Neo-Sensitab纸片扩散法与NCCL SM27-A微量稀释法测定97株酵母对抗真菌药物敏感性的比较-药学论文

Neo-Sensitab纸片扩散法与NCCL SM27-A微量稀释法测定97株酵母对抗真菌药物敏感性的比较-药学论文 作者:朱浩翔张永信章强强龙丰 【摘要】目的比较Neo-Sensitab纸片扩散法和NCCLS微量稀释法的 一致性，评价该商品化 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的稳定性。方法同时采用NCCLSM27-A 微量稀释法和Neo-Sensitab纸片扩散法测定临床分离的97株酵母对 两性霉素B(AMB)、氟康唑(FCZ)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、酮康唑(KCZ) 和伊曲康唑(ITC)等五种常用抗真菌药物的敏感性。结果两种方法的 药敏结果一致率分别为AMB100%，FCZ94.8%，5-FC93.8%， KCZ75.3%和ITC84.5%。结论纸片扩散法和微量稀释法药敏测试结果 一致率较高，以FCZ、AMB和5-FC最佳，该方法检测敏感株的准 确率较高，而在区分耐药株和中介株方面有所不足。 【关键词】酵母;抗真菌药物;敏感性;NCCLSM27-A微量稀释法; Neo-Sensitab纸片扩散法 ABSTRACTObjectiveTocomparetheconcordancebetweenNeo-SensitabdiskdiffusionmethodandtheStandardNCCLSM27-Amicrodilutionmethodforsusceptibilitytestingof97yeastisolates,andevaluatethereliabilityofthiscommercialmethod.MethodsTheMICsorinhibitionzonediametersoftheclinicalisolatestofiveantifungalagentsweretestedbythetwomethods.ResultsTheagreementratesofthetwomethodsforAmB,FCZ,5-FC,KCZandITCwere100%,94.8%,93.8%,75.3%and84.5%respectively.ConclusionThetwomethodsforsusceptibilitytestingoftheclinicalisolateshadexcellentagreement,especiallybestfittedtoAmB,FCZand5-FC.TheaccordancebetweenNeo-Sensitabdiskdiffusionmethodandmicrodilutionmethodwashighlycomparable,butthatwasn otconvenienttobeappliedinthedecisionofresistantstrains. KEYWORDSYeast;Antifungalagents;Susceptibility;NCCLSM27-Amicro dilutionmethod;Neo-Sensitabdiskdiffusionmethod 近年来，随着人口老龄化的日益加剧，肿瘤、AIDS等免疫缺陷患者不断增多，骨髓、器官移植的广泛开展，广谱抗生素、胃肠外营养以及辅助通气等常规应用于危重病人，皮质激素、免疫抑制剂和化疗药物大量使用，深部真菌感染的发生率逐年上升。氟康唑作为深部真菌感染的首选用药被广泛应用之后耐药念珠菌比例明显上升,1,，因此能辅助预测疗效的抗真菌药物体外敏感性试验日益受到重视，但对各种药敏试验的确切评价至今仍是亟待解决的问题。美国国家临床实验室 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化委员会(NCCLS)M27-A方案,2,具有较好的稳定性和重复性，但其操作繁琐、费时，成本高，很难应用于临床和流行病学调查。Neo-Sensitab酵母纸片扩散法因其操作简便，成本较低，抗真菌药物种类多，操作方便在国内应用得较多，但仍需评价其准确性和稳定性。本文使用M27-A方案和纸片扩散法同时检测临床分离的酵母对五种常用抗真菌药物的敏感性，比较其一致性，以科学评价纸片扩散法的准确性。 1材料与方法 1.1菌株 受试菌株共计97株，包括华山医院真菌室2004年10月,12月和上海市传染病医院2004年7月,11月临床分离的酵母，所有菌株均经CHROMagar科玛嘉显色培养基显色、芽管试验以及API-20CAUX鉴 定菌种。质控菌株包括ATCC22019(近平滑念珠菌)、ATCC6258(克柔念珠菌)、ATCC64548(白念珠菌)和ATCC64550(白念珠菌)。 1.2药物 两性霉素B(AMB)由上海新先锋药业公司提供，批号AI040601，纯度97.6%;5-氟胞嘧啶(5-FC)由南通制药总厂提供，批号2004002，纯度99.06%;氟康唑(FCZ)由美国Pfizer公司提供，批号43692111，纯度?99.5%;伊曲康唑(ITC)由美国Johnson&Johnson公司提供，批号ZR051211PUC921，纯度99.2%;酮康唑(KCZ)由中国药品生物制品检定所提供，批号0294-9801，纯度99.0%。 1.3纸片 纸片为丹麦Rosco公司生产，由广州乐通泰生物科技有限公司提供，AMB浓度10μg/片，5-FC浓度1μg/片，FCZ浓度15μg/片，ITC浓度8μg/片，KCZ浓度15μg/片，纸片直径9.2mm。 1.4微量稀释法 按NCCLS推荐的M27A方案,2,，抗真菌药物加入96孔微量板作倍比稀释，使各药物的终浓度分别为AMB和ITC(16,0.0313)μg/ml，FCZ和5-FC(64,0.125)μg/ml，KCZ(32,0.0625μg/ml)，加入菌液(终浓度0.5,2.5×103CFU/ml)，置35?温箱中培养46,50h。 1.5纸片扩散法 改良Shadomy琼脂加热溶解后倒入无菌平皿，35?干燥20,30min后，倾注1.0ml菌悬液(浓度0.5,2.5×106CFU/ml)于平皿表面，均匀涂布，吸除多余菌液，35?干燥15min后贴上药物纸片，置35?温 箱中18,24h后观察结果，如果未见明显生长则再孵育24h。 1.6结果判定 (1)微量稀释法,2,对AMB而言，MIC值判定为生长完全抑制时的最低药物浓度，FCZ、KCZ、ITC、5-FC终点不明确，MIC值判定为生长50%抑制时的最低药物浓度(Tab.1)。 (2)Neo-sensitab纸片扩散法标准由丹麦Rosco公司提供，结果见Tab.2。 1.7结果 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 比较两种药敏方法检测白念珠菌和非白念珠菌对各种药物的敏感性及两者的一致率，配对χ2检验是否有统计学意义(统计由SPSS11.0软件完成)。两者比较时,3,，重大错误(majorerrors)指NCCLS显示敏感而纸片法显示耐药，非常重大错误(verymajorerrors)指NCCLS显示耐药而纸片法显示敏感，微小错误(minorerrors)则指中介或剂量依赖性敏感(S-DD)和敏感或耐药之间的差异。 2结果 2.1两种方法检测药物敏感性 (1)白念珠菌共70株，检测结果见Tab.3。 (2)非白念珠菌共27株，检测结果见Tab.4。 2.2微量稀释法和纸片扩散法不同药物及菌种一致性的比较 (1)两性霉素B两种方法均显示所有菌株对两性霉素B敏感，两者一致率100%。 (2)氟康唑 白念珠菌纸片扩散法将一株MIC为16μg/ml的菌株判读为敏感，两 者的一致率为98.6%(69/70)。经χ2检验，P值0.317，两者无明显差别。微小错误发生率为1.4%(1/70)。 非白念珠菌纸片扩散法将1株MIC值为16μg/ml的菌株判读为耐药，3株MIC值为8μg/ml的菌株判读为中介，两者的一致率85.2%(23/27)，经χ2检验，P值0.135，两者无明显差别，微小错误发生率为14.8%(4/27)。 总之，纸片扩散法和NCCLS在测定酵母对氟康唑的敏感性时的一致率为94.8%(92/97)，微小错误的发生率5.2%(5/97)。 (3)5-氟胞嘧啶 白念珠菌纸片扩散法将一株MIC值8μg/ml的菌株判读为敏感，一株MIC值8μg/ml的菌株判读为耐药，两者的一致率97.1%(68/70)，微小错误发生率为2.9%(2/70)。 非白念珠菌纸片扩散法将一株MIC值8μg/ml菌株判读为耐药，两株MIC值分别为4和0.5μg/ml的菌株判读为中介，一株MIC值32μg/ml的菌株判读为中介，两者的一致率85.2%(23/27)，经χ2检验，P值0.368，两者无明显差别，微小错误发生率为14.8%(4/27)。 纸片扩散法和NCCLS微量稀释法测定酵母对5-氟胞嘧啶敏感性时的一致率为93.8%(91/97)，微小错误的发生率6.2%(6/97)。 (4)酮康唑 白念珠菌纸片扩散法将1株MIC值4μg/ml的菌株判读为敏感，2株MIC值4μg/ml的菌株判读为中介，6株MIC值1和7株MIC值2μg/ml的菌株判读为敏感，两者的一致率77.1%(54/70)，经χ2检验， P值0.001，两者有明显差别，微小错误发生率为21.4%(15/70)，非常重大错误发生率为1.4%(1/70)。 非白念珠菌纸片扩散法将3株MIC值1μg/ml和1株MIC值2μg/ml的菌株判读为敏感，2株MIC值4μg/ml和2株MIC值8μg/ml的菌株判读为中介，两者的一致率70.4%(19/27)，经χ2检验，P值0.018，两者有明显差别，微小错误发生率为29.6%(8/27)。 纸片扩散法和微量稀释法测定酵母对酮康唑敏感性时的一致率为75.3%(73/97)，微小错误发生率为23.7%(23/97)，非常重大错误发生率为1.0%(1/97)。 (5)伊曲康唑 白念珠菌纸片扩散法将2株MIC值分别为1和2μg/ml的菌株判读为中介，7株MIC值为0.25μg/ml和2株MIC值0.5μg/ml的菌株判读为敏感，两者的一致率84.3%(59/70)，经χ2检验，P值0.004，两者有明显差别，微小错误发生率为15.7%(11/70)。 非白念珠菌纸片扩散法将1株MIC值1μg/ml、2株MIC值0.25μg/ml和1株MIC值0.5μg/ml的菌株均判读为敏感，两者的一致率85.2%(23/27)，经χ2检验，P值0.135，两者无明显差别，微小错误发生率为3/27=11.1%，非常重大错误发生率为3.7%(1/27)。 纸片扩散法和NCCLS微量稀释法测定酵母对伊曲康唑敏感性时的一致率为84.5%(82/97)，微小错误发生率为14.4%(14/97)，非常重大错误发生率1.0%(1/97)。 3讨论 本研究以微量稀释法测定97株念珠菌对五种抗真菌药物的敏感率分别为:AMB100%，FCZ83.5%，KCZ68.0%，ITC75.2%，5-FC94.8%，可见念珠菌对AMB和5-FC最敏感，对唑类药物尤其是KCZ的耐药性较高，三种药物之间存在交叉耐药，如对一种药物耐药时对另两种药物的MIC值也较高。非白念珠菌对各种药物的敏感性明显低于白念珠菌，其中热带念珠菌对FCZ的耐药率达33.3%，敏感株的MIC值也处于高限。本研究中念珠菌对FCZ的敏感率与黄文祥等,4,报道85.5%的敏感率结果相近，耐药菌株比例远低于国外报道的55.2%,5,。此次由华山医院皮肤科真菌室分离的42株白念珠菌中有5株对FCZ耐药，耐药率11.9%;而本院真菌室1999年和2001年临床分离的白念珠菌对FCZ的耐药率分别为4.36%,6,和9.37%,7,，可见临床分离的白念珠菌耐药率呈上升的趋势。 由于唑类药物低浓度时仅有抑制作用，只有高浓度时才有杀菌作用的特性，本试验在NCCLSM27-A微量稀释法终点判定时同样出现了“拖尾现象”，因此其结果可能会存在一个倍比浓度的上、下误差;若要精确测定MIC，最好以血液计数板计数50%抑制时的浓度，但该操作非常繁琐，难以作为常规推广。本研究中虽然所有菌株对AMB均敏感，但97株中有54株的MIC值在0.5,1μg/ml之间，其MIC范围很窄。有许多报道指出以RPMI1640为培养基的M27-A方案测定AMB的MIC时不够敏感,8,，难以区分敏感株和耐药株，因此有学者提出以抗生素培养基3(AM3)代替RPMI1640培养基可以提高AMB耐药菌株的检出率。本研究中念珠菌对ITC的敏感率仅75.2%，国内 其他医院的资料也有类似现象,4,，与临床ITC治疗念珠菌感染的良好疗效似有矛盾，可能与M27-A方案主要根据口腔和黏膜念珠菌感染而制定判定标准有关。 M27-A方案虽然准确性和重复性较好，但由于其操作费时、繁琐，且成本很高，很难在临床广泛推广。瑞典ABBiodisk公司的Etest法与NCCLS的一致性好，且操作简便，但成本很高，限制了其临床应用。纸片扩散法因其成本低、操作简单更易接受,9,。丹麦Rosco公司的Neo-Sensitab纸片扩散法目前在国内应用得较为广泛，但其准确性和稳定性仍未得到证实。本研究比较了该纸片扩散法和NCCLSM27-A方案测定念珠菌对五种常见抗真菌药物敏感性的一致性，结果显示五种药物的一致率分别为AMB100%，FCZ94.8%，5-FC93.8%，KCZ75.3%，ITC84.5%。可见两者对AMB、FCZ和5-FC的一致率较高，KCZ和ITC一致率相对较低。两者不一致以微小错误最常见，即中介和敏感或耐药之间的误差，且多数为MIC处于临界值的菌株。仅有两株菌株出现了非常重大错误，将耐药菌株判定为敏感。该结果与Sandven,10,比较两种方法测定1704株念珠菌对FCZ敏感性的结果类似。国内金兰等,11,则得出该方案与NCCLSM27-A在测定念珠菌对FCZ敏感性时的一致率为90.8%，与本研究相仿。徐红等得出两者测定念珠菌对KCZ的敏感性时95.24%,12,的一致率明显高于本实验的结果。因此该纸片扩散法检测敏感株的准确率较高，但在区分耐药株和中介菌株方面有所不足，当纸片扩散法显示中介或耐药时应测定MIC值以确定其耐药性。鉴于该纸 片扩散法低廉的成本和简便的操作方法，该方法用于临床敏感性监测 还是有广阔的前景。 【参考文献】 ,1, KullbergBJ,OudeLashofAM.Epidemiologyofopportunisticinvasivemycoses,J,.EurJMedRes,2002,7(5):183 ,2, Nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards.Referencemethedforbrothdilutionantifungalsusceptibilitytestingofyeasts:approvedstandardM27-A,S,.NCCLS,1997,17(9):1 ,3, Nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards.Developmentofinvitrosusceptibilitytestingcriteriaandqualitycontrolparameters:tentativeguidelineM23-T3,S,.NCCLS,1998 ,4, HuangWX,WangQN,DuYP,etal.InvitrosusceptibilityofCandidaspp.tonormalantifungaldrugs,J,.ChinHospPharmJ(中国医院药学杂 志),2003,23(6):376 ,5, MooreCB,OakleyKL,DenningDW.Invitroactivityofanewechinocandin,LY303366,andcomparisonwithfluconazole,flucytosineandamphotericinBagainstCandidaspecies,J,.ClinMicrobiolInfect,2001,7(1):11 ,6, SuYD,WangSZ,WengXH,etal.InvitrosusceptibilityofCryptococcusneoformansandCandidaspeciestofiveantifungaldrugs,J,.ChinJInfectDis(中华 传染病杂志),2000,18(4):239 ,7, LongF,ZhangYX,LiM,etal.Invitrosusceptibilityof248isolatesofCandidasp.andCryptococcusneoformanstofourantifungalagents,J,.ChinJAntibiot(中 国抗生素杂志),2002,27(5):65 ,8, RexJH,CooperCRJr,MerzWG,etal.DetectionofamphotericinB-resistantCandidaisolatesinabroth-basedsystem ,J,.AntimicrobAgentsChemother,1995,39(4):906 ,9, ColomboAL,BarchiesiF,McgoughDA,etal.ComparisonofEtestandnational committeeforclinicallaboratorystandardsbrothmacrodilutionmethodforazoleantifungalsusceptibilitytesting,J,.JClinMicrobiol,1995,33(3):535 ,10, SandvenP.Detectionoffluconazole-resistantCandidastrainsbyadiscdiffusionscreeningtest,J,.JClinMicrobiol,1999,37(12):3856 ,11, JinL,JiangXL,ZhangR.Theevaluationofroscodiskdiffusiononfluconazolesusceptibilitytestofyeast-likefungi,J,.ClinJLabMed(中华检验医学杂 志),2004,27(1):46 ,12, XuH,ChenYC,WenH,etal.Comparativeevaluationofdiscdiffusionmethodfortestingthesusceptibilityofyeaststoketoconazolewithbrothmicrodilutionmethod,J,.LabMed(检验医学),2004,19(5):385