绒毛的存在方式与卵母细胞的发育阶段直接相关 . 本实验中小卵泡卵微 绒毛伸入透明带与卵丘细胞形成细胞连接 ,而另两类卵泡卵微绒毛已断离透明带 ,细胞连接消失 ,笔者 曾研究过卵泡大小与卵母细胞体外成熟能力的关系 ,结果直径小于 1 mm 卵泡卵母细胞的体外成熟能 力明显低于大卵泡卵 ,推测 :小卵泡卵母细胞内成熟抑制因子浓度高于大 、中两类卵泡卵 ,很可能这是造 成小卵泡卵在体外培养中成熟迟滞的主要原因之一. 皮层颗粒是未受精卵母细胞的特有结构 ,在阻止多精受精 、保证胚胎正常发育上起重要作用 ,其分 图版 2 1. 成熟培养前卵丘细 胞已扩散的卵母细胞 ,微绒毛 消失 ,皮层颗粒单层排列于质 膜 下 , 线 粒 体 与 脂 滴 相 伴 () 6 000 ×; 2. 培养 24 h 后卵丘 细胞已扩散的卵母细胞 ,皮层 () 颗粒聚于脂滴膜下 4 000 ×; 3. 培养前卵母细胞 ,示高尔基 () 体 30 000 ×;4. 培养后卵母细 ( ) 胞 ,示高尔基体 30 000 ×; 5. ( 示 退 化 的 高 尔 基 体 30 000 ) () ×;6. 示线粒体 30 000 × Plate 2 1. Oocyte with expanded cumullus cells before mature cul2 ture. Microvilli disappeared and CGs lined up under oolemma and mitochondria were together with ( ) lipid drops 6 000 ×; 2. Oocyte with expanded cumullus cells after 24h′s culture . CGs aggregated ( ) around lipid drop 4 000 ×; 3. Oocyte before culture . Showing ( ) Golgi complexes 30 000 ×; 4. Oocyte after culture . Showing Gol2 ) ( gi complexes 30 000 ×; 5. De2 ( graded Golgi complexes 30 000 ) () ×;6. Mitochondria 30 000 × 布被视为卵母细胞成熟与 否的重要标志 , 哺乳动物 卵母细胞成熟晚期皮层颗 粒出现离心运动表明卵母 细胞质成熟. 本实验结果 表明 , 各类未成熟卵母细 胞皮层颗粒的分布明显不 同 ,小卵泡卵皮层颗粒成 簇分布于皮质深层 ,大 、中 泡卵皮层颗粒分散于质膜下但未呈单层分布 ,有学者报道皮层颗粒来源于高尔基体 ,在起始合成时 , 〔7〕 层颗粒聚集于合成部位 ,随着卵母细胞的发育皮层颗粒向皮质区迁移,由于不同卵母细胞的起始发阶段不同 ,于是出现了采出时皮层颗粒分布不同的现象. 成熟培养后大 、中卵泡卵皮层颗粒单层分布 , 在小卵泡卵则聚于质膜下 ,说明小卵泡卵经过体外培养其细胞质不能达到充分成熟. 裸卵及卵丘细胞 扩散的卵母细胞成熟培养后皮层颗粒趋于聚集 ,关于其聚集机制还有待于进一步研究 . 总之 ,通过对各类卵母细胞成熟培养前后超微结构的研究 ,本实验得出如下结论 ,采自不同大小卵 的卵母细胞 ,经体外培养后细胞质成熟状况不同 ,小卵泡卵母细胞皮层颗粒未能单层分布于质膜下 ; 卵和卵丘细胞已扩散的卵母细胞空泡化严重 ,属于老化的卵母细胞 ;本实验采用的体外培养系统不能 持绵羊卵母细胞线粒体充分成熟. 考文献 : Tsafriri A ,Channing CP. An inhibitory influnce of granulosa cells and follicular fluid upon porcine oocytes meiosis in vitro J . En2 docrinology . 1975 ,96 :922927. 2 Bedirian KN ,Shea BF , Latour J P. Follicular development , oocyte maturation and ovulation in gonadotrophin2treated prepubbral calves J . Can J An Sci . 1975 ,55 :193199. Cran DG ,Moor RM. The cortical reaction in pig oocytes during in vivo and in vitro fertilization J . Gamete Res . 1986 ,13 :2412 3 251. Cran DG ,Moor RM , Hay MF. Fine structure of the sheep oocyte during antral follicular development J . J Reprod Fert . 1980 ,59 : 4 125132. Spector AA. Fatty accid , glyceride and phospholipid metabolism . In Rothblat GH , Cristofalo VJ eds. Growth , Nutrition and 5 metabolism of Cells in Culture . Vol Nem York : Academic Press ,1972. 259296. Dekel N. Rat oocyte maturation in vitro : Relief of cyclic AMP inhibition by gonadotropins J . Pro. N at . Acad. Sci . , USA , 6 1978 ,75 :4 3694 373. Szollosi D. 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