实验一 氨基酸的纸层析

实验一 氨基酸的纸层析 《植物生理生化》实验指导 适用专业农学类相关专业 黑龙江八一农垦大学植物科技学院生理生化教研室 目 录 生物化学实验部分 实验一、氨基酸的纸层析 ?????????????????????????????????????????????? 1 实验二、蛋白质含量测定设计性实验?????????????????????????????????? 5 实验三、酶的基本性 质?????????????????????????????????????????????? 7 实验四、维生素C含量的测定?????????????????????????????????????????? 12 实验五、还原糖和总糖的测定?????????????????????????????????????????? 14 实验六、淀粉酶活性的测定???????????????????????????????????????????? 17 实验七、脂肪浸提——索氏脂肪浸提法?????????????????????????????????? 20 实验八、一种简单实用的提取植物DNA的方法???????????????????????????? 22 实验九、聚丙烯酰胺电泳法测定大麦、小麦种子纯度 ???????????????????? 24 实验十、淀粉酶的诱导、提取和活性测定综合性实验???????????????????? 26 植物生理学实验部分: 实验一、植物组织水势的测定小液流法???????????????????????????? 28 实验二、植物伤流量的测定???????????????????????????????????????????? 30 实验三、根系活力的测定?????????????????????????????????????????????? 31 实验四、蒸腾强度的测定?????????????????????????????????????????????? 35 实验五、叶绿体色素的提取、分离、性质和定量测定综合性实验?????????? 37 实验六、光合强度的测定改良半叶法?????????????????????????????????? 39 实验七、呼吸强度的测 定???????????????????????????????????????????? 41 实验八、植物抗逆性的鉴定电导仪法???????????????????????????????? 43 实验九、植物缺水程度的测定脯氨酸法?????????????????????????????? 45 1 生物化学实验部分 实验一 氨基酸的纸层析 一、目的 层析分析法已广泛用于氨基酸、核酸、激素、维生素、糖类的分离与分析。其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质设备简单操作容易样品用量很少结果也较明确。 本实验的目的在于要求学生掌握纸层析法的一般原理和操作技术。 二、原理 纸层析法是以滤纸作为支持物的分配层析法。分配层析法是利用物质在两种不同混合溶剂中的分配系数不同而达到分离的目的。通常用α 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示分配系数。在一定条件下一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。 溶质在流动相的浓度溶质在静止相的浓度lsCC 层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维素对水有较强的亲和力纸上有很多-OH 基与水以氢键相连吸附很多水分子一般达滤纸重的22左右其中约有6的水与纤维素结合成复合物因此使这一部分水扩散作用降低形成静止相而有机溶剂与滤纸的亲和力很弱可以在滤纸的毛细管中自由流动便形成流动相。层析时将滤纸一端浸入层析溶剂中有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。分配的过程一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区并进行重新分配即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动溶质不断地在两相间进行可逆的分配不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同在两相间分配的数量也就不同分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多向前移动的速度快而分配系数大的溶质在静止相中分配的数量多移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。 移动速度一般用移动速率表示Rf 表示 原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距fR 2 各种化合物在恒定条件下经层析后都有其一定的Rf值也就是说在层析谱中有一定的位置。借此可以达到分离、定性、鉴别的目 的。 Rf值决定于很多的因素其中最主要的是所分离物质的分配系数。物质的分配系数是由以下因素决定的 1物质极性的大小。水的极性很强一般极性强的物质就容易进入水相非极性的物质易进入有机溶剂中。例如侧链含-OH和-NH2、-COOH较多的氨基酸分配在水相中Rf值较小而含非极性如-CH3 较多的物质其分子的极性降低Rf值增大。 2滤纸的质地以及为水分饱和的程度。滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄适当具有一定的机械强度层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。 3溶剂的纯度、pH值和含水量。pH值和含水量的改变可使氨基酸和层析溶剂极性改变Rf值也随之改变。 4层析的温度和时间。温度改变使溶剂中有机相含水量改变Rf值也改变。当所有条件相同时层析时间短测Rf值的因素必须严格控制。 三、实验材料、仪器和试剂 1、 实验材料在25?温箱中萌发2-3天的绿豆芽。 2、 仪器1 恒温水浴一台2烘箱一个3研钵一个4三角瓶一个 5 蒸发皿一个650毫升分液漏斗一个7量筒三个8 微量吸管或标有刻度的毛细管9电热吹风机一个10 层析缸及培养皿11层析滤纸12小型喷雾器一个13剪刀、刀片、铅笔、尺子、玻棒、凡士林、点样瓶。 3、试剂 1氨基酸 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液浓度为0.01M溶于10异丙醇中。 第一组天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸。 第二组鸟氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、缬氨酸。 第三组谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸。 第四组酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺。 第五组胱氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、瓜氨酸、天门冬酰胺。 2溶液系统 第一向正丁醇甲酸水1532体积摇匀静止备用。 3 第二向苯酚水8020重量。配制方法在分液漏斗中先计量加入少量无离子水再加入一定量的新蒸馏的酚。根据酚量补足应加入的全部无离子水这样可避免因酚的冷凝而造成的溶解困难。充分摇匀后静止备用。 3无离子水用于实验中各种试剂配制。 410异丙醇用于配制氨基酸标准液。 580乙醇取分析乙醇以无离子水稀释。 60.25的水合茚三酮溶液。 7活性炭。 8石英砂。 四、操作步骤 1、 氨基酸的提取 取新鲜的绿豆芽下胚轴2克加80乙醇10毫升加少量石英砂在研钵研成匀浆移入三角瓶用少量80乙醇淋洗研钵一并移入三角瓶加0.8克活性炭置沸水浴中加热至沸1分钟取下冷却用滤纸过滤用少量80乙醇冲洗滤渣。滤液收集在蒸发皿中置50-60?水浴上蒸干。用1毫升10异丙醇溶解收集样液准备点样。 2、 滤纸的准备 单向层析滤纸取28??28厘米层析滤纸一张在对应的两边距每边2厘米处用铅笔和直尺各划一条平行于纸边的直线其中一条为溶剂前沿到达标志另一条为点样线。在点样线上每隔2厘米划一与点样线垂直的短线标出五组标准氨基酸和样品的点样位置 双向层析滤纸取28??28厘米层析滤纸二张在距每边2厘米处各划一条平行于纸边的直线以“井”字格下边缘直线左端交点为点样原点原点右手为第一向另一垂直方向为第二向。用一张作标准氨基酸图谱另一张作样品图谱。 3、点样 点样时选用微量吸管或标有刻度的毛细管每小格1微升分别在每个点样处精确点样4微升。必须在每一滴样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥可在有加热装置的点样台上进行或用吹风机吹干样点的直径以2-3毫米为宜点样时温度不能过高否则会破毁氨基酸。将点好样品的单向和双向层析滤纸均卷成筒形在上、中、下三处系三道线但滤纸两边缘不能接触。为了消除盐酸的干 4 扰避免拖尾现象可将层析滤纸放入盛有浓氨水的层析缸中熏10分钟取出后在45?烘箱中将氨驱净再行层析。 4、层析 本试验采用上层析法。 1 单向层析取适当大小的层析缸一个缸底放一培养皿向培养皿内加入第一向溶剂液层厚约1.5厘米在培养皿上横放两根玻棒取已点好的样品的单向层析滤纸以点样端朝下放在盛有层析溶剂的层析缸内的玻棒上盖上盖子 滤纸切勿与溶剂接触。平衡一小时然后将滤纸放入层析溶剂中注意样点不能进入溶剂以免浸脱。将层析缸密封这时溶剂沿纸上升待溶剂前沿到达标志线时立即取出用吹风机吹干或45?下烘干然后显色。 2 双向层析按上述单向层析方法将点好标准氨基酸的样品的双向层析滤纸分别用第一向溶剂进行上行层析到达前沿标志线时立即取出吹干溶剂减去溶剂前沿以外的部分然后将纸转90?角以同样的方法用第二向溶剂进行上行层析当溶剂前沿到达标志时立即取出吹干或45?下烘干进行显色。 5、显色 用喷雾器将0.25 的茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸上注意不要喷得过多。用吹风机吹干溶剂后放在60-65?烘箱中烘30分钟或用吹风机吹热风即能显现各种氨基酸的色斑。为了消除铵离子的影响可在展开后在滤纸上喷1的氢氧化钾的无水乙醇溶液在60?下保持15分钟以使全部氨完全挥发掉再行显色。 五、结果与计算 单向层析显色完毕后用铅笔将各色谱的轮廓和中心点描绘出来然后量出由原点至色谱中心点和溶剂前沿的距离计算出各种已知和未知的色谱的Rf值进行比较和鉴定。各组已知氨基酸色谱顺序由指导教师供给。 双向层析Rf值有两个数值组成即要在第一向和第二向层析中各计算一次根据Rf并借助各种氨基酸的特有颜色分别与标准氨基酸对比即可鉴定为何种氨基酸。 六、附注 色素含量不高的植物样品可不用活性炭处理。 5 实验二 蛋白质含量测定设计性实验 一、实验目的 我们将逐步改变实验教学都由实验技术人员准备实验教师讲解学生照做的方法尽量多给学生留下思考的时间和创新的机会。在教师指导下查文献、拟定实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 、调试仪器、配制药品、处理数据、研究和解决实验中出现的问题从失败中获得 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 从成功中获得动力。 蛋白质含量是农产品品质的重要指标之一大豆、水稻等农作物是农业院校学生学习研究的最重要的生物材料。农作物品种及各个发育时期或不同栽培条件下的生理生化指标反映了其品种特性和生长的变化规律掌握这些生理生化指标测定的方法对学生今后的科研实践是非常必要的。在以往的实验中我们没有开设这样的实验设计项目使学生对生物化学实验技术在农业研究方向的重要地位认识不够。所以为了将基础知识与专业技术更好地衔接使学生将生化基本实验技能应用于农学专业的科研、管理很有必要开设此项实验。 1.本实验通过比较不同大豆或水稻等品种或同一品种各个发育时期或不同栽培条件下的籽粒蛋白质含量变化来掌握测定原理学习测定方法并通过分析得出相应结论。 2.提高学生对生物化学实验技术在农业研究方向的重要地位的认识使学生将生化基本实验技能应用于农学专业的未来科研工作中。 二、实验室具备的仪器设备及化学试剂等方面的条件 1.仪器电子天平、过滤装置、移液管、滴定装置、可见分光光度计、紫外分光光度计、离心机、水浴锅、温度计、烘箱、真空抽气机、粉碎机、电炉子、实验室常用玻璃器皿 2.试剂常规化学、生物化学试验的试剂均有如有特殊要求请说明 3.实验材料大豆粉、小麦、玉米等。 三、整体要求 1. 要求学生认真查文献、拟定实验方案、调试仪器、配制药品、处理数据、尽量独立解决实验中出现的问题必要时与老师商量解决以达到锻炼提高的目的。 6 2.书写报告要认真、层次清楚、整洁、对结果有客观分析。 3.最后要有总结自我评价包括独立完成实验的收获、教训、 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 、实验过程中遇到的问题及解决的方法等。 7 实验三 酶的基本性质 酶是生物体中具有催化功能的蛋白质因此也叫生物催化剂。生物体内存在多种多样的酶从而使生物体在温和的条件下能够迅速完成复杂的代谢过程。所以了解酶的基本性质对于揭示各种生化进程具有非常重要的意义。 酶的高效性 一、目的 通过本实验认识酶的催化效率比一般催化剂高。 二、原理 酶 作为一种特殊的催化剂能大大降低反应的活化能从而极大地加快了反应速度。这在生理上具有极其重要的意义。在生物体内某些代谢由于需氧脱氢的结果而产生对机体有毒害作用的H2O2。过氧化氢酶能催化过氧化氢很快地分解成H2O和O2使H2O2不致在体内大量积累。铁粉也是过氧化氢分解的催化剂但其催化效率仅为过氧化氢酶的100亿分之一。 三、实验材料、仪器和试剂 1实验材料马铃薯 2仪器1试管4支2管架1个3研钵4量筒10毫升??1 3试剂12 H2O22铁粉 四、操作步骤 管号 项目 1 2 3 4 2H2O2ml 3 3 3 3 生马铃薯糜 少许 熟马铃薯糜 少许 铁 粉 少许 现 象 解释现象 取4支试管编号按上表操作。 8 酶的特异性专一性 一、目的 1. 了解酶的特异性。 2. 掌握检查酶的特异性的方法及其原理。 二、原理 酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度的特异性即一种酶只能对一种或一类化合物起催化作用。例如蔗糖酶只能催化蔗糖的水解而不能催化淀粉的水解而淀粉酶能催化淀粉水解却不能催化蔗糖水解。本实验以蔗糖酶和淀粉酶对蔗糖和淀粉的作用为例来说明酶的特异性。 三、仪器和试剂 1 仪器 1研钵 2试管6 支3试管架4小烧杯5刻度吸管1毫升??52毫升??1 6漏斗7电热恒温水浴。 2 试剂 11 淀粉溶液含0.3NaCl将1克可溶性淀粉及0.3克氯化钠混悬于5毫升蒸馏水中搅动后缓慢倒入沸腾的60毫升蒸馏水中搅动煮沸1分钟。晾至室温后加水至100毫升放置于冰箱贮存。 22 蔗糖溶液蔗糖是典型的非还原糖若商品蔗糖中还原糖含量超过一定标准则呈还原性这种蔗糖不能使用。所以实验前必须进行检查。本实验用的蔗糖至少应是分析纯的试剂要现用现配。 3淀粉酶液稀释200倍的新鲜唾液。 4蔗糖酶液取1克新鲜酵母放入研钵中加少量石英砂和蒸馏水研磨10分钟左右用蒸馏水稀释至50毫升静止片刻再过滤滤液即为蔗糖酶提取液。 5本乃狄Benedict试剂将17.3克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中。冷却后稀释至150毫升。取柠檬酸钠173克及碳酸钠Na2CO3??H2O100克加水600毫升加热使之溶解冷却后稀释至850毫升。最后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠—碳酸钠溶液中边加边搅拌如有沉淀可过滤。此试剂可长期保存。 四、操作步骤 9 取6支试管编号按下表操作 编号 操作项目 1 2 3 4 5 6 1淀粉ml 1 1 1 2蔗糖ml 1 1 1 淀粉酶液ml 1 1 蔗糖酶液ml 1 1 蒸馏水ml 1 1 反应 摇匀放入37?水浴中保温10分钟 木乃狄试剂ml 2 2 2 2 2 2 反应 摇匀放入沸水加热数分钟 结果 解释实验现象 温度对酶活力的影响 一、目的 通过检验不同温度下淀粉酶的活性了解温度对酶活性的影响并进一步明确酶的最适温度的概念。 二、原理 酶的催化作用受温度的影响很大。在一定温度范围内随着温度的升高酶的热变性不显著而酶促反应速度增加直至达到最大值。由于酶是一种蛋白质温度过高会引起酶的急剧变性导致酶失活因此反应速度达到最大值以后随着温度的升高反应速度急剧下降以至完全停止酶促反应。反应速度达到最大值时的温度称为酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为3740?植物 10 酶的最适温度为5060?。 本实验以不同温度条件下淀粉酶作用于淀粉并用碘液检查酶促淀粉水解程度来说明温度与酶活力的关系。 三、仪器和试剂 1 仪器1 刻度吸管1毫升??22毫升??12 试管3支3 试管架4恒温水浴3个5 冰浴 2 试剂 11淀粉溶液含0.3NaCl配法如前。 2pH7.0磷酸盐缓冲液配法同前。 3碘液 四、操作步骤 取3支试管按下表操作 项目 管号 淀粉酶液ml 酶液处理5分钟 pH6.8缓冲液ml 1淀粉液ml 反应条件10分钟 冷却 3分钟 碘液滴 结果 1 1 0? 2 1 0? 流动水冷却 1 2 1 37? 2 1 37? 1 3 1 70? 2 1 70? 1 解释实验现象。 酶的激活和抑制 一、目的 了解酶促反应的激活和抑制作用学习激活剂和抑制剂影响酶促反应的方法和原理。 二、原理 酶的活力常受某些物质的影响有些物质能使酶的活力增加称为激活剂 11 有些物质能使酶的活性降低称为抑制剂。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如氯化纳达到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活力。 三、仪器和试剂 1 仪器 1试管3支2试管架3漏斗4烧杯5刻度吸管1毫升??45毫升??16恒温水浴710毫升??1 四、 操作步骤 取3支试管按下表操作 管 号 项 目 1 2 3 1NaClml 1 蒸馏水ml 1 1CuSO4ml 1 唾液淀粉酶ml 1 1 1 将上述各管试剂混匀 0.1淀粉ml 3 3 3 保温反应检验淀粉水解程度 摇匀后放入37?水浴中保温反应1分钟左右从1号试管取出1滴溶液置白瓷板上用碘液检查淀粉的水解程度待试液不再变色时取出所有试管。 现象 解释现象 12 实验四 维生素C含量的测定 一、 目的 维生素C是人类营养中最重要维生素之一缺乏时会产生坏血病。水果、蔬菜是供给人类维生素C的主要来源。通过对维生素C含量的测定可以了解果品质量的高低并掌握这一测定方法。 二、 原理 利用染料26-二氯酚靛酚作氧化剂可将还原态的维生素C氧化成脱氢维生素C而染料本身被还原成无色的衍生物。26-二氯酚淀粉在酸性条件下呈红色。在滴定终点之前滴下的26-二氯酚淀粉立即被还原成无色。当溶液从无色转变成为红色时即为滴定终点。 三、 实验材料、仪器和试剂 1、 实验材料水果或蔬菜。 2、 仪器1 微量滴定管500毫升??12量瓶50毫升??23三角瓶500毫升??24 研钵5量筒 6刻度吸管10毫升??2 3、 试剂 11草酸秤取5.0克草酸溶于少量蒸馏水中定容至500毫升。 22草酸秤取10.0克草酸溶于少量蒸馏水中定容至500毫升。 30.001N 26-二氯酚靛酚钠溶液称取干燥的26-二氯酚靛酚钠60毫克放入200毫升量瓶中加热蒸馏水中100-150毫升滴加0.01N NaOH4-5滴强烈摇动10分钟冷却后加水至刻度。摇匀后用紧密滤纸滤于棕色瓶中贮于冰箱中备用有效期一周。使用前需标定见附注。 四、 操作步骤 1、 样品的处理和提取 称取4.0克新鲜样品至研钵中加5毫升2草酸研成冉,?方诽崛?鹤频?0毫升量瓶中。残渣再用2草酸提取2-3次提取液及残渣一并转入量瓶。2草酸总量为35毫升最后以水定容。溶液定容时若泡沫较多可加几滴乙醇消除泡沫后再定容。摇匀过滤滤液备用。 13 2、 样品的测定 吸取滤液10毫升放入50毫升三角瓶中立即用26-二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的红色并在15秒内不消失为止。记录所用滴定液体积。 3、 空白测定 在另一50毫升三角瓶内放入35毫升2草酸并用1草酸定溶摇匀取此液10毫升放入另一50毫升三角瓶内用26-二氯酚靛酚钠滴定至终点记录染料用量。 结果与计算 100321VWVKVVX X100克样品所含维生素C毫克数毫克/100克 W称取样品重克 V1滴定样品所用染料毫升数 V2滴定空白所用染料毫升数 V样品提取液稀释之总体积即50毫升 K1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数可由标定算出 六、附注 126-二氯酚靛酚钠溶液的标定准确称取维生素C20毫克用1草酸溶解定容至200毫升。吸取此液10毫升以1草酸再次稀释定容至200毫升。吸取此液10毫升放入50毫升三角瓶中同时吸取10毫升1草酸于另一个50毫升三角瓶中做空白对照立即用所要标定的26-二氯酚靛酚钠滴定至粉红色出现15秒不消失记录所用毫升数按下式计算K值即1毫升染料所能氧化抗坏血酸的毫克数。 VGK1020010200 式中G为称取维生素C的毫克数。V为滴定10毫升标准维生素C时所用去染料的毫升数与滴定空白所用毫升数之差值 2操作要尽可能快并防止与铁铜器具接触以减少维生素C的氧化。 3草酸及样品的提取液避免日光直射。 4当样液本身带色时测定前于提取液中加2-3毫升二氯乙烷。在滴定过程中当二氯乙烷由无色变粉红色时即达终点。 14 实验五 还原糖和总糖的测定 一、目的 掌握还原糖和总糖定.