真核表达载体pEGFPclaudin1的构建及其在293T细胞中的表达.doc

真核 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达载体pEGFPclaudin1的构建及其在293T细胞中的表达.doc 真核表达载体pEGFP claudin 1的构建及其在293T细胞中的表达 【摘要】 目的: 构建真核表达载体pEGFP claudin 1, 并在293T细胞中进行表达。方法: 用反转录聚合酶链反应(RT PCR)方法扩增claudin 1开放读码框(ORF)基因, 将其插入到pEGFP C3载体的Xho I和BamH I酶切位点, 构建真核表达载体pEGFP claudin 1, 酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染293T细胞, 进行荧光检测和Western blot分析。结果: 构建了含有claudin 1 ORF的真核表达质粒pEGFP claudin 1, 转染293T细胞后, 经荧光可见细胞膜有EGFP claudin 1融合蛋白的表达, Western blot检测发现有相对分子质量(Mr) 49000的蛋白条带。结论: 成功地构建真核表达载体pEGFP claudin 1, 并在293T细胞中表达, 为研究claudin 1的功能奠定了基础。 【关键词】 claudin 1 绿色荧光蛋白 真核表达载体 293T细胞 Claudin 1是一种紧密连接蛋白, 属于claudin家族成员, 在肝脏中高度表达, 其他上皮组织中也有表达[1]。近年的研究发现, claudin1的异常表达与肿瘤的发生密切相关[2, 3], 成为这一领域研究的热点。最近, Evans等[4]发现claudin 1作为辅受体在HCV入胞过程中发挥重要作用, 使人们对claudin 1有了新的认识, 为深入理解HCV感染的分子机制开辟了新的思路。为此, 本实验我们构建了人claudin 1基因的真核表达载体, 将其转染293T细胞进行了表达, 为研究claudin 1与HCV感染的关系奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 菌株DH5α、 HepG2细胞由本实验室保存, 293T细胞由第四军医大学基础部遗传与发育生物学教研室韩骅教授惠赠; pEGFP C3载体购自BD Clontech公司; TRIzol试剂、 Platinum Taq酶、PureLinkTM质粒小量提取试剂盒、 Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司; RevertAidTM第1链cDNA合成试剂盒, PageRulerTM蛋白marker购自Fermentas公司; 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根公司; 限制性内切酶、T4连接酶和DNA marker DL 2000购自TaKaRa公司; 抗GFP多克隆抗体购自eBioscience公司, 小鼠抗兔IgG二抗为晶美公司产品。 1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取 按TRIzol试剂的使用说明提取HepG2细胞总RNA。 1.2.2 claudin 1引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与合成 参照claudin 1核苷酸序列(GenBank注册号为NM 021101), 设计如下引物: 上游引物为5′ATCTCGAGATGGCCAACGCGGGGCTGCAG 3′, 下游引物为5′ GTGGATCCTCACACGTAGTCTTTCCCGCTG 3′。引物中划横线的碱基序列分别为Xho I和BamH I的酶切位点, 引物由北京博迈德科技公司合成。 1.2.3 cDNA合成及PCR扩增、 纯化及克隆 应用随机引物, 使用Fermentas公司RevertAidTM第1 链cDNA合成试剂盒合成第1 链cDNA。以cDNA为模版, 分别用claudin 1上下游引物进行扩增, PCR扩增条件: 94?变性5 min; 94? 45 s, 64? 45 s, 72? 1 min, 35个循环; 72? 10 min结束扩增。PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶上电泳分离后纯化。 1.2.4 载体的构建 用限制性内切酶Xho I, BamH I消化PCR产物及pEGFP C3载体, 胶回收试剂盒回收目的片段及载体, T4连接酶4?连接过夜, 转化到DH5α感受态细菌, 挑克隆, PCR及酶切筛选和鉴定重组质粒。阳性克隆抽提质粒后测序, 序列测定由上海Invitrogen公司完成, DNAStar软件进行核苷酸序列分析。 1.2.5 转染293T细胞 将293T细胞接种于6孔板, 80%,90%细胞满底后, 采用pEGFP claudin 1质粒4 μg和lipofectamine 200010 μL按试剂盒说明进行转染, 同时以转染pEGFP C3质粒的细胞株为对照。 1.2.6 荧光检测 转染后48 h取细胞爬片, 用PBS洗涤2次, 再以双蒸水洗3次, 滴加500 mL/L甘油缓冲液封片, 于荧光显微镜下观察阳性细胞。 1.2.7 Western blot分析 转染后48 h收集细胞, 加入100 μL蛋白裂解液提取总蛋白, 置-70?保存。取15 μL表达产物进行SDS PAGE, 电泳后进行电 转移, 将凝胶转移至硝酸纤维素(NC)膜上, 然后将NC膜置于含50 g/L脱脂奶粉的TBST中封闭1 h, 先后与含30 g/L BSA的TBST稀释(1?1000)的兔抗GFP多克隆抗体及1?5000稀释的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗兔IgG作用, 化学发光法显色5 min。 2 结果 2.1 claudin 1基因片段的扩增 从HepG2细胞中提取总RNA, 以逆转录酶获得claudin 1 cDNA第1条链, 以基因特异性引物PCR扩增获得大小为652 bp的目的片段(图1)。 2.2 claudin 1基因真核表达载体的构建 回收目的片段, 酶切后插入pEGFP C3真核表达载体的Xho I和BamH I酶切位点中, 构建pEGFPclaudin 1真核表达载体, 用双酶切鉴定(图2), 并送测序, 结果用DNAStar软件进行分析, 与GenBank公布的序列一致。2.3 EGFP在293T细胞中的表达 转染293T细胞48 h后, 直接在荧光显微镜下观察, 可见转染pEGFP claudin 1的293T细胞在细胞膜有较亮的荧光分布, 而转染pEGFP C3的293T细胞在整个细胞都可见有弥散性绿色荧光的表达(图3), 说明融合蛋白EGFP claudin 1在真核细胞中表达, 且主要表达于细胞膜上。 2.4 Western blot鉴定 真核表达产物应用Western blot分析, 对照显示Mr 27000条带, 融合蛋白在约Mr 49000处显示特异性条带(图4), 符合GFP及目的蛋白Mr的大小。 3 讨论 Claudin家族是构成紧密连接的主要蛋白分子, 有24个成员, Mr在20000,27000之间, 与Occludin、 连接黏附分子构成了细胞间的紧密连接, 阻止膜蛋白及液体的侧向扩散, 从而维持细胞顶端和基底区的不同组分构成。因此, 在维持细胞极性中起重要作用。Claudin 1有4个疏水的跨膜区, 2个细胞外环状结构(extracellular loops, EL), EL2是细菌毒素的受体, 氨基端和羧基端均位于胞质中[5], 羧基端参与信号转导, 通过PDZ(postsynaptic density 95, discs large, zonula occludens)基序与ZO 1和ZO 2等蛋白相互作用[6]。Claudin 1主要在肝脏高度表达, 在其他上皮组织中也有表达, 其异常表达与肿瘤的发生发展关系密切。近期研究表明, claudin 1在HCV入胞过程中至关重要, HCV不能感染正常的缺乏claudin 1的293T细胞, 但在外源性表达claudin 1后, 293T细胞对HCV易感性增加, claudin 1 EL1与HCV入胞密切相关, 针对claudin 1 EL1的抗体可以阻断HCV的感染。进一步的研究表明claudin 1在病毒与辅受体CD 81发生作用以后, 也就是在HCV入胞过程的后期发挥作用[4]。此外, 有报道认为claudin 1在HCV细胞间的传播过程中起关键作用, 在体外HCV可以通过游离病毒直接感染细胞或是通过细胞间途径传播, 而后者依赖claudin 1的表达, claudin 1介导的HCV细胞间传播可逃避中和抗体的作用, 这可能是HCV宿主体内持续存在的重要原因[7]。因此, claudin 1可能是HCV感染过程中的关键分子, 深入研究紧密连接蛋白claudin 1对阐明HCV感染的分子机制和HCV靶向治疗的研究都具有十分重要的意义。 claudin 1基因ORF含有636个碱基, 编码211个氨基酸, 我们通过RT PCR从HepG2细胞中获取claudin 1基因, 构建claudin 1的真核表达载体, 经测序证实无误, 将其转染至293T细胞, 由于所用载体含有EGFP, 可直接用荧光显微镜观察到其表达。本实验结果表明, 荧光显微镜下可观察到转染后的293T细胞胞膜有明显的绿色荧光; Western blot也显示有融合蛋白EGFP claudin 1在293T细胞中获得表达, Mr大小约为49000, 说明构建的重组载体成功转染至293T细胞中。我们在成功克隆claudin 1基因的基础上, 在真核细胞中对外源基因进行表达并对其在细胞内的定位进行了研究, 为进一步研究claudin 1的功能奠定了基础。 【