凝胶柱

凝胶层析定义凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。凝胶层析原理凝胶层析的概念及其原理单个凝胶珠本身象个"筛子"。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长!凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。凝胶层析分类葡聚糖凝胶是指由天然高分子-葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由PharmaciaBiotech生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3-氯T,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由2环氧丙烷的百分比控制。Sephadex的主要型号是G-10~G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是mL/g干胶）乘以10。如SephadexG-50, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示吸水率是5mL/g干胶。Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的G-200为8X10。Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex稳定工作的pH—般为为2~10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100°C下40min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex有各种颗粒大小(一般有粗、中、细、超细)可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差;细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。另外，SephadexG-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为SephadexLH-20和LH-60,适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺(N，N'-methylenebisacrylamide)交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108,远远大于Sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。Sephacryl与Sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl稳定工作的pH一般为3~11。另外Sephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显着差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50,对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用SephadexG-10，GT5及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D—般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。凝胶柱的使用(Superdex10/300GL)第一次使用或长时间保存后重新使用确保层析柱顶端接口充满溶液。1.2确保连接层析柱的管线充满溶液，并以低流速(0.5ml/min)连接层析柱。1.3至少5倍柱体积去离子水平衡层析柱(0.5ml/min),至少5倍柱体积洗脱液平衡层析柱。1.4优先尝试的层析条件洗脱液：50mM磷酸盐缓冲液,0.15MNaCl,pH7.0流速：0.5~0.75ml/min上样体积：25ul（0.22um滤膜过滤或lOOOOg离心lOmin,浓度〈10mg/ml）确保层析柱承受压力不要超过其耐受最大压力。1.5经过层析柱的所有溶液需要进行脱气并用O.22um滤膜过滤。层析条件优化降低流速,提高高分子量蛋白分辨率,降低低分子量蛋白分辨率。减少上样体积,提高分辨率。改变有机溶剂浓度,改变选择性。2.4两根层析柱串联，提高分辨率，控制Superdex7510/300柱压小于3MPa,Superdex20010/300柱压小于2.5MPa。层析柱清洗建议在层析柱清洗时采用反向流速。用25ml0.5MNaOH或者0.5M乙酸清洗层析柱（0.5ml/min）。立即用2~5倍柱体积去离子水冲洗层析柱，接着用至少5倍柱体积洗脱液清洗（0.5ml/min）。常见问题处理层析柱反压升高或柱效下降。a确保压力的升高是由层析柱引起的：检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。b按照3的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 清洗层析柱。c上样1倍柱体积lmg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠），室温过夜或37度1h，再按照3的方案清洗层析柱。层析柱进气泡用80~100ml进行很好脱气的去离子水平衡层析柱（0.5ml/ml），气泡会被逐渐带出层析柱；很少量的气泡不会影响层析柱柱效（柱管内壁涂抹了一层塑料薄膜，小量气泡可能被吸附而不影响层析柱填料，而粗糙的表面不会影响层析柱柱效）。层析柱漏液a确保是层析柱本身漏液。b更换密封圈。层析柱溶液兼容性5.1水相缓冲液pH3-125.2耐受8M尿素，6M盐酸胍离子型和非离子型去污剂，30%乙腈，10%三氟乙酸，70%乙酸层析柱超过两天不用或长时间保存用2个柱体积脱气去离子水平衡，再用2个柱体积脱气20%乙醇平衡。凝胶柱的使用（HiPrepSephacryl）第一次使用或长时间保存后重新使用1.1连接层析柱1.2连接层析柱之前先打开系统泵排除管线及阀门里的气泡1.3停泵，垂直放置层析柱，移去层析柱入口处的堵头，将层析柱入口管线和层析系统连接。1.4小心移去层析柱出口堵头，将其与层析系统相连接。1.5平衡层析柱1.6设置合适的报警压1.71.5柱体积去离子水平衡（15cm/h）1.82柱体积洗脱缓冲液平衡（30cm/h）1.9优先尝试的层析条件洗脱液：50mM磷酸盐缓冲液，0.15MNaCl,pH7.2流速：15cm/h上样体积：柱体积的0.5%~4%（0.22um滤膜过滤或10000g离心10min）确保层析柱承受压力不要超过其耐受最大压力经过层析柱的所有溶液需要进行脱气并用0.22um滤膜过滤。2.如何测定柱后压和设置报警压2.1用一根peek管代替层析柱连接于AKTA系统相应位置。17.2.2使用层析时相同的缓冲液和流速运行系统， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 压力检测值为总压力。18.2.3断开peek管连接，运行，记录压力值为柱前压。19.2.4总压力减去柱前压为柱后压力。20.2.5如果柱后压力超过0.35MPa，采取 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 降低柱后压（缩短管线、清洗可能被堵塞的管道、更换限流阀），运行直至柱后压小于0.35MPa。2.6将柱后压加0.15MPa作为系统报警压上限进行设置。3.层析条件优化3.1降低流速，提高分辨率。3.2减少上样体积，提高分辨率。4.层析柱清洗26.4.1建议在层析柱清洗时采用反向流速（15cm/h,室温）。4.2用1.5倍柱体积的0.2MNaOH清洗层析柱，接着用2倍柱体积缓冲液平衡层析柱。4.3如果缓冲液中含有去污剂需要用更多的溶液平衡直至UV基线稳定。更剧烈的清洗30.4.4用0.5倍柱体积O.5MNaOH清洗（除去疏水性蛋白和脂蛋白），紧接着用4倍柱体积去离子水清洗层析柱。31.4.5用1.5倍柱体积30%异丙醇清洗（除去脂类和非常疏水的蛋白），紧接着用4倍柱体积去离子水清洗层析柱。5・常见问题处理5.1层析柱反压升高或柱效下降。a?确保压力的升高是由层析柱引起的：检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。b?按照5的方案清洗层析柱。c?上样1倍柱体积1mg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠，降解沉淀在层析柱上的蛋白），室温过夜，再用1.5倍柱体积0.2MNaOH清洗，再用4倍柱体积去离子水清洗。d?HiPrep层析柱不能打开或重新装填。5.2层析柱进气泡用大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱（30cm/h），气泡会被逐渐带出层析柱。5.3层析柱干裂或层析柱破损漏液：建议购买新的层析柱。41.6.层析柱溶液兼容性42.6.1使用脱气并用0.22um过滤溶液可以增加层析柱寿命。30%乙腈，0.5MNaOH，24%乙醇，1M乙酸，30%异丙醇。6.3水相缓冲液pH3-11。6.46M盐酸胍，8M尿素。7.层析柱超过两天不用或长时间保存用4个柱体积脱气去离子水平衡，再用4个柱体积脱气20%乙醇平衡层析柱，并连接堵头密封。48.凝胶层析的应用⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。