等电聚焦电泳(IEF)分离蛋白及测定蛋白质等电点.doc
一、原理
等电点聚焦(IEF)是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳
方法
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在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.
二、仪器与试剂
1(材料:蛋白样品
2(试剂:
聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100
电极液:1M磷酸(阳极液)、1M氢氧化钠(阴极液)
固定液:100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml
染色液:0.35g考马斯亮蓝R,150溶于300ml脱色液中，加热到60,70?，加入0.3g硫酸铜。 脱色液:25,乙醇、8,冰乙酸溶于水
样品缓冲液:1,Ampholine 、2,Triton X-100、9M尿素
三、操作步骤:
1, 样品制备:
用IEF样品缓冲液提取待
分析
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样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具:
洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶:
胶液组成:6ml胶母液(10,，19/1)
6,8,尿素
1ml Ampholine (pH3.5-10)
60-80ul 10%AP
5 ul TEMED
4, 灌胶:配好的胶迅速灌入模具
5, 电泳:
等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。
6, 表面电极测定蛋白质的pI
7, 固定:取出塑料片，放入固定液中15min
8, 染色:取出塑料片放入染色液中65?染色，直至条带出现
9, 可脱色至背景消除后干燥保存。
四、结果 (略)
五、注意事项
1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2,-3,较合适，能形成较好的pH梯度。 2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。
3、 过硫酸铵一定要新配置。
4、 所有水用重蒸水。
5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。 6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。
浙公网安备 33021202002483