原代细胞鉴定免疫荧光检测Keratin、vimentin、Ki67表达免疫荧光检测Keratin、vimentin、Ki67表达
将P2/P5代处于对数生长期的PICs制备成单细胞悬液,调整细胞密度为1×105个/mL,以每孔1 mL
接种于6孔细胞培养板(内置直径为18 mm的圆型培养盖玻片),置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养,间隔3 d换液1次。7 d左右可观察到细胞均匀覆盖于盖玻片上,将载有细胞的盖玻片从孔板中取出,
PBS液冲洗3次,4%多聚甲醛(含0.1 mol/L PBS)固定10 min,PBS液冲洗3次,0.5% Triton X-100处理30 min...
免疫荧光检测Keratin、vimentin、Ki67表达
将P2/P5代处于对数生长期的PICs制备成单细胞悬液,调整细胞密度为1×105个/mL,以每孔1 mL
接种于6孔细胞培养板(内置直径为18 mm的圆型培养盖玻片),置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养,间隔3 d换液1次。7 d左右可观察到细胞均匀覆盖于盖玻片上,将载有细胞的盖玻片从孔板中取出,
PBS液冲洗3次,4%多聚甲醛(含0.1 mol/L PBS)固定10 min,PBS液冲洗3次,0.5% Triton X-100处理30 min,PBS液冲洗3次,分别滴加Keratin抗体(1∶50)、vimentin抗体(1∶50)、Ki67抗体(1∶50),以PBS代替一抗作为阴性对照,一抗过夜,二抗,封片,激光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况,
拍照。
Ki67-阳性率越高,表示处于增殖期的细胞比例越高,阳性部位:核内。
(CK)Keratin-肿瘤干细胞的标志物,阳性部位:胞浆,
因上皮细胞表达角蛋白,间质细胞表达波形蛋白,分别以CK19和Vimentin为一抗, (PBS代替一抗作为空白对照),分别鉴定上皮细胞和间质细胞。
(CK+,vimentin-)表示细胞不是间质来源的细胞,如上皮来源的肿瘤细胞。
(CK-,vimentin+)表示细胞为间质来源的细胞,如成纤维细胞,
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