生物样品自动前处理系统CosenseforBA基础知识

生物样品自动前处理系统Co-senseforBA基础知识岛津企业管理(中国)有限公司　分析仪器事业部上海分析中心2011年11月23日*前处理的现状自动前处理的优点与问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 自动前处理系统Co-SenseforBA的特长采用新型色谱柱和稀释系统实现了高回收率使用新型色谱柱的自动浓缩系统实现了高灵敏度Co-SenseforBA+LCMS系统的特长内容*背景样品前处理是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难点和热点问题之一。由于样品数量极多，且分析物含量越来越低、基体越来越复杂，迫切要求发展高通量、高选择性、高效率的在线样品前处理技术。因此，开展这方面的研究具有极为重要的意义。*HPLC/LC-MS广泛应用于血浆或血清的代谢物分析和原药分析，一般的血浆和血清分析，需要对样本进行预处理，以除去蛋白质，这样会降低精确度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（restrictedaccessmedia-RAM）的预柱，可对血浆样本进行直接分析，而不必进行预处理。这样，可提高精确度、简化操作和提高工作效率。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些问题，需解决的问题：回收率、灵敏度、耐用性。背景*生物样品中的药物分析前处理的要点除蛋白质浓缩手工前处理的问题处理时间重现性药物回收率前处理的现状*除蛋白、浓缩操作自动化的优点提高分析精度离线处理时，难以保持操作完全一致，有时分析精度变差。提高操作简便性离线处理时需操作熟练提高处理效率夜间可自动运行，大幅度地提高了处理效率前处理自动化的课题提高回收率及提高浓缩率自动前处理的优点和课题*提高回收率的手段有必要使与蛋白质结合的药物游离出来与蛋白质结合的药物，在除蛋白质处理时，药物也与蛋白质一起被除去，药物回收率降低。切断蛋白质结合（离子结合，疏水结合）调整样品导入溶液的pH值碱性药物时，使用pH值低的溶液酸性药物时，使用pH值高的溶液调整样品导入溶液的离子强度10-100mM的缓冲液浓度在样品导入溶液中添加有机溶剂在20%以内使用有机溶剂（防止由蛋白质的变性而产生的析出）使用界面活性剂　　(*)从药物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制药离子化的pH值较为理想。*方法我们研究开发出优质的限制性通路媒介（RAM）预柱，应用柱切换HPLC系统及其在线稀释旁路系统，可对血浆直接进行药物分析。我们的系统….回收率即使是紧密与蛋白质结合的化合物，也能被预柱吸附（捕集），并且回收率几乎达到100%灵敏度目标化合物可进行浓缩和分离即使是大体积进样分析也如此。不会造成峰值恶化。耐用性新设计的涂渍技术和粒径优化技术，使得数据保持稳定，即使是长时间的实验也能如此。*Co-SenseforBA何谓Co-SenseforBA用于分析生物样品的应用系统具有在线稀释旁通流路的自动前处理系统和新开发的前处理柱Shim-PackMAYl-ODS的组合，实现了真正的血浆（血清）的直接大量注入。特长可对应蛋白质结合率高的药物使用样品导入用溶液的在线稀释的应用，即使是蛋白质结合率高的药物且在大量注入时也可有效地捕集，回收率几乎100%。超高速进样和无限接近零的交叉污染。-使用高效自动进样器迅速且有效地除去蛋白有效地保护分析柱色谱柱和LC/MS的接口经久耐用的新型柱通过采用新开发的涂覆技术和粒子径的最优化，可得到长期稳定数据。*样品处理柱的容量进样体积对色谱图的影响当进样体积加大的时候，由于样品处理柱子容量的限制会发生峰展宽的现象.100uL50uL10uL100uL50uL10uL*不同进样体积的影响小体积进样的时候，预处理柱可捕集几乎所有的药物分子大体积进样的时候，部分药物被蛋白带走，回收率降低10uLDrugProtein100uL*在线稀释泵提高回收率的原因在样品进入预处理柱之前，在线稀释泵可预先将蛋白和药物分子分离Auto-samplerPretreatmentcolumnSampleintroductionpumpAuto-samplerPretreatmentcolumnSampleintroductionpump●●90%10%FreeDrugDilutionpump*Shim-packMAYI-ODS（RAM）预处理柱采用Shim-packMAYI-ODS除蛋白蛋白质等大分子药物涂覆膜将硅胶（50m）的外表面用亲水性聚合物涂覆，只将细孔内部用十八烷基进行化学修饰。象蛋白质这样的高分子不能进入细孔内部，并被外表面的亲水性聚合物阻挡，不在固定相上保留，很快地洗脱。另一方面，诸如药物这样的通常的小分子化合物则浸透到细孔内部，被保留在内部表面的固定相上。*Co-SenseforBA的流路构成样品通过在线稀释旁通的作用，导入溶液自动稀释，被导入MAYL-ODS前处理柱。在除蛋白的同时，捕集、浓缩药物Step1.除蛋白质的捕集浓缩导入样品泵被MAYL-ODS捕集的药物，经阀切换，导入分析柱Step2.分析经浓缩的药物导入样品泵分析用高压梯度泵分析柱自动进样器前处理柱在线稀释旁通检测器●分析用高压梯度泵分析柱自动进样器前处理柱在线稀释旁通检测器●*在线自动稀释用旁通流路的效果0412168Time(min)标准溶液无旁通有旁通用蛋白结合率较高的消炎痛进行评价无稀释旁通流路：回收率约50%。有稀释旁通流路：回收率几乎100%样品：消炎痛(1mg/L)添加血浆样品导入液（稀释液）：0.1磷酸水溶液：乙腈=95：5注入量：500L稀释倍率：8倍检测：UV315nm*自动浓缩带来的高灵敏度100μL注入200μL注入500μL注入0124816Time(min)样品：消炎痛(1mg/L)添加血浆无峰形歪斜样品导入液（稀释液）：　　0.1%磷酸水溶液：乙腈混合液（95：5）检测：UV315nm实现高灵敏度实现高灵敏度的大量注入的稳定性捕集效率即使注入血浆500L，回收率也几乎达到100%。峰形状样品名：添加消炎痛的血浆*出色的柱使用寿命连续注入时的稳定性血浆基底的洗脱从稳定的MAYL-ODS洗脱蛋白质等血浆基底峰及回收率稳定的峰形状及回收率（几乎100%）08.517Time(min)08.517Time(min)第1次第300次阀切换阀切换样品　　：添加异丙基安替比林的血浆注入量　　：100μL样品导入液：0.1%磷酸水溶液乙腈混合液稀释倍数　：8倍检测　：分析，275nm；血浆基质，280nm*Co-SenseforBA-LCMS系统的特长通过在Co-SenseforBA系统上连接LCMS-2010EV，成为更强有力的生物样品分析系统　　LCMS所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力。*生物样品的药物分析除蛋白质LC作为预处理设备—萃取柱LC/MS的优越性高通量分析，高选择性，高灵敏度→高灵敏度，耐用，前处理全程自动化，成为LC/MS必备的系统。*分析条件*1:倍他乐克m/z2682:普萘洛尔m/z2603:利多卡因m/z2354:狄布卡因m/z3445:布比卡因m/z289123451mg/mLeach,5mLSIMchromatogramsofstandards*each1ug/mL,5uL重现性*标准血浆中的药物倍他乐克95.0%普萘洛尔97.4%利多卡因94.0%狄布卡因107.7%布比卡因97.1%each1ug/mL,5uL,n=5回收率*1:倍他乐克r=0.999542:普萘洛尔r=0.999583:利多卡因r=0.999814:狄布卡因r=0.999785:布比卡因r=0.999860.01–1ug/mL,10uL,n=5,plasmaspiked12345校正曲线*提取液中含乙腈对回收率的影响a.提取液:10mM乙酸铵/乙腈=95/5b.提取液:10mM醋酸铵*耐用性(Chromatogram)1strun101strun201strun301strun0.1mg/mLeach,plasmaspiked,Injectionvolume:50mL,Extractiontime:2min*Columnpressureatstarttime(MPa)NumberofInjection耐用性(柱压)PumpCforpretreatment*色谱柱:　Shim-pack　VP-ODS（2.0mmi.d.×150mmL）流动相:0.1%三氟醋酸/乙睛(8/2)流速：0.2mL/min导入液:10mM醋酸铵LCMS与UV的比较-利多卡因的分析-样品:添加利多卡因的血清（1mg/L）前处理柱：Shim-packMAYI-ODS(4.6mmID×10mmL)导入液：10mM醋酸铵注入量：10uL样品导入液流量：1mL/min稀释倍数：8倍UV230nm利多卡因利多卡因ESI(+)SIMm/z235*利多卡因的分析0123456789min500e3750e31000e31250e31500e31750e32000e32250e3Int.TIC100150200250300350m/z0e3250e3500e3750e3Int.235M+H+0.1%三氟乙酸/乙腈=8/2,ESI(+)(1mg/L)标准样品注入量：2uL导入液:10mM醋酸铵*线性关系『分析条件』：前处理柱：Shim-packMAYI-ODS(4.6mmID×10mmL)导入液：10mM醋酸铵注入量：10uL样品导入液流量：1mL/min稀释倍数：8倍样品浓度范围0.01,0.1,1.0mg/L,相关系数0.99960250500750ConcArear=0.9996(mg/L)检测：LCMS-ESI-(+)利多卡因*重现精度系统保留时间RSD面积RSDBA-LCMS0.13%2.99%通常LCMS0.18%1.16%利多卡因標準試料（1mg/L）10ml分析条件：前处理柱：Shim-packMAYI-ODS(4.6mmID×10mmL)导入液：10mM醋酸铵注入量：10uL样品导入液流量：1mL/min稀释倍数：8倍色谱柱:　Shim-pack　VP-ODS（2.0mmi.d.×150mmL）流动相:0.1%三氟醋酸/乙睛(8/2)流速：0.2mL/min导入液:10mM醋酸铵LCMS-ESI-(+)0.05.010.015.020.0min12345*Co-SenseforBA＆MAYI-ODS柱的 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 高通用性通过采用在线稀释旁通，可广泛地对应蛋白结合率高的药物有效地除去蛋白质采用新开发的涂覆技术，实现稳定有效的除蛋白经久耐用通过粒子径的最佳化，提供长期可靠的数据与LCMS连接，更强有力的生物样品分析系统诞生MS强化药物鉴定功能*生物样品自动前处理系统Co-senseforBAMAYIColumn介绍岛津企业管理(中国)有限公司　分析仪器事业部上海分析中心2011年11月23日*Co-sense和MAYIColumn相关背景Co-sense含义：CollaborationofShimadzuEisaiNewSystematicEfficiency，代表了产品理念“CollaborationofSensibility”，用户和仪器厂商合作创造价值。Eisai:日本卫材株式会社，世界知名医药集团。Co-SenseforBA系统基于Eisai公司的专利而制造的，受到专利保护。MAYI-ODS(pronouncedas“MayIODS”)：属于internalsurfacereversed-phase(ISRP)column*MAYI柱的作用1.高回收率捕集目标组分；2.有效除去蛋白质等不必要地组分；3.减少由于柱子吸附样品成分导致压力升高甚至堵塞等情况的发生。*预处理柱MAYI-ODS技术参数columnname;Shim-packMAYI-ODSpackingmaterial;silicaparticleoutersurfacemethylcelluloseinnersurfaceoctadecylsilylgroupparticlesize;50mcolumnsize;4.6mmi.d.x10mmpHrange;2-7.5maximumpressure;20MPa涂渍的甲基纤维素表面药物蛋白质ODS表面*新型前处理柱Shim-packMAYI系列Shim-packMAYI-ODS(G)Shim-packMAYI-C14(G)Shim-packMAYI-C8(G)Shim-packMAYI-C4(G)Shim-packMAYI-C1(G)Shim-packMAYI-SCX(G)(磺酸基)Shim-packMAYI-SAX(G)(三甲基铵基)*MAYIColumn固定相种类ColumnStationaryphaseRemarksShim-packMAYI-ODS(G)OctadecylgroupStrongestretentioninreversed-phasemodeShim-packMAYI-C14(G)TetradecylgroupRetentioninreversed-phasemodestrongestafterODSShim-packMAYI-C8(G)OctylgroupRetentioninreversed-phasemodestrongestafterC14Shim-packMAYI-C4(G)ButylgroupRetentioninreversed-phasemodestrongestafterC8Shim-packMAYI-C1(G)MethylgroupWeakestretentioninreversed-phasemodeShim-packMAYI-SCX(G)SulfonicacidgroupStrongly-acidiccationexchangemodeShim-packMAYI-SAX(G)TrimethylammoniumgroupStrongly-basicanion-exchangemode*MAYI系列柱规格ColumnHolder(柱套)for4.6mmi.d.x10mmcolumnfor2.0mmi.d.x5mmcolumnfor4.6mmi.d.x30mmcolumnfor2.0mmi.d.x10mmcolumnCartridge(柱芯)ODS:50um,四种规格全C1,C4,C8,C14:50um,4.6mmi.d.x10mmSCX,SAX:50um,4.6mmi.d.x10mm,4.6mmi.d.x30mm不同规格适合不同的流速和不同的化合物性质*生物样品自动前处理系统Co-senseforBA方法开发过程和注意事项岛津企业管理(中国)有限公司　分析仪器事业部上海分析中心2011年11月23日*方法开发过程系统的选择：常规系统还是半微量系统目标组分梯度洗脱方法优化MAYI柱的选择捕集时间的选择样品导入和在线稀释旁路流动相相关参数设置*使用何种系统系统种类常规系统半微量系统系统配置特点500uL混合器，常规池，4.6mm内径MAYI柱，常规分析柱100uL半微量混合器，半微量池，2.0mm内径MAYI柱，半微量分析柱适合场合普通LC配置除蛋白操作费时LC-MS分析系统优点常规系统较常见溶剂消耗量小不使用分流器进质谱，信号强度无损失*目标组分梯度洗脱方法可事先在不同的仪器上摸方法。或者参考文献的方法。可以是常规柱、半微量柱或小粒径快速柱，取决于现有的仪器配置和想达成的目标。*MAYI柱的选择根据化合物的性质选择合适的固定相C18最常用C1,C4,C8,C14适合于不同极性的化合物SAX,SCX适合于离子型的化合物根据系统的特点选择合适的内径4.6mm内径适合3mL的总流速2.0mm内径适合0.8mL的总流速*捕集时间的选择方法捕集时间通常在1-5min之间。当上样量较大的时候，捕集时间要满足一个最低值，即保证样品充分捕集到MAYI柱上，通常是至少两倍样品体积上样时间。假设500uL上样体积，0.25mL/min的样品导入泵流速，则至少2倍是1mL。方法中至少设4min，0.25*4=1mL体积。捕集时间要选择一个合适值：时间足以捕集全部目标组分且将蛋白去除干净，又不能过长导致目标组分被冲走。必须要通过实验优化选择合适值。*样品导入和在线稀释旁路流动相相关参数设置流动相种类：通常10mM乙酸铵/乙腈=95/5（v/v）稀释倍数：通常8-10倍总流速：通常2-3mL/min*生物样品自动前处理系统Co-senseforBA故障分析和排除岛津企业管理(中国)有限公司　分析仪器事业部上海分析中心2011年11月23日*仪器安装使用注意事项自动进样器出口管路应该使用0.3mmid，600mm长不锈钢管。自动进样器出口使用同样内径的不锈钢管。新安装仪器或者长期未用之仪器使用之前应在不接柱子的情况下，对所有流路在1.0mL/min流速下先用水冲洗20分钟，再用异丙醇冲洗20分钟，最后再用水冲洗10分钟。样品用0.45um以下滤膜过滤后进样。仪器用完后如较长时间不用应用水将缓冲液冲干净，然后用甲醇或者乙腈冲洗管路后保存。*Co-sense系统常见故障现象灵敏度不高MAYI柱寿命短有背景干扰压力高或者系统堵塞*灵敏度不高原因及解决办法背景信号高：冲洗整个系统，换高品质的流动相回收率低：优化捕集时间、上样流动相、稀释倍数等化合物本身性质限制：提高上样体积，重新优化捕集时间检测器不适合：换高灵敏的检测器如荧光或MS等*MAYI柱寿命短原因及解决办法样品没有过滤：使用0.45um以下滤膜过滤捕集时间过短导致蛋白没有除干净：优化捕集时间*有背景干扰原因及解决办法管路污染：彻底清洗流路流动相中有不纯物：换高品质流动相干扰峰存在于样品中：优化梯度方法*压力高或者系统堵塞原因及解决办法管路堵塞：卸下柱子，用二通代替，逐段排除柱子堵塞：清洗或更换色谱柱深层次的原因：缓冲盐析出、样品没有过滤、蛋白质没有去除干净*Thankyouforyourattention!*