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食品发酵技术实验指导

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食品发酵技术实验指导食品发酵技术实验指导 [键入文字] 食品发酵技术实验指导 (第一版) 闽北职业技术学院 1 实验规则 1、实验前必须预习实验指导书。若经提问发现没有预习者,须在教师指定的时 间内预习完毕,方得参加实验。 2、实验前须认真检查仪器、试剂、用具及实验材料。如有破损、短缺应立即报 告指导教师,经同意后方可调换和补充。对玻璃器皿须做好清洗工作。 3、实验过程中不得随便挪动外组的仪器、用具和实验材料。不得随意拨动仪器 开关或电源开关,须按实验要求进行。 4、实验材料、药品的使用,应在不影响实验结果的前提下注意节...

食品发酵技术实验指导
食品发酵技术实验指导 [键入文字] 食品发酵技术实验指导 (第一版) 闽北职业技术学院 1 实验规则 1、实验前必须预习实验指导书。若经提问发现没有预习者,须在教师指定的时 间内预习完毕,方得参加实验。 2、实验前须认真检查仪器、试剂、用具及实验材料。如有破损、短缺应立即报 告指导教师,经同意后方可调换和补充。对玻璃器皿须做好清洗工作。 3、实验过程中不得随便挪动外组的仪器、用具和实验材料。不得随意拨动仪器 开关或电源开关,须按实验要求进行。 4、实验材料、药品的使用,应在不影响实验结果的前提下注意节约,杜绝浪 费。 5、实验室应保持肃静,不得谈笑喧哗,不许搞其他动作,以免影响他人实验。 6、清洗仪器、用具、材料时,须将固形物倒入指定容器内,不得直接倒入水 槽,以免造成水管堵塞。 7、实验过程中,须按操作规程仔细操作,注意观察试验结果,应及时 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 。不 得抄写他人的实验实习记录,否则,须重做。如有疑问,应向指导教师询问 清楚后方可进行。 8、实验完毕后,须将玻璃仪器、用具等清洗干净,按原来的位置摆设放置。如 有破损须报告指导教师,并填写仪器损坏登记簿。 9、在进行实验过程中,不得随意食用原料和加工品。 10、实验结束后,由值日生负责打扫实验室,保持室内整洁,注意关上水、电、 窗、门。 2 目 录 实验一 从土壤中分离、纯化筛选产酶菌株 实验二 诱变育种 实验三 菌种保藏技术 实验四 液体发酵培养基的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 实验五 生产菌株发酵条件的优化 实验六 生长曲线和产物形成曲线的测定 实验七 酸乳的制作 实验八 甜酒酿的制作 实验九 葡萄酒的制作 实验十 酒精发酵及下游处理 实验十一 白酒的勾兑与品评 实验十二 综合实训—啤酒生产实训 3 实验一 从土壤中分离、纯化筛选产酶菌株 一、实验目的 1(根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产,建立不同的筛选模型,并从特定的 样品如土壤中筛选出高产菌株。 2(加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识;学会常规选种和育种的方法,树立 科学认真仔细的态度,培养科研协作精神。 二、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法是常用的方法,该方法操作简便,普遍用于微生物的分离与纯化。 其基本原理包括两方面: (1) 选择适合于待分离微生物的生长条件,如营养、酸碱度、温度和氧等条件,或 加入某种底物、抑制剂造成只利于该微生物生长,而抑制其他微生物生长的环境,从而 淘汰一些不需要的微生物。 (2) 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合 体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养,获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平 板或平板划线等技术完成。从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保 证是纯培养。因此,纯培养的确定除观察其菌落特征外,还要结合显微镜检测个体形态 特征后才能确定,有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定 方能得到。 土壤是微生物生活的大本营,它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。 因此土壤是微生物多样性的重要场所,是发掘微生物资源的重要基地,可以从中分离、 纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用酪素培养基从土壤中分离产蛋白酶的微 生物。 三、实验材料 1. 土样 2. 酪素琼脂培养基:NaHPO.7HO 1.07g, KHPO0.36g,干酪素 4g,琼脂 20g, 24224 1%酪素水解液 0.3mL,水 1000mL。 3. 溶液或试剂 盛 9mL 无菌水的试管,盛 90mL 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶 4 4. 仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒,无菌吸管(或移液枪),接种环,无菌培养皿 , 显微镜,血球计数板等。 四、实验步骤 1. 稀释涂布平板法 倒平板将酪素琼脂培养基加热溶化,待冷至 55-60?时,倒平板。 2.制备土壤稀释液 称取土样lOg, 放入盛 90mL 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶 中,振摇约 20min,使土样与水充分混合,将细胞分散。用一支 1mL 无菌吸管从中吸取 lmL 土壤悬液加入盛有 9mL无菌水的大试管中充分混匀,然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入另一盛有 9mL 无菌水的试管中,混合均匀,以此类推制成 -1 -2 -3 -4 -5 -6 10、 10、 10、l0、 10、 10不同稀释度的土壤溶液。 3.涂布 -4 -5 -6 将倒好培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 10、 10和 10三种 -4 -5 -6 稀释度,然后用无菌吸管分别由 10、 10和 10三管土壤稀释液中各吸取 号放入已写好稀释度的平板中, 用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻0.lmL 对 地涂布均匀,室温下 静置5-10min, 使菌液吸附进培养基。 平板涂布方法:将 0.lmL 菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置 (0.1mL 的菌 液要全部滴在培养基上,若吸移管尖端有剩余的菌悬液,可将吸移管在培养基表面上轻 轻地按一下便可)。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻 轻地来回推动,使之分布均匀, 然后改变方向沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处可 改变方向用涂棒再涂布几次。 4.将酪素琼脂平板倒置,于 28?下培养,直至长出菌落。 5.挑取菌落周围出现透明圈的单菌落,采用平板划线法纯化,并将纯化的菌株接种 于斜面保存。 6.纯化的菌株分别接种到酪素琼脂上,根据菌落周围出现透明圈大小筛选出产酶能 力强的菌株。 五、思考题 1. 你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落?如何确定平板上某单个菌落是否 为纯培养? 2.如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产淀粉酶的菌株,你将如 5 何完成? 请写出简明的实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 (提示:产淀粉酶菌株在淀粉培养基上可降解淀粉,产淀粉酶菌株 菌落周围淀粉被降解,遇碘不再变蓝故形成透明圈)。淀粉培养基:蛋白胨10g,NaCl 5g, 牛肉膏5g,可溶性淀粉2g,蒸馏水1L,琼脂15-20g,121?灭菌20mim。 6 实验二 诱变育种 一、 实验目的 通过实验,观察紫外线、硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应,并学习理 化诱变育种的方法。 二、 基本原理 许多物理因素(如紫外线、X射线,Y射线等)和化学因素(如硫酸二乙酯、氮芥、亚硝酸、乙烯亚胺、亚硝基胍等)对微生物都有诱变作用。能够引起诱变作用的这些理化因素 称为诱变剂。诱变剂的作用是使菌体内遗传物质,主要是DNA的分子结构发生改变,从而 引起菌体遗传性变异。 本实验以紫外线和硫酸二乙酯单因子作为诱变剂分别处理产生淀粉酶的枯草芽孢杆 菌BF7658为例,根据枯草芽孢杆菌BF7658诱变后在淀粉培养基上透明圈直径的大小,来 指示诱变效应。一般透明圈越大,淀粉酶活性越强。 三、 实验材料 1.菌种 草芽孢杆菌BF7658。 枯 2.试剂 淀粉培养基,0.1mol/L pH7.0的磷酸缓冲液,硫酸二乙酯(简写DES),碘液,菌生理盐水。 3.仪器 1mL吸管,盛4.5mL无菌水的试管,玻璃刮棒,血球计数板,显微镜,紫外 线灯(15w),电磁搅拌器,离心机,盛玻璃珠的三角烧瓶等。 四、 实验步骤 1. 紫外线对枯草芽孢杆菌BF 7658的诱变效应 (1)菌悬液的制备 a(取培养48小时的枯草芽孢杆菌BF 7658的斜面4—5支,用无菌生理盐水将菌苔洗 下,并倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中,振荡30分钟,以打碎菌块 b(将上述菌液离心(3000 r,min,离心15分钟),弃去上清液,将菌体用无菌生理 盐水洗涤2,3次,最后制成菌悬液。 8c(用显微镜直接计数法计数,调整细胞浓度为每毫升10个。 (2)平板制作 将淀粉琼脂培养基溶化后,冷至45?左右时倒平板27套, 7 用。 凝固后待 (3)紫外线处理 a(将紫外线灯开关打开预热约20分钟。 b(取直径6cm无菌平皿2套,分别加入上述菌悬液5mL,并放入无菌搅拌棒于平皿中。 c(将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上,在距离为30 cm、功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟、3分钟及5分钟。 -(4)稀释 在红光灯下,将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成101-6—10(具体可按估计的存活率进行稀释)。 -3-4-5(5)涂平板 取10、10、10三个稀释度涂平板。 每个稀释度涂平板3只,每只平 板加稀释菌液0.1mL,用无菌玻璃棒涂匀。以同样操作,取未经紫外线处理的菌稀释液涂 平板作对照。 (6)培养 将上述涂匀的平板,用黑布(或黑纸)包好,置37?培养48小时。注意每个 平皿背面要标明处理时间和稀释度。 (7)计数 将培养48小时后的平板取出进行细菌计数,根据对照平板上菌落计算出每 毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 (8)观察诱变效应 平板菌落计数后,分别向菌落数在5—6个左右的平板加碘液数 滴,在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径,并计算其比值(HC值)。 与对照平板进行比较,根据结果,说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜 面上培养。此斜面可作复筛用。 2. 硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌BF 7658的诱变应 (1)菌悬液制备 a(将枯草芽孢杆菌BF 7658接一环到装有30mL淀粉培养液中,置37?振荡培养14 小时左右(对数生长期)。 8 b(取上述培养物10 mL进行离心(3000r,min离心15分钟),弃去上清液,将沉淀下来的菌体再用0.1mol,L pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤2—3次,最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。 8c(用显微镜直接计数法,调节细菌数每毫升约为10个。 (2)平板制作 将含淀粉的培养基溶化,冷至45?左右倾注平板,待凝,共2套 (3)硫酸二乙酯诱变处理 取细胞数每毫升为108个的菌液4mL加入16mL磷酸缓冲液中,再加入硫酸二乙酯0.2mL,分别振荡处理30分钟及60分钟。 中止反应 (4) 将已处理的菌液,加入0.5mL 25,的硫代硫酸钠溶液中止反应。 (5)稀释 ,6中止反应后的菌液以10倍稀释法作一系列稀释至10 (6)涂平板 ,4,5 ,6分别以无菌操作取10、10、10各0.1mL放入已倒好培养基的平板 中,每个稀释度重复3个平板,共18个平皿,用无菌玻棒涂匀(注意:以上操作时,因硫 酸二乙酯有毒,不能用嘴吸或接触皮肤)。 以同样操作取未经硫酸二乙酯处理的菌液稀 释涂平板作对照。 (7)培养 将上述平板倒置于37?温箱中培养48小时。 (8)计数 将培养48小时后的平板取出进行细胞计数,并计出诱变处理30分钟和60 分钟后的存活率和致死率。 (9)观察诱变效应 将细胞计数后的平板,分别向菌落数约在5—6个的平板内加碘液 数滴,菌落周围将出现透明圈,分别量其透明圈的直径和菌落的直径,并计算其比值(HC 比值),与对照进行比较,说明诱变效应。将HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养,此 斜面可作复筛用。 五、 注意事项 9 1.照射计时从开盖起,加盖止。先开磁力搅拌器开关,再开盖照射,使菌悬液中的 细胞接受照射均匀;操作者应戴上玻璃眼镜,以保护眼睛。 2.从紫外照射开始,直到涂布完平板的几个操作步骤都须在红光灯下进行。 3. 硫酸二乙酯有毒,操作应注意安全。 六、 作业和思考题 1.将每皿平均菌落数填入下表 处理时 稀释倍数 存活率 致死率 间 -4 -5 -6 诱变剂 min % % 101010 对照 1 3 紫外线 5 对照 硫酸二 30 60 乙酯 结透明圈和菌落直径大小(mm)及 HC 其比值 123456果 透 透 透 透 透 透 菌 菌 菌 菌 菌 菌 明 明 明 明 明 明 HC HC HC HC HC HC 落 落 落 落 落 落 圈 圈 圈 圈 圈 圈 处 理 2.用于诱变的菌悬液(或孢子悬液)为什么要充分振荡? 3.用化学诱变剂处理细菌,为什么要用缓冲液来制备菌悬液, 10 实验三 菌种保藏技术 一切从生产实践或科学研究所获得具有优良性状的菌种,其中包括从自然界直接分 离到的野生型菌株,以及经人工方法选育出来的优良变异菌株或基因工程菌株等都是国 家的重要资源。因此,菌种保藏是一切微生物工作的基础,菌种保藏的目的是使菌种被 保藏后不死亡、不变异、不被杂菌污染,并保持其优良性状,以利于生产和科研的应用。 为了达到长期保持菌种优良特性,核心问题是必须降低菌种变异率,而菌种的变异 主要发生于微生物旺盛生长繁殖过程。因此,必须创造一种环境,使微生物处于新陈代 谢水平最低、生长繁殖不活跃的状态。目前菌种保藏方法很多,但主要是根据以下原则 而设计的:(1)必须选用典型优良纯培养物进行保藏,并尽量采用其休眠体,如细菌的芽 孢,真菌的孢子等进行保藏;(2)创造有利于微生物休眠的环境条件,如低温、干燥、缺 氧、缺乏营养以及添加保护剂等;(3)尽量减少传代次数。 本实验主要介绍几种常用简易菌种保藏法,如常规转接斜面低温保藏法、液体石蜡 保藏法、半固体穿刺保藏法、含甘油培养物保藏法、沙土管保藏法以及几种特殊菌种保 藏法(冷冻干燥保藏法、液氮冷冻保藏法)。 一、 常用菌种简易保藏法 (一)实验目的 1.了解几种常用简易菌种保藏法原理 2.学习几种常用简易保藏法。 (二)基本原理 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备, 操作简便易行,故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长 好的培养物置于4—5?冰箱中保藏,并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物 的生长繁殖,从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上,覆盖一层已灭菌的液体石蜡,再置于4—5?冰箱保藏。液体石蜡主要起隔绝空气作用,使外界空气不与培养物 11 接接触,从而 降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少直 培养基水分的蒸发,故此 法是利用缺氧及低温双重作用抑制微生物生长,从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15,已灭菌的甘油,然后再置于-20?或-70?冰箱中保藏。此法是利用甘油作为保护剂,甘油透入细胞后,能强烈降低 细胞的脱水作用。而且,在-20?或-70?条件下,可大大降低细胞代谢水平,但却仍能 维持生命活动状态,达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法,将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上,经培养后,制成孢子悬 液,无菌操作将孢子悬液滴入已灭菌的沙土管中,孢子即吸附在沙子上。将沙土管置于 真空干燥器中,通过抽真空吸干沙土管中水分,然后将干燥器置于4?冰箱中保存。此法 利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖,从而延长保藏时间。 (三) 实验材料 1.菌种 准备保藏的细菌、放线菌、酵母菌及霉菌。 2.培养基 牛肉膏蛋白胨斜面和半固体深层培养基、豆芽汁葡萄糖斜面培养基、高 氏一号斜面培养基、LB培养基。 3.其他物品 接种环、接种针等;无菌滴管、无菌液体石蜡、无菌甘油、五氧化二 磷或无水氯化钙、黄土、河沙等。 (四)实验方法和步骤 1. 常规转接斜面低温保藏法 这是实验室最常用的一种保藏方法,适于保藏细菌、放线菌、酵母菌及霉菌等。 1.1 接种 将不同菌种接种在适宜的斜面培养基 1.2 培养 12 在适宜的温度下培养,使其充分生长。如果是有芽孢的细菌或产生孢子的放线 菌及霉菌等都要等到孢子生成后再行保存。 1.3 保藏 将培养好的菌种置于4—5?冰箱中进行保藏。 1.4 转接 不同微生物都有一定有效的保藏期,到期后需另行转接至新配的斜面培养基上, 经适当培养后,再行保藏。 此法优点是操作简单,不需特殊设备;缺点是保藏时 间短,菌种经反复转接后,遗传性状易发生变异,生理活性减退。 各类微生物的培养条件及保藏条件总结如表3-1所示。 表 3-1 各种微生物斜面培并条件及保藏条件 培养培养保藏保藏菌类 培养基名称 温度/? 时间/d 温度/? 时间/d 细菌肉膏蛋白胨斜面30,371-24-51-3 马铃薯葡萄糖或高放线菌 25,30 5-7 4-5 3-6 氏合成一号斜面 豆芽汁葡萄糖或麦酵母菌 25,30 2-3 4-5 2-4 芽汁斜面 豆芽汁葡萄糖或麦霉菌 25,30 3-5 4-5 3-6 芽汁斜面 2. 半固体穿刺保藏法 这种保藏方法一般用于保藏兼性厌氧细菌或酵母菌,保藏期0.5-1年。 2.1 接种 用穿刺接种法将菌种接种至半固体深层培养基中央部分,注意不要穿透底部。 2.2 培养基 在适宜温度下培养,使其充分生长。 2.3 保藏 将培养好的菌种置于4—5?冰箱保藏。 2.4 转接 一般在保藏0.5年或1年后,需转接到新配的半固体深层培养基中,经培养后, 13 再行保 藏。 3. 液体石蜡保藏法 此法适于保藏霉菌、酵母菌和放线菌。可保藏菌种达1—2年之久,并且操作 简单易行,但有些细菌和霉菌,如固氮菌、乳杆菌、分枝杆菌和毛霉、根霉也比较 等不宜用此 法保存。 3.1 液体石蜡灭菌 将液体石蜡置于100 mL的小锥形瓶内,每瓶装10 mL,塞上棉塞, 外包牛皮纸,高压蒸汽灭菌,100kPa灭菌30 min。灭菌后将装有液体 石蜡的锥形瓶置于105—110?的烘箱内烘干约1h,以除去液体石蜡中 的水份 .2 接种3 将菌种接种至适宜的斜面培养基上。 3.3 培养 在适宜温度条件下培养,使其充分生长。 3.4(加液体石蜡 无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡,注入到已长好菌的斜面上,液体石蜡的用量高出斜面顶端1cm左右为宜,使菌种与空气隔绝。 以 3.5.保藏 将已注入液体石蜡的斜面培养物直立,置于4-5?冰箱或室温下保存 3.6(转接 到保藏期后,需将菌种转接至新的斜面培养基上,培养后再加入适量的灭菌液体石蜡,再行保藏。 4. 含甘油培养物保藏法 在基因工程中,此法常用于保存含质粒载体的大肠杆菌,一般可保存0.5-l年。 4.1 甘油灭菌 将甘油置于100mL的小锥形瓶内,每瓶装10 mL,塞上棉塞,外包牛皮纸,高压蒸汽 灭菌,0.1MPa灭菌20 min。 4.2 接种与培养 用接种环取一环携带质粒载体的大肠杆菌接种到一支装有5mL含氨苄青霉素(100ug,mL培养基)的LB液体培养基的试管中,37?振荡培养过夜. 14 4.3 培养物与灭菌甘油混合 用无菌移液管吸取0.85mL大肠杆菌培养液,置于一支带有螺口和空气密封圈的试管中(或置于一支1.5mL灭菌的Eppendorf管中),再加入0.15mL灭菌甘油,振荡,使培养液 与甘油充分混匀。然后将含甘油的培养液置于乙醇-干冰或液氮中速冻。 4.4 保藏 将已冰冻含甘油的培养物置于-70?(或-20?)冰箱中保存。 4.5 转接 到保藏期后,用接种环刮拭冻结的培养物表面,然后将培养物接种到含氨苄青霉素的LB斜面上,37?培养过夜。用接种环挑取斜面上已长好的细菌培养物,置于装有2mI 含氨苄青霉素的LB培养液的试管中,再加入等量含30,灭菌甘油和氨苄青霉素的LB液体 培养基中,振荡混匀。然后分装于带有螺口盖和空气密封圈的无菌试管中,或分装于1.5mL 灭菌Eppendorf管中,按上法冰冻保藏。 5. 沙土管保藏法 此法仅适用于保藏产生芽孢或孢子的微生物,常用于保藏芽孢杆菌、梭菌、放线菌或霉菌等,保藏期达数年之久。 5.1 无菌沙土管制备 (1)河沙处理 取河沙若干,用40目筛子过筛,除去大的颗粒。再用10,HCl溶液浸 泡,除去有机杂质,盐酸用量应浸没沙面,约浸2~4h,倒出盐酸,用自来水冲洗至中性, 烘干。 (2)筛土 取非耕作层瘦黄土若干,磨细,用100目筛子过筛。 (3)沙和土混合 取1份土加4份沙混合均匀,装入小试管中,装量约1cm高即可,塞 上棉塞。 (4)灭菌 100kPa高压蒸汽灭菌1h,每天一次,连灭3d。 (5)无菌检查 取灭菌后的沙土少许,接入肉膏蛋白胨培养液中,37?培养1,2d, 观察有无杂菌生长。如有,则需重新灭菌。 15 5.2 制备菌悬液 吸取3—5mL无菌水至1支已培养好待保藏的菌种斜面中,用接种环轻轻搅动培养物, 制成菌悬液。 5.3 加样 用无菌吸管吸取菌悬液,在每支沙土管中滴加4—5滴菌悬液,用接种环 拌匀,塞上沙土管棉塞。 5.4 干燥 将已滴加菌悬液的沙土管置于干燥器内,干燥器内应预先放置五氧化二 磷或无水氯化钙用于吸水,当五氧化二磷或无水氯化钙因吸水变成糊状时则 应进行更换。如此数次,沙土管即可干燥。有条件时,也可用真空泵连续抽气约3h,即可达到干燥效果。制成的沙土管如图3-2。 5.5 抽样检查图 3-2 沙土管 16 从抽干的沙土管中,每10支抽取1支进行检查。用接种环取少许沙土,接种 所保藏菌种生长的斜面上,并进行培养。检查有无杂菌生长及所保藏菌种到适合于 的生长情况 5.6 保藏 若经检查没有发现问题,可采用下列任一种措施进行保藏。?沙土管继续放在干燥器中,干燥器可置于室温或冰箱中。?可将沙土管带塞一端浸入熔化的石蜡中,使管口 密封。?在煤气灯上,将沙土管的棉塞下端的玻璃烧熔,封住管口,再置于冰箱中保存。 此法可保存菌种1到数年,对产孢子的微生物如芽孢杆菌、放线菌和霉菌的保藏比较适宜。 (五) 作业 1.简述菌种保藏的一般原理。 2.分别简述斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物 保藏法、沙土管保藏法的保藏原理。 3.列表比较斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物 保藏法、沙土管保藏法各适合保藏何种类型微生物? 保藏温度及保藏时间, (六) 思考题 1.实验室中最常用哪一种既简单又方便的保藏法保藏细菌菌体? 2.含甘油培养物保藏法常用于保藏何种类型微生物? 3.沙土管保藏法仅适合于保藏何种类型微生物?灭菌后的沙土管保藏法为什么必须 进行无菌检查? 二、 冷冻真空干燥保藏法 (一) 实验目的 1.掌握冷冻真空干燥保藏法原理。 2. 学习冷冻真空干燥保藏法操作。 (二) 基本原理 冷冻真空干燥保藏法集中了菌种保藏的有利条件,如低温、缺氧、干燥和添加保护剂。此法包括三个主要步骤:首先将待保藏菌种的细胞或孢子悬浮于保护剂(如脱脂牛奶) 中,目的是减少因冷冻或水分不断升华对微生物细胞所造成的损害;继 17 而在低温下(-70?左右)使微生物细胞快速冷冻;然后在真空条件下使冰升华,以除去大部分水分。 冷冻真空干燥保藏法是目前最有效的菌种保藏方法之一。它具有两个突出优点:适用范围广。据报道,除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此法保藏外, 其他各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌以及病毒都可采用此法保藏,保 藏期长、存活率高。采用此法保藏菌种其保藏期一般可长达数年至十几年,并且均能取 得良好保藏效果。缺点是设备昂贵,操作复杂。 (三)实验材料 1.菌种 准备保藏的细菌、放线菌、酵母菌或霉菌。 2.培养基 适于培养待保藏菌种的各种斜面培养基。 3.试剂 脱脂牛奶、2,HCl等。 4.器皿 安瓿管,长颈滴管、青霉素小瓶、无菌移液管、冷冻干燥装置。 (四)实验方法和步骤 1. 冷冻真空干燥保藏法 1.1 准备安瓿管 安瓿管一般用中性硬质玻璃制成,管中内径约6—8mm,长度约100 mm左右,先用2,HCl浸泡过夜,然后用自来水冲洗至中性,最后用蒸馏水冲3次,烘干备用。将印有菌名和接种日期的标签纸置于安瓿管内,印字一面向着管壁,管口塞上 高压蒸汽灭菌,100kPa灭菌30min。 棉花并包上牛皮纸, 1.2 制备菌悬液 (1)菌种斜面培养 一般利用最适培养基在最适温度下培养菌种斜面,以便获得生长 良好的培养物,一般选择静止期的细胞。如能形成芽孢细菌,可用其芽孢保藏,放线菌 和霉菌则利用其孢子进行保藏。不同微生物其菌种斜面培养时间有所 18 不同,细菌可培养24—28h,酵母菌培养3d左右,放线菌与霉菌则可培养7,10 d。 (2)制备菌悬液 吸取2mL已灭菌的脱脂牛奶至待保藏已培养好的新鲜菌种斜面中, 用接种环 810轻轻刮下培养物,使其悬浮在牛奶中,制成的菌悬液浓度以10--10个,mL为 宜。 (3)菌悬液的分装 用无菌长滴管吸取0.2mL的菌悬液,滴加在安瓿管内的底部,注 意不要使菌悬液粘在管壁上。 1.3 冷冻真空干燥操作步骤 (1)菌悬液预冻 将装有菌悬液的安瓿管直接放在低温冰箱中(-35,-45?)或放在 干冰无水乙醇浴中进行预冻。预冻目的是使菌悬液在低温条件下冻结成冰(注意:预冻温 度不要超过-25?,因含有脱脂牛奶的菌悬液冰点下降)。 (2)冷冻真空干燥 将装有已冻结菌悬液的安瓿管置于真空干燥箱中,开动真空泵进 行真空干燥。若采用简易冷冻真空干燥装置时,应在开动真空泵后15min内,使真空度达 到66.7Pa。在此条件,菌悬液才能保持冻结状态,被冻结菌悬液开始升华,继续抽气, 当真空度达到26.7—13.3Pa之后,维持6—8h。样品可被干燥,干燥后样品呈白色疏松状态。 (3)安瓿管封口 样品干燥后,先将安瓿管上部棉塞下端处用火焰烧熔并拉成细颈, 再将安瓿管接在封口用的抽气装置上,开动真空泵,室温抽气,当真空度达到26.7Pa时, 继续抽气数分钟,再用火焰在细颈处烧熔封口。 (4)保藏 将封口带菌安瓿管置于冰箱(5?左右)中或室温下避光保存。 2. 简易冷冻真空干燥保藏法 此法优点是:可用生化实验室常用普通冷冻真空干燥装置代替微生物实验室菌种保藏专用的冷冻真空干燥装置,并可用无菌容器封口膜覆盖的药用青霉素小瓶代 19 替无菌熔封安瓿瓶,进行菌种的冷冻真空干燥保藏操作。 2.1 制备无菌瓶 将药用青霉素小瓶先用2,HCl浸泡8~10 h,再用自来水冲洗多次,最后用蒸馏水洗1—2次,烘干。将印有菌名及接种日期的标签纸放入小瓶中,瓶口用无菌培养容器封口膜 覆盖扎紧,连同小瓶的橡皮塞一同高压蒸汽灭菌(0.1MPa,灭菌30 min),然后备用。 2.2 制备无菌脱脂牛奶 制备脱脂牛奶(按常规)或配制40,脱脂奶粉,在0.08MPa灭菌30min,并作无菌检验。 2.3 制备菌悬液 在培养好的新鲜菌种斜面上,加入无菌水3mL,用接种环刮下细胞,轻轻搅动,制成细胞分散均匀的菌悬液(不要刮破培养基)。 2.4 分装 用无菌移液管将菌悬液分装入灭菌青霉素小瓶中,每瓶装0.2mL,再用无菌长滴管将灭菌脱脂牛奶约0.2mL加入上述小瓶中,稍振荡使之混匀。 2.5 预冻 将上述小瓶放入500 mL干燥瓶中,然后放入-35~-40?低温冰箱中约0.5h,待小瓶中 菌悬液冻结成固体后取出。 2.6 冷冻真空干燥 迅速将干燥瓶插在冷冻干燥器的抽真空插管上,迅速抽真空,并冷冻干燥,约24~36h,待菌体混合物呈疏松状态,稍一振动即脱离瓶壁方可取出。 2.7 封存 在无菌室内将无菌培养容器封口膜取下迅速换以无菌橡皮塞,最后用封口膜将瓶口封住,置于-20?低温冰箱保存。此法可以对细菌、霉菌和酵母菌进行保藏。细菌和霉菌启封后立即在斜面或平板划线接种即可;酵母菌最好接至YPD液体培养基,30?振荡培养24-48h后,再将增殖的菌种 接种到斜面或平板上进行恢复培养。 20 (五) 实验报告内容 简述冷冻干燥保藏法的原理及其突出优点。 (六)思考题 在冷冻干燥保藏法中为什么必须先将菌悬液预冻后才能进行真空干燥, 三、 液氮超低温冷冻保藏法 (一) 实验目的 1.了解液氮冷冻保藏法原理。 2.学习液氮冷冻保藏法操作。 (二) 基本原理 液氮超低温冷冻保藏方法的原理是:微生物在超低温(-150?-196?)条件下,一切 代谢停止,但生命仍在延续。将微生物细胞悬浮于含保护剂的液体培养基中,或者把带 菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中,经预先缓慢冷冻 -196?)或气相(-156?)中进行保藏。 后,再转移至液氮冰箱 内,于液相( 此法是目前比较理想的一种菌种保藏方法,其主要优点是它不仅适合保藏各种微生 物,而且特别适于保藏某些不宜用冷冻干燥保藏的微生物。此外,保藏期也较长,菌种 在保藏期内不易发生变异。故此法现已被国外某些菌种保藏机构作为常规保藏方法。目 前,我国许多菌种保藏机构也采用此法保藏菌种。此法缺点是需要液氮冰箱等特殊设备, 故其应用受到一定限制。 (三)实验材料 1.菌种 准备保藏的细菌、放线菌、酵母菌或霉菌。 2.培养基 适于培养待保藏菌种的各种斜面培养基或琼脂平板。 3.试剂 含10,甘油的液体培养基或10,(v/v)二甲亚砜等。 4.器皿及其他 安瓿管、吸管、液氮冰箱及控速冷冻机等。 (四)实验方法和步骤 1、准备安瓿管 21 液氮保藏所用安瓿管必须能够经受121?高温和-196?冷冻处理而不破裂,故一般采 用硬质玻璃制品,安瓿管容量通常为2mL,也可使用聚丙烯塑料做成的带螺帽的安瓿管。 洗刷干净并烘干,安瓿管口塞上棉花并包上牛皮纸, 100kPa高压蒸汽灭菌30 min,然后 把安瓿管编号备用。 2、准备冷冻保护剂 液氮保藏法一般都需要添加保护剂,通常采用终浓度为10,(v/v)甘油或10,(v/v)二甲亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂。含甘油溶液需经高压灭菌,而含二甲亚砜溶液则采 用过滤除菌。 如要保藏只能形成菌丝体而不产生孢子的霉菌时,除需制各带菌琼脂块外,还需在 每个安瓿管中预先加入一定量含10,甘油的液体培养基(加入量以能没过即将加入的带 菌琼脂块为宜)。100kPa灭菌20min备用。 3、制备菌悬液或带菌琼脂块浸液 3.1(制备菌悬液 在每支长好菌的斜面中加入5mL含10,甘油液体培养基,制成菌悬液。取0.5-1mL菌悬液分装于无菌安瓿管中,然后用火焰熔封安瓿管口。 3.2(制备带菌琼脂块浸液 如要保藏只长菌丝体的霉菌时,可用无菌打孔器从平板上切下带菌落的琼脂块(直径约5—10mm),置于装有含10,甘油液体培养基的无菌安瓿管中,用火焰熔封安瓿管口。 为了检查安瓿管口是否熔封严密,可将上述经熔封的安瓿管浸于水中,如发现有水进入管内,说明管口未封严。 4、慢速预冷冻处理 菌种在置于液氮冰箱保藏前,微生物细菌需经慢速冷冻,其目的是防止细胞因快速冷冻而在细胞内形成冰晶,因而降低菌种存活率。 4.1(控速冷冻 将已封口的安瓿管置于铝盒中,然后再置于一个较大金属容器中,再将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中,以每分钟下降10?的速度冻结至-30? 4.2(普通冷冻 如实验室无控速冷冻机时,可将已封口安瓿管置于-70?冰箱中预冷冻4h,以代替控 速冷冻处理。 5、液氮保藏 将经上述经慢速预冷冻处理的封口安瓿管迅速置于液氮冰箱中,于液相(- 22 196?)或气相(-156?)进行保藏。若把安瓿管只保藏在液氮冰箱的气相中,则不需除去安瓿 管口棉塞,也无需熔封安瓿管口。 6、恢复培养 如需用所保藏菌种时,可用急速解冻法融化安瓿管中结冰。从液氮冰箱中取出安瓿管,立即置于38-40?水浴中,并轻轻摇动,使管中结冰迅速融化。然后无菌操作打开安 瓿管,并用无菌吸管将安瓿管中保藏的培养物全部转移至含有2mL无菌液体培养基中,再 吸取0.1,0.2mL菌悬液至琼脂斜面上,进行保温培养。 (五)注意事项 1.安瓿管需绝对密封,如有漏洞,保藏期间液氮会渗入安瓿管内,当从液氮冰箱取 出安瓿管时,液氮会从管内逐出,且由于室温温度高,液氮常会由于急剧气化而发生爆 炸,故为防不测,操作人员应戴皮手套和面罩等。 2.液氮与皮肤接触时,皮肤极易被“冷烧”,故应特别小心操作。 3.当从液氮冰箱取出某一安瓿管时,为了防止其他安瓿管升温而不利于保藏,故取 出及放回安瓿管的时间一般不要超过1min。 (六)作业和思考题 1.液氮超低温冷冻保藏法中为什么需用含保护剂的液体培养基制备菌悬液?保护剂 的作用是什么? 2.用什么方法检查安瓿管是否熔封严密?如管口未封严,将会产生什么不良后果? 3.液氮超低温冷冻保藏法中为什么需采用缓慢冷冻(或控速冷冻)细胞?它的目的是什么? 23 实验四 液体发酵培养基的设计 一、实验目的 学习和掌握液体发酵培养基的正交试验设计的原理和方法 二、基本原理 应用微生物采用液体发酵法生产目的产物,一般使用的培养基包括适合于代谢产物生成和菌体生长所需要的碳源、氮源、无机盐和其他物质等以有利于最终代谢物的生产。 研究各个成分对在终产物的影响采用单因素的方法实验处理和次数比较多,考虑不到所 有成分的综合影响,需要应采用数理统计的方法优化培养基的组分。正交试验设计可以 以较少的实验处理数来判断出培养基的成分的最佳组合。 正交试验设计是用排好的正交表安排实验和分析试验的一种科学方法,获得最佳搭 配的方法之一。正交表具有均衡分散性和整齐可比性,具体表现: (1)每一列中,不同 的数字出现的次数相等。 (2)任意两列中,将同一横行的两个数字看成有序数对(即左边 的数放在前,右边的数放在后,按这一次序排出的数对)时,每种数对出现的次数相等。 正交试验设计的步骤包括:1(明确试验目的,确定试验考核指标;2(制定因素位 级表:首先,挑选供试验考察的因素,其次,确定因素变化的位级,最后,制出因素位 级表;3(选用正交表:(I)先按位级数选表,(2)根据试验特点要求选表;4,利用正交表来安排试验:填写试验计划表;既把根据因素位级表所确定的因素位级代号对应到正交表中安排因素和位级的位置所形成的试验计划。 正交试验结果分析方法包括,1(直接观察:接观察是指对试验结果不进行计算而直接根据观察试验结果来确定较好试验条件的方法,直接观察的导致最好结果的试验方 案称为直接观察的优秀方案。2(一般计算分析:一般计算分析是指运用简单的数学运算 对试验结果进行分析的方法。计算分析程序:(I)计算每一因素各个位级导致结果之和。 参加试验的因素取了几个位级后,每一个位级参予几次试验就会由它导致几个试验结果。 把这些结果相加就求出了每一因素各个位级导致结果之和;(2)计算每一因素各个位级导 致结果之和的极差。极差是指一组数据中最大值和最小值的差,用符号 R 表示;(3)确定关键因素、重要因素和可能最优 24 试验结果有较大影响的因试验方案。关键因素和重要因素是指由于它的变动会对 素。关键因素和重要因素的微小变化会使试验结果有较大差异, 在试验中要特别注意对它们进行考核,准确地掌握好它们的位级。划分因素的根据是极 差。极差的大小说明相应因素作用的大小。极差大,说明该因素是活泼的,它的变化对 结果影响很大。极差小,说明该因素是保守的,它的变化对结果影响较小。3(考察位级 趋势,探寻可能更优方案。考察位级趋势是通过分析位级与结果的内在联系,探寻在试 验中并没有选取而可能是更好的位级,并以此总结出可能更优秀的试验凡方案。考察位 级趋势使用趋势图,用因素的位级作横坐标,用相应因素的位级导致结果之和为纵坐标, 在图中画出相应的点,用直线把它们依次连结起来就形成位级趋势折线。一般情况下, 趋势图只适用于有联系的用数量表示的位级的考察。需要注意的是对定量的位级要按位 级量递增或递减顺序画图。4、差分析。 4本实验采用L (3)正交实验设计,研究培养基组成对酵母菌生长的影响。生物 9 量的测 定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液 的状态存在的,所以可以采用直接比色法进行测定。 三、实验材料 1(仪器设备 全恒温振荡培养箱,分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。 2(试剂 葡萄糖,蔗糖,酵母膏,KHPO,无菌水。 24 3(菌种:酿酒酵母种子 四、实验步骤 (1)培养基的配制(见表 4-1,4-2) 表4-1 正交试验设计 g/1000mL 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KHPO24 1 10.0 0.0 5.0 1.0 2 20.0 10.0 10.0 2.0 3 30.0 20.0 15.0 3.0 25 表 4-2 正交表实验方案 POKH生物量 (OD)24葡萄糖 蔗糖 酵母膏 编号 0h 12h 24h 36h 48h 60h(D) (A) (B) (C) 1(1)(1)(1)(1) 2(1)(2)(2)(2) 3(1)(3)(3)(3) 4(2)(1)(2)(3) 5(2)(2)(3)(1) 6(2)(3)(1)(2) 7(3)(1)(3)(2) 8(3)(2)(1)(3) 9(3)(3)(2)(1) (2)将上述培养基配制好以后,每 250 mL 三角瓶装入培养基 100 mL,于 121?下 灭菌 30 min,冷却. (3)冷却后接种(接种量为 5,),置于 28?培养箱进行培养。 (4)测 0D 值:将接种 0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 不同时间的菌悬液摇 均匀后于 560nm 波长、1cm 比色皿中测定 0D 值。比色测定时,以未接种的培养基作空白 对照,并将 0D 值填入表中,最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五、思考题 1.对实验结果进行全面分析,确定最佳培养基的组成及发酵时间。 2.比浊计数在生产实践中有何应用价值? 3.本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度,如果你在实验中需要测 定大肠杆菌生长的 0D 值,你将如何选择波长? 26 实验五 生产菌株发酵条件的优化 一、实验目的 1(了解发酵条件对产物形成的影响,用单因子试验找出筛选所得菌株的最佳发酵条 件。 2(掌握发酵培养基的配制原则,熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。 二、基本原理 发酵产品的生产除了发酵培养基为主要因素外,发酵条件的控制也尤为重 要,例如 温度、pH、装量、接种量、含水量、发酵周期等,需要研究各个参数对发酵终产物的影 响程度以最终确定最佳的发酵工艺。可采用单因素的方法研究,也可利用数理统计的方 法进行优化。 培养基 pH 一般指灭菌前的 pH,可通过酸碱调节来控制,由于发酵过程中 pH 会不断 改变,所以最好用缓冲溶液来调节;通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量,另外, 瓶口纱布的厚薄也会影响到氧气的传递,为了防止杂菌污染,瓶口纱布以 8 层纱布为好。 发酵培养基是指大生产时所用的培养基,由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元 素,因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高,如果产物的含氮量高,还应增 加培养基中的氮源比例。但必须注意培养基的渗透压,如果渗透压太高,又会反过来抑 制微生物的生长,在这种情况下可考虑用流加的方法逐步加入碳氮源。 培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培 养基不同,一般以经济节约为主要原则,因此常用廉价的农副产品为原料。选择碳源时 常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉;而用豆饼粉、黄豆粉等作为氮源;此外,还应 考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然原料的组分复杂,不同批 次的原料成分各不相同,在进行发酵前必须进行培养基的优化试验。 发酸培养基中的原料多是大分子物质,微生物一般不能直接吸收,必须通过胞外酶 的作用后才能被利用,所以是一些“迟效性”营养物质。而微生物分泌的胞外酶有不少 是诱导酶,为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖,可 27 适当在培养基中添加—些速效营 养物。 三、实验材料 1(菌种 筛选得到的放线菌(抗素产生菌) 2(培养基 (1)种子培养基:高氏 1 号培养基; (2)发酵培养基:由可溶性淀粉作为族源,黄豆饼粉、蛋白胨和酵母膏作为复合营养源,它们的配比根据正交试验确定,另加 0.5,K2HP04、0.05,NaCl和 0.05,MgS04作为无 机矿质元素,调节pH至 7.2。 四、实验步骤 1(培养基初始 pH 对抗生素积累的影响 将种子培养基配好后,用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HC1 分别调节培养基 pH 至 5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0,分装至 250 mL 三角瓶中,每瓶 25mL。0.1MPa 灭菌 30mLn。冷却后接种, 在 30?恒温摇床上以 180/min 的转速培养 5-7d,测定发酵液的抑菌圈大小,确定产生抗 生素的最佳培养基 pH。 2(培养温度对抗生素积累的影响 基本同上法,将接种后的三角瓶在 20?、25?、30?、35?和 40?下摇床(180 r,min)培养 5—7d,测定发酵液的抑菌围大小,找出最佳发酵温度。 3(培养基装量对抗生素积累的影响 基本同上,在 250 mL 三角瓶中分装培养基,装量分别为 20mL、30mL、40mL、50mL 和 60 mL,以 8 层纱布封口,0.1MPa 灭菌 30min,接种后 30?摇床培养(180 r,min)5—7d, 测定发酵液的抑菌圈大小,确定最适培养基装量。 4(摇床转速对抗生素积累的影响 基本同上。在 250mL 三角瓶中分装 25mL 培养基,接种后在 150r,min、180r,min、210 r,min 和 240 r,min 的摇床中摇瓶培养(30?)5—7d,测定发酵液的抑菌圈大小, 找出最适摇床转速。 5(最适培养基配方的正交试验 (1)将可溶性淀粉、黄豆饼粉、蛋白胨和酵母膏作为培养基的主要影响因素,每一因素设定 3 个水平,按表 5-1 配制 9 组培养基(W,v),另加入 0.5,K2HP04、0.05,NaCl和0.05,MgS04,分装于 250mL三角瓶中,每瓶 25mL。用 8 层纱布包扎后于 0.1MPa灭菌 30min; 表 5-1 抗生素产生菌发酵培养基优化用四因素三水平正 交试验表 28 因素 A因素 B因素 C因素 D抑菌圈大小组别 (淀粉) (黄豆饼粉) (蛋白胨) (酵母膏) (cm) 11(5%)1(3%)1(0.2%)1(0.4%) 212(5%)2(0.4%)2(0.6%) 313(7%)3(0.6%)3(0.8%) 42(7%)123 52231 62312 73(9%)132 83213 93321 (2)接种;桃取斜面孢子 5 环接入 5mL 无菌水中,摇匀后用无菌移液管吸取 0.5mL 孢子悬液,接到每一组培养基中(接种量要完全一样)。 (3)发酵:将三角瓶放于摇床上,30?,180r/min 摇床培养 5—7d。 (4)取下摇瓶,立即进行抑菌活力的测定(杯碟法或圆滤纸片法),比较各组培养基配方的抑菌活力,确定最佳培养基配方。 五、注意事项 1(进行单因子试验时,其他实验条件应尽可能一致。 2(培养温度,摇床转速等对结果影响很大,因此除转速和温度试验外最好在同一摇 床中进行。 六、思考题 1(如果不用正交实验,四因素三水平的实验总共需要做几组? 2(如果用合适的缓冲液来调节 pH,进行培养基 pH 对淀粉酶产生的影响试验是否使 实验更可靠? 附: 若要优化淀粉酶产生细菌(或抗生素产生细菌)的发酵条件,基本条件可设定在 pH7.0,培养基装量 10,(25mL/250 mL 三角瓶),37?,180 r,min 摇床培养 48h,培养基配比可设定为因素 A 玉米粉,5,,7,,9,三个水平;因 三个水平;因素 C 磷酸氢二钠,0.6,,0.8,,素 B 豆饼粉,3,,5,,7, 1.0,三个水平;因素 D 硫酸铵,0.4,,0.6,,0.8,三个水平,具体操作同上法。 29 实验六 生长曲线和产物形成曲线的测定 一、实验目的 1.了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。 2.学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法。 二、基本原理 将少量微生物接种到—定体积的新鲜培养基中,在适宜的条件下培养,定时测定培养液中微生物的生长量(吸光度或活菌数的对数),以生长量为纵坐标,培养时间为横坐 标绘制的曲线就是生长曲线,它反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律。依据 生长速率的不同,一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。 这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量和培养条件而异。因此,通过微生物生长 曲线的测定,可了解微生物的生长规律,对于科研和生产实践都具有重要的指导意义。 延滞期的存在,会使发酵周期延长(不利于劳动生产率的提高。工业发酵中常采用增大接种量,用对数期种子接种等措施来缩短延滞期;对数期是微生物快速繁殖的时期, 此期的细胞代谢活性最强,代时稳定,是发酵生产的良好种子,也是科研工作的良好材 料;稳定期是代谢产物积累的时期,也是细胞数量最高的时期,如果为了获得大量菌体, 应在稳定期的前期收获,若要获得代谢产物,一般在稳定期的中后期结束发酵;衰亡期 是菌体逐渐死亡的阶段,若在发酵工业中出现衰亡期,很可能是受到杂菌(包括噬菌体) 的污染。 测定微生物的数量有多种方法,如血球计数法、平板活菌计数法、称重法、比浊法 等,本实验采用比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸光度(A)也称光密度成正比,只要 用分光光度计测得菌液的 A 后与其对应的培养时间作图,即可绘出该菌株的生长曲线, 此法快捷、简便。如果所用的分光光度计能直接利用试管读出 A,则只需接种一支试管, 便可做出该菌株的生长曲线。 产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。工业发酵的目的是为了收获产物, 因此必须搞清产物积累最高时所需的发酵时间。如果提前终止发酵,营养物质还没有完 全被利用,发酵液中的产物量偏低;如果发酵时间过长,一方面产物可能会分解,另一方面也降低了设备利用率。出此,学会生长曲线和产物形成 非常重要的指导意义。 曲线的测定对工业发酵具有 30 三、实验材料 l(菌种 筛选得到的抗生素产生菌(或淀粉酶产生菌)菌株。 2(培养基 按“实验五”确定的最佳培养基配方。配制、灭菌等措施同上。 3. 器材 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、分光光度计、摇床等。 四、实验步骤 1(生长曲线的测定 (1)按上一实验确定的最佳培养基配方配制发酵培养基,0.1MPa 灭菌 20 min,备用。 (2)将供试菌种在斜面培养基上活化,培养成熟。 (3)从成熟斜面上挑取 5 环菌苔或孢子接入 7mL 无菌水中,摇匀,吸取 0.5mL 菌悬液 接入发酵培养基中,—共接 13 瓶。 (4)将三角瓶放入摇床上,在实验五确认的合适条件下培养。 (5)如果目的菌株是放线菌,则每隔 12h 拿出一瓶(包括 0h),以不接种的培养基作对照、在 560nm 处测吸光度,填入表 6-1 中;如果目的菌株是细菌,则每隔 4h 拿出一瓶, 在 560 nm 处测吸光度。 (6)以培养时间为横坐标,吸光度为纵坐标,作生长曲线。 2(产物形成曲线的测定 同上法,如果目的菌株是放线菌,48h 后,每隔 12h 取出一瓶,在进行生长量测定的 同时,进行产物形成量(抑菌活力或淀粉酶活力)的测定,并记录于表 6-1 中,以培养时 间为横坐标,产物形成量为纵坐标,作出产物形成曲线;如果目的菌株是细菌,则在 16h 后,每隔 4h 取出一瓶,进行产物形成曲线的测定。 表 6-1 培养时间对菌体生长量和产物形成量的影响 培养时间,h01224364860728496108120132144 A560 抑菌圈直径,mm (淀粉酶活力) 五、注意事项 1(各瓶的接种量、培养条件应一致。 2(若吸光度太高,可适当稀释后再测定 3(因培养液中含有较多的颗粒性物质(包括菌体),测吸光度时应马上读数,否则, 颗粒沉淀,影响测定结果。稀释 10 倍后测定是可行的办法。若要精确测定,可用活菌计 数法,在营养琼脂培养基上观察生长的菌落数,但应掌握 31 好稀释倍数。 六、思考题 1(如果每次从同一摇瓶中取出 1mL 进行测定,会对结果产生怎样的影响? 2(比较生长曲线与产物形成曲线,可以得出哪些结论? 3(测定生长曲线时,除了本实验所用的分光光度计比浊法外,还有哪些方 法?它们 各有何优缺点? 32 实验七 酸乳的制作 一、实验目的 掌握酸凝乳制造方法、基本原理;了解发酵剂制备的过程和操作要点;对最终产品 进行感官评定及理化检测,并进行品质比较。 二、基本原理 酸乳也称酸牛奶,是人们喜爱的饮用发酵乳。所谓发酵乳,是以原乳、鲜乳或乳制品等为主要原料添加乳酸菌,发酵以后形成的的具有特殊风味的乳饮料。乳经过发酵制 成发酵乳以后营养价值提高,发酵乳中的蛋白质、钙盐容易消化吸收,具有助消化、抑 制肠道内异常的发酵和杀死肠道中的有害菌的作用。 酸奶是以牛奶等为原料经过均质、消毒、发酵等过程加工 而成的。酸乳的品种很多, 根据发酵工艺的不同,可分为凝固型酸乳和搅拌型酸乳两大类。凝固型酸乳在接种发酵 菌株后,立即进行包装,并在包装容器内发酵、成熟。搅拌型酸乳先在发酵罐中接种、 发酵,发酵结束后再进行无菌罐装并后熟。其基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖 产生乳酸,乳酸使牛奶中酪蛋白(约占全乳的 2(9,,占乳蛋白的 85,)变性凝固而使整 个奶液呈凝乳状态。同时,通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味,本实验主要学习 凝固型酸奶的制作方法。 三、实验材料 材料:脱脂乳粉、全脂奶粉或鲜牛乳、白砂糖、发酵剂(乳酸菌纯菌种或市售优质酸乳)等。 仪器设备:高压均质机、超净工作台、生化培养箱、pH 计、冰箱(冷藏柜)、恒温水 浴锅(或高压杀菌锅)、电炉、电子秤、相关玻璃仪器等等。 四、实验步骤 1.酸奶的制作 凝固型酸乳制作工艺流程:原料乳(或配制复原乳)?净乳? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化(调糖)?分 装?杀菌?冷却?添加发酵剂?发酵?冷藏(0,5?)?品质 检验鉴评 具体制作方法(以鲜牛乳为例): 33 1.原料处理 原料乳过滤(或配制复原乳:脱脂奶粉/水=1/7),按 5%-8%的比例加蔗糖加热(60? 左右)熔解,均质,分装到适宜的洁净灭菌容器中。 2.消毒 90,95?、处理 5 分钟,或 80?、处理 15 分钟,也可采用超高温瞬间灭菌的办法,110?、1 分钟或 135?、2 秒钟。消毒处理同时有助于酸乳成品的稳定性,防止乳清析出。 3.接种与发酵 经预处理并冷却至 45?左右的牛乳,按 5%-10%的比例接种发酵剂,与乳液充分混合。 接种后用无菌封口膜密封。发酵培养温度为 42?1?,时间为 3,4 小时,进行发酵。必 要时要取样检查,当 pH 值达到 4.5,4.7 时,即可终止发酵,并马上冷却。 4.冷藏后熟 置于 4,7?的冷藏柜中冷藏 24 小时。凝固型酸乳在出发酵室时必须注意轻拿轻放不 得振动,否则破坏了蛋白质的凝乳结构而乳清析出。 5.品质检验鉴评 色泽:色泽均匀一致,呈乳白色或稍带微黄色。 滋味气味:具有纯乳酸发酵剂制成的酸牛乳特有的滋味和气味,无酒精发酵味、霉味和其它不良气味。 组织状态:凝块均匀细腻、无气泡、允许少量乳清析出。 2.产品酸度、还原糖含量的测定 3.酸奶的品评 表1 感官 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 项目 项 目 纯酸牛乳 调味酸牛乳、果料乳牛乳 色泽 呈均匀一致的乳白色或微黄呈均匀一致的乳白色,或调味乳、果 色 料应有的色泽 滋味和气味 具有酸牛乳固有的滋味和气具有调味酸牛乳或果料酸牛乳应有的 味 滋味和气味 组织状态 组织细腻、均匀,允许有少量浮清析出;果料酸牛乳有果块或果粒 五、思考题 1.牛乳的杀菌工艺有哪几种, 34 2.乳酸菌在乳中发酵的原理,牛乳为什么会凝固, 3.你所制作的酸乳品质如何, 35 实验八甜酒酿的制作 一、实验目的 1.学习甜酒酿的发酵工艺; 2.明确发酵原理; 二、基本原理 甜酒酿是以糯米为主要原料,通过微生物的发酵酿制而成的。由于酵母不能直接利用淀粉,因此必须先用糖化菌如根霉、毛霉等把淀粉分解成单糖或双糖。因此,甜酒酿 是在糖化菌和酵母菌共同作用下酿制而成的,甜酒酿的制作过程包括糖化和酒化两个过 程。糖化过程是在糖化菌如根霉分泌糖化酶的作用下,将淀粉水解成葡萄糖;酒化过程 是酵母菌利用葡萄糖经过 EMP 途径生成丙酮酸,然后进入无氧呼吸将丙酮酸转化为乙醇。 三、实验材料 酒药、糯米、烧杯、培养箱、封口膜、吸管、不锈钢匙、玻璃棒等; 四、实验步骤 1.选择原料 选粒大饱满、无蛀虫、无杂物、色泽鲜亮、质量好的新糯; 2.淘洗浸泡 将米在水中浸泡 12-24 小时后用自来水冲洗,浸米的目的是使米中的淀粉粒子吸水 膨胀,便于蒸煮糊化;将浸泡好的米用自来水冲洗干净,并沥干。 3.蒸煮米饭 将洗净沥干的米在高压锅中隔水蒸煮 10-20 分钟,常压 30-40 分钟。要求达到熟而 不糊,外硬内软,内无白心,疏松易散,透而不烂,均匀一致。 4.淋饭降温 用冷开水淋洗糯米饭,以达到降温增水的目的,并使熟饭表面光滑,易于拌入酒药,利于糖化发酵菌的繁殖;淋饭时要边拌边淋,使米饭快速降温至 35?左右,避免因缓慢 冷却导致微生物污染。 36 5.接入种曲 将冷却至 30?左右的米饭,按糯米量 1%(0.5,—3,)接入酒药,拌匀装入烧杯,并 在中央用玻璃棒打一孔道,搭成喇叭型凹窝(中间低,周边高),表面冉洒上少许酒药, 用封口膜封口。 6.保温发酵 30?培养 48 小时,待喇叭型凹窝内有许多液体渗出,即可食用,但此时酒味淡泊, 略有酸味。若要品尝酒香浓郁的酒酿,可适当延长发酵时间。 7.后熟发酵 在 8-10?下培养 2-3 天。 8.质量评估 酒香浓郁,液体清澈透明,醪液 充沛; 五、实验报告 1.甜酒酿制作过程中应注意问题有哪些, 2.说明甜酒酿制作的发酵原理, 37 实验九 葡萄酒的制作 一、实验目的 1.明确葡萄酒发酵原理。 2.学习葡萄酒的发酵工艺。 二、基本原理 葡萄酒的发酵主要是指葡萄浆果中的糖在酵母菌的作用下生成酒精、CO和其2他副产物的反应。糖酵解(EMP)包括生物细胞将己糖转化为丙酮酸的一系列反应,这些反应可 在厌氧条件下进行,也可在有氧条件下进行。在糖的厌氧发酵中,葡萄糖经过EMP途径生 成的丙酮酸进入乙醛途径,生成乙醇。 三、实验材料 鲜葡萄,绵白糖,压榨机(或组织捣碎机),电子天平,烧杯,糖度计,过滤器,玻璃棒等。 四、实验步骤 工艺流程: 原料?挑选?除梗?破碎?加糖混匀?葡萄原汁?分装烧杯?加酵母?主发酵?过 滤?后发酵?调配?过滤?成品 1.原料 葡萄含糖量高,酸度适中,香味浓,色泽好。 2.除梗 对原料进行分选,除去霉烂果粒后,除去果梗,因果梗含有单宁,有机酸和苦味成分,如参与葡萄一起发酵,会影响酒的品质。 3.破碎 在组织捣碎机上将葡萄进行破碎,葡萄粒破碎要彻底,注意要保持果核完整。 4.调配及接种 酿制红葡萄酒时,将果汁连同果皮一起发酵,酿制白葡萄酒时,需将破碎的葡萄过滤挤压出果汁后进行发酵。为了补充葡萄糖分的不足,可 添加糖。 计算公式:(G+d%+x)/(G+x)=24% G 为葡萄质量;d 为原果实含糖量;x 为所需添加的糖量;24%为所要达到的最终含糖 量。 可适当接种酵母,接种量 0.5-1%。 5.主发酵 38 28-30?,培养 7-10 天,每天振荡一次并将皮盖压入酒体中。 6.过滤 主发酵结束后应立即过滤将酒液与皮渣分离,避免单宁过量浸入酒中,使酒产生味道过分苦涩现象。 7.后发酵 利用过滤时带入的少量空气来促使酒中酵母菌的活力,将酒中剩余残糖继续分解转化成酒精,沉淀物逐渐沉降于容器底部,酒慢慢澄清,一般需 1 个月左右的时间。 8.过滤 采用过滤器,除去酵母及酒脚等沉淀物即得成品。 五、实验报告 1.试说明红葡糖酒的制作过程中需要注意的事项有哪些, 2.分析红葡萄酒与白葡萄酒发酵工艺的不同之处, 39 实验十 酒精发酵及下游处理实验 一、实验目的 掌握酒精发酵工艺的具体操作。 二、实验原理 EMP途径 脱 羧 还 原 己糖 丙酮酸 乙醛 乙醇(酒精) 三、实验材料: 玉米粉,糯米,高粱粉,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 器材:烧杯,玻璃棒,天平,电炉,钢锅,5L三角瓶,恒温箱,弹孔胶塞,发酵栓,蒸馏装置,旋转蒸发器,冰箱 四、工艺流程 原料 ? 液化、糖化处理 ? 制醪 ? 发酵 ? 过滤 ? 滤液(测酒度) 五、实验步骤 1、称取原材料各1kg,将其进行液化和糖化处理,液化的目的是使淀粉水溶性增大,糖化的目的是将淀粉转化为葡萄糖,有利于酵母的发酵;将液化和糖化的原料分装入2000ml的三角瓶中,装罐系数为40-80%;测定糖度。 2、按照1.0~1.2%的比例称取活性干酵母,将其倒入烧杯中,加入适量的水、葡萄糖、NaCl,放于30?恒温箱中保温20min,进行干性酵母活化。待酵母活化后,按10%将其接种到装有原料的三角瓶中。 3、将接种的三角瓶置于28?的恒温箱中进行发酵48h,用单孔胶塞接一橡皮管,末端接发酵栓(或倒扣一个漏斗),置于装水的烧杯中,排气。 4、发酵结束后,测定发酵液pH、糖度。将发酵液微热到40?左右,降低发酵液的黏度,将其用纱布过滤,得滤液。 5、测滤液酒度,计算100g原料出酒率。 六、思考题 1、在发酵过程中如何控制酵母菌生长的最适温度, 2、原料破碎彻底与否与提高酒精得率有何关系, 3、计算100g原料出酒率。 40 实验十一 白酒的勾兑与品评 一、白酒勾兑的原理及目的意义 二、实验材料仪器 1实验材料 食用酒精,乙酸乙酯,丁酸乙酯,己酸乙酯,乳酸乙酯,乙醛,丙酸,丁酸,戊酸,己酸,乳酸, 2 实验仪器 0.1,0.5ml 吸管。 500,1000,3000ml 三角瓶, 100,1000ml 量筒, 酒精计 三、白酒勾兑实验方法 (一)白酒勾兑的步骤: 1.分别取100mL酒精、酒基于100mL量筒中,测其酒度。 2.根据公式计算 原酒酒度的重量% 标准度的重量%(1)折算率=×100% (2)将高度酒调整为低度酒 加水数=(原酒数量×各该原酒酒度的折算率)-原酒数量=(各该原酒的折算率-1)×原酒数量 例如:原酒为72.6度,数量为600斤,要求兑成60度需加水数。由于72.6度的原酒折算到60度标准度的折算率为125.1544%,加浆数量按上式计算: 加水数=(600×125.1544%)-600=150.93斤 或加水数=(125.1544%-1)×600=150.93斤 所以,原酒72.6度600斤兑成60度时,其加水数应为150.93斤。 (3)将低度酒调整为高度酒 标准量=各种原酒酒度的折算率×原酒数量 例如:原酒为47.6度,数量为800斤,要求折算成50度标准量。由于47.6度的原酒折算到50度标准度的折算率为94.9314%,按公式计算: 41 标准量=94.9314%×800斤=757.85斤 所以,47.6度的原酒800斤折成50度标准度时,应为757.85斤。 3.调香 (1) 浓香型白酒勾兑 取食用酒精,用酿造水降度到所要求酒度。降完度食用酒精加100%。然后用香精进行调整酒的口味。配方可自行设计。参考配方如下: 己酸乙酯0.1-2.0‰ 冰乙酸 0.1-0.4‰ 异戊醇 0.06-0.1‰ 乙酸乙酯 0.8-1.5 丁酸 0.06-0.1‰ 甘 油 0.1-0.4‰ 乳酸乙酯 0.1-0.4‰ 乙缩醛 0.02-0.04‰ 2-3丁二酮 0.04-0.08‰ 丁酸乙酯 0.06-0.2‰ 调 酸0.06-0.8‰ 异丁醇 0.02-0.4‰ 浓香香精 0.1-0.4‰ 乙 醛 0.02-0.04‰ 庚酸乙酯 0.02-0.04‰ (2)清香型白酒勾兑 取清香大曲酒和食用酒精,用酿造水降度到所要求酒度。清香大曲酒作为基础酒加量20%。降完度食用酒精加80%。按教材311页表进行混合。然后用香精进行调整酒的口味。配方可自行设计。参考配方如下: 己酸乙酯 0.1-0.2‰ 冰乙酸 0.1-0.4‰ 异戊醇 0.06-0.1‰ 乙酸乙酯 0.8-2.0‰ 丁 酸 0.06-0.1‰ 甘油 0.1-0.4‰ 乳酸乙酯 0.1-0.6‰ 乙缩醛 0.02-0.04‰ 2-3丁二酮 0.04-0.08‰ 丁酸乙酯 0.06-0.2‰ 调酸 0.06-0.8‰ 异丁醇 0.02-0.4‰ 清香香精 0.1-0.4‰ 乙醛 0.02-0.04‰ (3)酱香型白酒勾兑 取酱香大曲酒或麸曲酱原酒和食用酒精,用酿造水降度到所要求酒度。酱酒作为基础酒加量20%。降完度食用酒精加80%。按教材311页表进行混合。然后用香精进行调整酒的口味。配方可自行设计。参考配方如下: 己酸乙酯 0.1-0.2‰ 冰乙酸 0.1-0.5‰ 异戊醇 0.06-0.15‰ 乙酸乙酯 0.8-2.0‰ 丁 酸 0.06-0.1‰ 甘 油 0.1-0.4‰ 乳酸乙酯 0.1-0.8‰ 乙缩醛 0.02-0.06‰ 2-3丁二酮 0.04-0.1‰ 丁酸乙酯 0.06-0.3‰ 调 酸 0.06-0.8‰ 异丁醇 0.02-0.4‰ 酱香香精 0.1-0.4‰ 乙 醛 0.02-0.04‰ 正丙醇 0.02-0.04‰ 42 实验室啤酒发酵 一、 实验目的:熟悉静止培养操作,观察啤酒发酵过程,掌握发酵过程中一 些指标的分析操作技能。 二、 实验原理:啤酒酵母将麦芽汁发酵,产生酒精等发酵产物(啤酒)。 三、实验器材: ?. 100升发酵罐。 O?. 0~10 BX糖度表。 (3).10?-30?可调生化培养箱。 培养基: ?. 麦芽汁发酵培养基10Plato, 50升,糖化制取。 ?. 麦芽汁琼脂培养基:麦芽汁加2,琼脂,自然pH。 ?. 麦芽汁液体培养基:酵母扩大培养用。 菌种:啤酒生产用酵母菌株。 四、实验步骤: (1)麦汁制备 (2)酵母菌种分离纯化与质量鉴定 (3)菌种扩大培养 O7(4)啤酒主发酵:麦汁50升,10BX ,11??接种量1.5×10个细胞/mL O?主发酵,11?,5~7天?至4.0BX时结束(嫩啤酒)。在主发酵过程 中,每天测定下列项目:糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、α-氨 基氮、还原糖、酒精度 、pH、双乙酰。然后以时间为横坐标,这些指标为 纵坐标,叠画于方格纸上。 (5)后发酵 五、作业要求 (1). 画出发酵周期中上述上述指标的曲线图,并解释它们的变化。 43 (2). 记下操作体会与注意点。 实验一 协定法糖化试验 一、实验目的:协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会(EBC)推荐的评价麦芽质量的标准方法,我们用该法进行小量麦芽汁制备,并借此评价所用麦芽的质量。 二、实验原理:利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类,蛋白质分解为氨基酸(具体参见理论部分第二节)。 三、实验器材和试剂: 1 实验室糖化器:由水浴和500~600 mL的烧杯组成糖化仪器,杯内用玻棒搅拌或用100?温度计作搅拌器(此时搅拌应十分小心,以免敲碎水银头)。实验时杯内液面应始终低于水浴液面。最好采用专用糖化器:该仪器有一水浴,水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置。水浴上有4~8个孔,每个孔内可放一糖化杯,糖化杯由紫铜或不锈钢制成,每一杯内都带有搅拌器,转速为80~100转/分,搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同,但又不碰杯壁,它离杯底距离只有1~2 mm。 2 白色滴板或瓷板,玻棒或温度计。 3 滤纸,漏斗,电炉。 4 碘溶液,0.02N: 2.5克碘和5克碘化钾溶于水中,稀释到1000毫升。 四、实验步骤 1. 协定法糖化麦汁的制备 (1)取50g麦芽,用植物粉碎机将其粉碎。 (2)在已知重量的糖化杯(500~600 mL烧杯或专用金属杯)中,放入50g麦芽粉,加200mL 46~47?的水,于不断搅拌下在45?水浴中保温30分钟。 (3)使醪液以每分钟升温1?的速度,升温加热水浴,在25分钟内升至70?。此时于杯内加入100 mL 70?的水。 44 (4)70?保温1小时后,在10~15分钟内急速冷却到室温。 (5)冲洗搅拌器。擦干糖化杯外壁,加水使其内容物准确称量为450g。 (6)用玻棒搅动糖化醪 ,并注于干漏斗中进行过滤,漏斗内装有直径20厘米的折叠滤纸,滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿。 (7)收集约100mL滤液后,将滤液返回重滤。过30分钟后,为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层。将整个滤液收集于一干烧杯中。在进行各项试验前,需将滤液搅匀。 2. 糖化时间的测定 ? 在协定法糖化过程中,糖化醪温度达70?时记录时间,5分钟后用玻棒 或温度计取麦芽汁1滴,置于白滴板(或瓷板)上,再加碘液1滴, 混合,观察颜色变化。 ? 每隔5分钟重复上述操作,直至碘液呈黄色(不变色)为止,记录此时 间。 由糖化醪温度达到70?开始至糖化完全无淀粉反应时止,所需时间为 糖化时间。报告以每5分钟计算: 如 <10分钟 10~15分钟 15~20分钟等 正常范围值 浅色麦芽:15分钟内 深色麦芽:35分钟内 3. 过滤速度的测定 以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算,以 快、正常和慢等来表示,1小时内完成过滤的规定为“正常”,过滤时间超 过1小时的报告为“慢”。 4. 气味的检查 糖化过程中注意糖化醪的气味。具有相应麦芽类型的气味规定为“正 常’,因此对深色麦芽若有芳香味,应报以“正常”;若样品缺乏此味,则以 45 “不正常”表示,其它异味亦应注明。 5. 透明度的检查 麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示。 6. 蛋白质凝固情况检查 强烈煮沸麦芽汁5分钟,观察蛋白质凝固情况。在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀,记录为“好”;若蛋白质凝结细粒状,但麦汁仍透明清亮,则记录为“细小”;若虽有沉淀形成,但麦芽汁不清,可表示为“不完全”;若没有蛋白质凝固,则记录为“无”。 五、注意事项: 粉碎最好用EBC粉碎机,若用1号筛粉碎,细粉约占90%,用2号筛粉碎细粉约占25%。对溶解度好的麦芽,建议用2号筛。因为细粉太多影响过滤速度。 一般要求粗粒与细粒(包括细粉)的比例达1:2.5以上。麦皮在麦汁过滤时形成自然过滤层,因而要求破而不碎。如果麦皮粉碎过细,不但会造成麦汁过滤困难,而且麦皮中的多酚、色素等溶出量增加,会影响啤酒的色泽和口味。但麦皮粉碎过粗,难以形成致密的过滤层,会影响麦汁浊度和得率。麦芽胚乳是浸出物的主要部分,应粉碎得细些。 为了使麦皮破而不碎,最好稍加回潮后进行粉碎。 六、思考题:糖化过程中麦芽中各种酶的作用。 实验二 啤酒酵母纯种分离 一、 实验目的:学习酵母菌种的纯种分离技术 二、实验原理:关于纯种分离,在基础微生物学实验中已学过稀释分离法和划线分离法,这里不再重复。这两种方法虽然简单,但并不能保证分离所得种的纯度。而单细胞分离法因可用显微镜直接检查,其纯度能得到充分保证。 林德奈单细胞分离法,即小滴培养法,是将酵母菌液充分稀释至每一小滴差不多含一个酵母细胞,然后在显微镜下确证只含一个细胞的小滴,经适当培养后,扩大保存。 46 盖玻片上小滴点样示意图 凹载片上湿室小滴培养适宜图 三、实验器材与试剂:显微镜,凹载玻片,计数板,盖玻片等。 四、实验步骤: 1. 取2块盖玻片,用分析天平称重(精确至0.1mg)后,在一块盖玻片(最好 用血球计数板的盖玻片)上用毛细滴管滴上9滴酵母培养基,合上另一玻 片,再称重,计算每滴培养基的体积。 2. 用计数板计数酵母菌,用培养基对其进行高倍稀释,稀释至每滴培养基中大 致含一个酵母菌。 3. 在已灭菌的盖玻片上滴上酵母稀释液(每张玻片可滴9滴),放于已灭菌的 凹载玻片上,显微镜下观察,找到只含一个酵母菌的小滴,做上记号。 4. 30?培养一定时间后(应放于湿室中),用无菌滤纸片吸走标记的酵母菌, 进行扩大培养和菌种保藏。 五、注意事项:因小滴易干,操作时动作要快,培养时要用湿室。 六、思考题:称重时为什么要用两块盖玻片,是否可以用微量移液器(如1微升)来代替称重, 实验三 啤酒酵母的计数 一、实验目的:学习用血球计数板计数酵母数量的方法, 二、 实验原理:啤酒发酵时,必须接入一定数量的酵母细胞;在发酵过程中,为了跟踪发酵的进程,判断发酵是否正常,也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。酵母菌的计数常用血球计数板方法。血球计数板是一块长方形的玻璃板, 47 被四条凹槽分隔成三个部分,中间部分又被一横槽隔成上下两半,每一半上各刻有一个方格网,方格网的边长为3mm,分为9个正方形大格,每一大格为 21mm,其中中间那个大格被横向和纵向的双线分成25(或16)个中格,每个中格又被单线分成16(或25)个小格,因此一个大格中共有25×16=400个小格。这样的一个大格就是一个计数室。由于计数室比板表面要低0.1mm,因此盖 3上盖玻片后,整个计数室的容积就是0.1 mm,相当于0.0001mL。 计数时,先让计数室中充满待检溶液,然后计数400个小格中的细胞总数,就可换算出1mL发酵液中的总菌数。 三、实验器材:显微镜,血球计数板,盖玻片等。 四、实验步骤: 1. 取清洁的血球计数板一块,平放于桌面上,在计数室上方加盖专用盖玻片; 2. 取酵母菌液(发酵液)一小滴,滴至盖玻片的边缘,让菌液渗入计数室内,注意计数室内不能留有气泡。 3. 静置5分钟,让酵母细胞稳定附着于计数室内; 4. 将计数板置于显微镜的载物台上,先用低倍镜找到计数板的方格网,并移至视野中间(寻找时可通过缩小光圈,降低聚光镜,开低电源电压等方式减少进光量,使视野稍偏暗); 5. 找到计数室位置(中间一个大方格),并看清由双线包围的中方格(16或25格)及由单线包围的小方格(共400格); 6. 计数大格内的酵母细胞总数,必要时可在高倍镜下观察。 若酵母细胞过多,可采取 (1):稀释后再计数; (2):有代表性地选择左上,左下,右上,右下,中间五个中方格,计数其内的菌数,求得每个中格的平均值,然后乘以中方格数(25或16),即得每个大格内的细胞总数; (3):在上述5个中方格中选择处于顶角的4个小方格,计数,计算20个小方格中的总菌数,再乘以20,即得大格内的细胞总数。 7. 计算: 48 酵母细胞数/mL=大格中的细胞总数×10000×稀释倍数 8. 血球计数板的清洗: 将血球计数板立即用流水冲洗干净,若菌液变干,酵母细胞被固定在计数板上,则很难用流水冲洗干净,必须用优质脱脂棉湿润后轻轻擦洗,再用流水冲洗干净,凉干 五、注意事项: 1. 血球计数板的计数室内刻度非常精细,清洗时切勿用试管刷或其它粗糙物品擦拭。 2. 加样前,应先放好盖玻片,让菌液自然吸入。如果先加菌液,则由于盖玻片较轻,可能会浮在菌液上,这样,计数室内的容积就不再使0.0001mL了。因此,为了使结果更加准确,最好不要用普通的盖玻片来替代。 3. 计数时,为避免重复或遗漏,对压在方格线上的细胞,应遵循数上不数下,数左不数右的原则(即凡压在上部或左面线上的细胞,都应计数入内,凡压在下部或右面线上的菌体,都应忽略不计)。对出芽细胞,如果子细胞大于母细胞的一半,则应算作两个细胞。 六、思考题: 计数时,发现计数板不干净,怎样快速地清洗计数板, 实验三 啤酒酵母的质量检查 一、实验目的:学习酵母菌种的质量鉴定方法, 二、实验原理:酵母的质量直接关系到啤酒的好坏。酵母活力强,发酵就旺盛;若酵母被污染或发生变异,酿制的啤酒就会变味。因此,不论在酵母扩大培养过程中,还是在发酵过程中,必须对酵母质量进行跟踪调查,以防产生不正常的发酵现象,必要时对酵母进行纯种分离,对分离到的单菌落进行发酵性能的检查。 三、实验器材与试剂:显微镜,恒温水浴,温箱,高压蒸汽灭菌锅,带刻度的锥形离心管等 49 0. 025%美兰(又称次甲基兰,Methylene blue)水溶液:0.025g美兰溶于100mL水中; pH4.5的醋酸缓冲液:0.51g硫酸钙,0.68g硫酸钠,0.405g冰醋酸溶于100mL水中; 醋酸钾(钠)培养基:葡萄糖 0.06%,蛋白胨 0.25%, 醋酸钾(钠) 0.5%,琼脂 2%, pH 7.0。 四、实验步骤: 1. 显微形态检查 载玻片上放一小滴蒸馏水,挑酵母培养物少许,盖上盖玻片,在高倍镜下观察。优良健壮的酵母菌,应形态整齐均匀,表面平滑,细胞质透明均一。年幼健壮的酵母细胞内部充满细胞质;老熟的细胞出现液泡,呈灰色,折光性较强;衰老的细胞中液泡多,颗粒性贮藏物多,折光性强。 2. 死亡率检查 方法同上,可用水浸片法,也可用血球计数板法。酵母细胞用0.025%美兰水溶液染色后,由于活细胞具有脱氢酶活力,可将兰色的美兰还原成无色的美白,因此染不上颜色,而死细胞则被染上兰色。 一般新培养酵母的死亡率应在1%以下,生产上使用的酵母死亡率在3%以下。 3. 出芽率检查 指出芽的酵母细胞占总酵母细胞数的比例。随机选择5个视野,观察出芽酵母细胞所占的比例,取平均值。一般生长健壮的酵母在对数生长阶段出芽率可达60%以上。 4. 凝集性试验 对下面发酵来说,凝集性的好坏牵涉到发酵的成败。若凝集性太强,酵母沉降过快,发酵度就太低;若凝集性太弱,发酵液中悬浮有过多的酵母菌,对后期的过滤会造成很大的困难,啤酒中也可能会有酵母味, 凝集性可通过本斯试验来确证:将1g酵母湿菌体与10mL pH4.5的醋酸缓冲液混合,20?平衡20分钟,加至带刻度的锥形离心管内,连续20分钟,每隔1分钟记录沉淀酵母的容量。实验后,检查pH是否保持稳定。 50 一般规定10分钟时的沉淀酵母量在1.0mL以上者为强凝集性,0.5mL以下者为弱凝集性。 5. 死灭温度检测 死灭温度可以作为酵母菌种鉴别的一个重要指标,一般说来,培养酵母的死灭温度在52~53?之间,而野生酵母或变异酵母的死灭温度往往较高。 温度试验范围一般为48~56?,温度间隔为1或2?,在已灭菌的麦汁试管中(内装5mL 12%麦汁)接入培养24小时的发酵液0.1mL,放于恒温水浴内,每一样品做3个平行试验,并在另一同样的试管中放入温度计,待温度计达到所需温度时开始计时,保持10分钟后,置冷水中冷却,25?培养5~7天,不能发酵的温度即为死灭温度。 6(子囊孢子的产生试验 子囊孢子的产生试验也是酵母菌种鉴别的一个重要指标。一般说来,培养酵母不能形成子囊孢子,而野生酵母较易形成子囊孢子。 将酵母菌体接种于醋酸钾培养基上,25?培养48小时后,用显微镜检查子囊孢子产生情况。 7. 发酵性能测定 酵母的发酵度反映酵母对各种糖类的发酵情况,有些酵母不能发酵麦芽三糖,发酵度就低,有些酵母甚至能发酵麦芽四糖或异麦芽糖,发酵度就高。 将150mL麦汁盛放于250mL三角烧瓶中,灭菌,冷却后加入泥状酵母1g,置25?温箱中发酵3~4天,每隔8小时摇动一次。发酵结束后,滤去酵母,蒸出乙醇,添加蒸馏水至原体积,测比重(见实验十)。 (1)外观发酵度,(P - m)/P ×100, 式中 P——发酵前麦芽汁浓度 m——发酵液外观浓度(不排除乙醇) (2)实际发酵度,(P - n)/P ×100,, ? n——发酵液的实际浓度(排除乙醇后) 一般外观发酵度应为66~80%,真正发酵度为55~70% 51 说明:啤酒酵母主要有两类: (1)上面发酵啤酒酵母:进行上面发酵,发酵温度相对较高(15~20?),发酵结束后,大部分酵母浮在液面。例如英国著名的淡色爱尔啤酒(A1e),司陶特(Stout)黑啤酒等。 (2)下面发酵啤酒酵母:进行下面发酵,发酵温度在10?左右,发酵结束后,大部分酵母沉于容器底部。例如捷克的比尔森(Pilsen)啤酒,德国的幕尼黑啤酒和多特蒙德啤酒,丹麦的嘉士伯啤酒等,我国的啤酒多属于此类型。 实验四 啤酒酵母的扩大培养 一、实验目的:学习酵母菌种的扩大培养方法,为实验室啤酒发酵准备菌种。 二、实验原理:在进行啤酒发酵之前,必须准备好足够量的发酵菌种。在啤酒 7发酵中,接种量一般应为麦芽汁量的10%(使发酵液中的酵母量达1×10个酵母/mL),因此,要进行大规模的发酵,首先必须进行酵母菌种的扩大培养。扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母,另一方面是使酵母由最适生长温度(28?)逐步适应为发酵温度(10?)。 三、实验器材:恒温培养箱,生化培养箱,显微镜等。 8四、实验步骤:本次实验拟用60升麦芽汁,因此应制备6000 mL含1×10个酵母/mL的菌种,以每班10个组计算,每个组应制备约600 mL菌种。建议流程如下: ?,天282 菌种扩大: 麦汁斜面菌种?麦汁平板——?镜检,挑单菌落3个,接种 50mL麦汁试管(或三角瓶) —?550mL麦汁三角瓶—?计数备用。 ?,天?,天202152 每天摇动次每天摇动次33 1 培养基的制备 取协定法制备的麦芽汁滤液(约400 mL),加水定容至约600 mL,取50 mL装入250 mL三角瓶中,另550 mL至1000 mL三角瓶中,包上瓶口布后, 52 0.05 Mpa灭菌30分钟。 2 菌种扩大培养 按上面流程进行菌种的扩大培养(斜面活化菌种由教师提供)。注意无菌操作。 五、注意事项:灭菌后的培养基会有不少沉淀,这不影响酵母菌的繁殖。若要减少沉淀,可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。 六、思考题:菌种扩大过程中为什么要慢慢扩大,培养温度为什么要逐级下降。 实验五 小型啤酒酿造设备介绍及发酵罐的空消 一、实验目的: 熟悉啤酒酿造工艺流程,对发酵罐进行空消,为发酵作好准备。 二、实验原理:啤酒酿造包括麦芽粉碎、麦汁糖化、麦醪过滤、麦汁煮沸、麦汁冷却及啤酒发酵等几个过程。啤酒发酵是纯种发酵,必须先对空的发酵罐进行灭菌处理。 三、实验器材:粉碎机、糖化煮沸锅、过滤沉淀槽、发酵罐、制冷机、板式换热器等 四、工艺流程简介: 啤酒发酵的工艺流程见图3-2-7 糖化煮沸锅,过滤槽、发酵罐的结构图见3-2-8 五、实验步骤: 1. 熟悉各项设备; 2. 清洗各项设备; 3. 在回旋沉淀槽、板式换热器、发酵罐中通入蒸汽,消毒30分钟。 4. 待各项设备使用结束后,应及时进行清洗灭菌。 53 实验六 麦芽汁的制备 一、实验目的: 熟悉麦芽汁的制备流程,为啤酒发酵准备原料。 二、实验原理:麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。由于麦芽的价格相对较高,再加上发酵过程中需要较多的糖,因此目前大多数工厂都用大米做辅料。 三、实验器材:在糖化车间一般有四种设备:糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅,本实验由于受条件限制,只能采用单式设备,即将糊化锅、糖化锅和麦汁煮沸锅合而为一。 四、实验步骤: 1. 糖化用水量的计算 糖化用水量一般按下式计算: W=A(100—B)/B 式中B为过滤开始时的麦汁浓度(第一麦汁浓度) A为100Kg原料中含有的可溶性物质(浸出物重量百分比) W为100Kg原料(麦芽粉)所需的糖化用水量(升)。 例:我们要制备60升10度的麦芽汁,如果麦芽的浸出物为75%,请 问需要加入多少麦芽粉, 因为W=75(100—10)/10=675升 即100Kg原料需675升水,则要制备60升麦芽汁,大约需要添 加10Kg的麦芽和60升左右的水(不计麦芽溶出后增加的体 积)。 2. 糖化 糖化是利用麦芽中所含的酶,将麦芽和辅助原料中的不溶性高分子物质,逐步分解为可溶性低分子物质的过程。制成的浸出物溶液就是麦芽汁。 54 传统的糖化方法主要有两大类, (1)煮出糖化法:利用酶的生化作用及热的物理作用进行糖化的一种方法。 (2)浸出糖化法:纯粹利用酶的生化作用进行糖化的方法。 本实验采用浸出糖化法。推荐使用如下流程: 35~37?,保温30分钟--?50~52? 60分钟--?65? 30分钟(至碘液 反应基本完全)--?76~78? 送入过滤槽。 3. 麦汁过滤 将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开,以得到澄清麦汁的过程。由于过滤槽底部是筛板,要借助麦糟形成的过滤层来达到过滤的目的,因此前30分钟的滤出物应返回重滤。头号麦汁滤完后,应用适量热水洗糟,得到洗涤麦汁。 4. 麦汁煮沸 将过滤后的麦汁加热煮沸以稳定麦汁成分的过程。此过程中可加入酒花(一种含苦味和香味的蛇麻之花,每100升麦汁中添加约200克)。 煮沸的具体目的主要有:破坏酶的活性;使蛋白质沉淀;浓缩麦汁;浸出酒花成分;降低pH;蒸出恶味成分;杀死杂菌;形成一些还原物质。 添加酒花的目的主要有:赋予啤酒特有的香味和爽快的苦味;增加啤酒的防腐能力;提高啤酒的非生物稳定性。 将过滤的麦汁通蒸汽加热至沸腾,煮沸时间一般控制在1.5~2小时,蒸发量达15~20%(蒸发时尽量开口,煮沸结束时,为了防止空气中的杂菌进入,最好密闭)。 5. 回旋沉淀及麦汁预冷却: 将煮沸后的麦汁从切线方向泵入回旋沉淀槽,使麦汁沿槽壁回旋而下,借以增大蒸发表面积,使麦汁快速冷却,同时由于离心力的作用,使麦汁中的絮凝物快速沉淀的过程。 6. 麦汁冷却 将回旋沉淀后的预冷却麦汁通过薄板冷却器与冰水进行热交换,从而使麦汁冷却到发酵温度的过程。 7.设备清洗 55 由于麦芽汁营养丰富,各项设备及管阀件(包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器)使用完毕后,应及时用洗涤液和清水清洗,并蒸汽杀菌。 五、注意事项: 1. 若加热、煮沸过程中将蒸汽直接通入麦汁中,则由于蒸汽的冷凝。麦汁量会增加,因此最好用夹套加热的方法。 2. 麦汁煮沸后的各步操作应尽可能无菌,特别是各管道及薄板冷却器应先进行杀菌处理。 六、思考题:麦芽粉碎程度会对过滤产生怎样的影响, 实验七 糖度的测定 一、实验目的: 学习用糖锤度计测定糖度的方法。 二、实验原理:麦汁的好坏,将直接关系到啤酒的质量。工业上一般根据啤酒品种的不同来制造不同类型的麦芽汁,因此及时分析麦芽汁的质量,调整麦芽汁制造工艺显得尤为重要。麦汁的主要分析项目有:麦汁浓度、总还原糖含量、氨基氮含量、酸度、色度、苦味质含量等。一般分析项目应在麦汁冷却30分钟后取样。样品冷却后,以滤纸过滤,滤液放于灭菌的三角瓶中,低温保藏。全部分析应在24小时内完成。 为了调整啤酒酿制时的原麦汁浓度,控制发酵的进程,常常在麦汁过滤后、发酵过程中用简易的糖锤度计法测定麦汁的浓度。 现对糖锤度计这一简单的玻璃仪器作一介绍。 糖锤度计即糖度表,又称勃力克斯比重计。这种比重计是用纯蔗糖溶液的重量百分数来表示比值,它的刻度称为勃力克斯刻度(Brixsale,简写BX)即糖度,规定在20?使用,BX与比重的关系举例如下(20?): 比 重 BX 1.00250 0.641 56 1.01745 4.439 1.03985 9.956 它们之间有公式可换算,同一溶液若测定温度小于20?,则因溶液收缩,比重比20?时要高。若液温高于20?则情况相反。不在20?液温时测得的数值可从附表中查得20?时的糖度。我们说某溶液是多少Brix值,或多少糖度,应是指20?的数值。若是在20?以外用糖度表得数值,应加温度说明(显然,如测纯蔗糖溶液,只有在20?液温测得的数值是真正表示了含蔗糖的重量百分数)。 Plato是一种与BX相同的表示比重的刻度,也以在20?时纯蔗糖溶液的重量百分数表示。很明确,如3.9 plato就是指20?时的数值,没有(例如)13?时多少plato的含糊叫法,因为只有勃力克斯比重计,没有plato比重计,所以不存在各种温度用plato比重计去测定的情况,所以它纯粹是一种刻度,一种标准而已。 麦汁浓度常用BX表示,有时也用plato表示。换算举例: 在11?液温用糖表读得啤酒主发酵液为4.2糖度,问20?的糖度为多BX,多少 plato,查表:观测糖锤度温度校正表,11?时的4.2糖度应减去0.34得3.86,即20?时为3.86BX,亦即3.86plato。 巴林比重计:含义与勃力克斯比重计相同,但规定在17.5?使用,而不是在20?使用。 糖度表本身作为产品允许出厂误差为0.2BX,放在啤酒发酵液中指示时,由于CO上升的冲力使表上升,而读数偏高,故刚从发酵容器取出的样品须过2 半分钟待CO逸走后再读数,糖度表一直放在发酵液中作长期观测时,不读数2 时应设法使其全部没入发酵液中,否则浮在液面的泡盖物质会干结在表上,造成明显的读数偏差。 三、实验器材:糖锤度计 四、实验步骤:取100mL麦汁或除气啤酒,放于100mL量筒中,放入糖锤度计,待稳定后,从糖锤度计与麦汁液面的交界处读出糖度,同时测定麦汁温度,根据校准值,计算20?时的麦汁糖度。若糖度较低,糖度计不能浮起来,可多加一些麦汁,直至糖度计浮在液体中。 57 表3-2-6 糖锤度与温度校正表(部分) 1 Bx 2 Bx 3 Bx 4 Bx 5 Bx 6 Bx 7 Bx 8 Bx 9 Bx 10 Bx 11 Bx 12 Bx 温度 0.20 0.20 0.2 0.21 0.22 0.22 0.23 0.23 0.24 0.24 0.24 0.25 15? 0.17 0.17 0.18 0.18 0.18 0.18 0.19 0.19 0.20 0.20 0.20 0.21 16? 0.13 0.13 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.15 0.15 0.15 0.15 0.16 17? 0.09 0.09 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 18? 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 19? - - - - - - - - - - - - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20? + + + + + + + + + + + + 0.04 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 21? 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 22? 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 23? 0.21 0.21 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.23 0.23 0.23 0.23 0.23 24? 0.27 0.27 0.28 0.28 0.28 0.28 0.29 0.29 0.30 0.30 0.30 0.30 25? 0.33 0.33 0.34 0.34 0.34 0.34 0.35 0.35 0.36 0.36 0.36 0.36 26? 0.40 0.40 0.41 0.41 0.41 0.41 0.41 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 27? 0.46 0.46 0.47 0.47 0.47 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.49 0.50 28? 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 29? 0.61 0.61 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.63 0.63 0.63 0.64 0.64 30? 0.69 0.69 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.71 0.71 0.71 0.72 0.72 31? 0.76 0.77 0.77 0.78 0.78 0.78 0.78 0.79 0.79 0.79 0.80 0.80 32? 58 五、注意事项:糖锤度计易碎,使用时要格外小心 六、思考题:试比较勃力克斯与plato的异同。 实验八 啤酒主发酵 一、实验目的:学习啤酒主发酵的过程,掌握酵母发酵规律。 二、实验原理:啤酒主发酵是静止培养的典型代表。是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中,在一定温度下培养的过程。由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物,先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长,然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。显然,同样体积的液体培养基用粗而短的容器盛放比细而长的容器氧更容易进入液体,因而前者降糖较快(所以测试啤酒生产用酵母菌株的性能时,所用液体培养基至少要1.5米深,才接近生产实际)。定期摇动容器,既能增加溶氧,也能改善液体各成份的流动,最终加快菌体的生长过程。这种有酒精产生的静止培养比较容易进行,因为产生的酒精有抑制杂菌生长的能力,容许一定程度的粗放操作。由于培养基中糖的消耗,CO与酒精的产生,比重不断下2 降,可用糖度表监视。若需分析其他指标,应从取样口取样测定。 三、实验器材:带冷却装置的发酵罐(50L,100L),若无发酵装置,可将玻璃缸放于生化培养箱中进行微型静止发酵。 四、实验步骤: 将糖化后冷却至10?左右的麦芽汁送入发酵罐,接入酵母菌种(实验四,共约5升),然后充氧,以利酵母菌生长,同时使酵母在麦汁中分散均匀(充氧,即通入无菌空气,也可在麦汁冷却后进行,一般温度越低,氧在麦汁中的溶解度越大),待麦汁中的溶解氧饱和后,让酵母进入繁殖期,约20小时后,溶解氧被消耗,逐渐进入主发酵。 由于发酵罐密闭,很难看清发酵的整个过程,建议一个组在1000 mL玻璃缸中进行啤酒主发酵小型试验。具体方法如下: 1、 洗标本缸,缸口用8层纱布包扎后,进行高压灭菌; 2、 将协定法糖化得到的麦汁,加水至600 mL,再加葡萄糖使糖度达到10 Bx,灭菌,冷却后摇动充氧,沉淀,将上清液以无菌操作方式到入已灭菌的标本缸中。 59 3、 将50mL酵母菌种接入,在10?生化培养箱中发酵,每天观察发酵情况。 4、 主发酵: 10?,7天?至4.0 plato时结束(嫩啤酒)。一般主发酵整个过程分为酵母繁殖期,起泡期、高泡期、落泡期和泡盖形成期等五个时期。仔细观察各时期的区别。 主发酵测定项目 接种后取样作第一次测定,以后每过12或24h测1次直至结束。全部数据叠画在1张方格纸上,纵坐标为7个指标,横坐标为时间。共测定下列几个项目: a、糖度(用糖度表测,并换算成plato); b、细胞浓度、出芽率、染色率; c、酸度 d、α-氨基氮 e、还原糖 f、酒精度 g、pH h、色度 I、浸出物浓度 J、双乙酰含量 6、作业要求 ?. 画出发酵周期中上述10个指标的曲线图,并解释它们的变化。 ?. 记下操作体会与注意点 附:发酵液的取样方法 若在发酵罐中发酵,可从取样开关处直接取样(先弃去少量发酵液)。 若无取样开关,可用一灭过菌的乳胶管,深入发酵池面下20cm处,用虹吸法使发酵液流出,,弃去少量先流出的发酵液,然后用一清洁干燥的三角瓶接取发酵液作样品。 60 五、注意事项:除少数特殊的测定项目外,应将发酵液在两干净的大烧杯中来回倾到50次以上,以除去CO,再经过滤后,滤液用于分析。分析工作应尽快2 完成。 实验九 总还原糖含量的测定(斐林试剂法) 一、实验目的:学习用斐林试剂测还原糖的方法, 二、实验原理:斐林试剂由甲、乙液组成,甲液为硫酸铜溶液,乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙溶液分开贮存,测定时才等体积混合,混合后,硫酸铜与氢氧化钠反应,生成氢氧化铜沉淀: 2Na0H十CuS0 ——?Cu4(OH)?十NaSO 224 氢氧化铜因能与酒石酸钾钠反应形成络合物而使沉淀溶解。酒石酸钾钠铜络合物中的二价铜是一个氧化剂,在氧化醛糖和酮糖(合称总还原糖)的同时,自身被还原成一价的红色氧化亚铜沉淀:反应终点用美蓝(亚甲基蓝)来指示。由于美蓝的氧化能力较二价铜弱,故待二价铜全部被还原糖还原后,过量一滴还原糖立即使美蓝还原成无色的美白。 三、实验器材与试剂: 电炉,滴定管等 (1)斐林溶液 甲液:称取3.4939g结晶硫酸铜(CuS0?5H0),溶于50mL水中,如有不溶物须42 过滤。 乙液:称取13.7g酒石酸钾钠,5g NaOH,溶于50mL水中,若有沉淀过滤即可。 (2)0.2,标准葡萄糖液: 精确称取于105?烘至恒重的分析纯葡萄糖0.5000g,用水溶解后,加2.5mL浓盐酸,定容成至250mL。 (3) 1,美蓝指示剂: 0.5g美蓝溶于50mL蒸馏水中。 四、实验步骤 1.斐林溶液的标定 由于试剂的纯度不同,配制时称量、定容等有误差,各人所配的斐林试剂 61 氧化能力会有差异,因此有必要对斐林溶液进行校准。配制准确时,斐林甲、乙液各5mL可氧化25mL 0.2,标准葡萄糖溶液。 ?预滴定:准确吸取斐林甲、乙液各5mL,放入250mL锥形瓶中,加水约20mL,并从滴定管加入约24mL 0.2,标准葡萄糖溶液(如果斐林甲、乙液配制非常精确,从理论上说,应消耗25mL 0.2,标准葡萄糖溶液,故先加24mL),将锥形瓶置电炉上加热煮沸,维持沸腾2分钟,加入1,美蓝指示剂2滴,在沸腾状态下,以每两秒1滴的速度滴入0.2,标准葡萄糖溶液,至溶液刚由蓝色变为鲜红色为止。后滴定操作应在1分钟内完成,整个煮沸时间应控制在3分钟之内。记下总耗糖量V。 ?正式滴定:与预滴定基本相同,只是用(V-1)mL标准葡萄糖代替24mL葡萄糖液,最后在1分钟内滴定完成。 2.试样的滴定 ?稀释:将样品除气后,进行适当稀释,以期用15~50mL(最好20~30mL)稀释液使滴定完成。一般麦汁稀释50倍左右,啤酒主酵液稀释20倍左右。 ?滴定:基本同上,也分预滴定和正式滴定。只不过用样品稀释液代替标准葡萄糖液,由于预滴定时不知道需要多少毫升稀释液,因此误差较大。正式滴定时先加入比预滴定少1mL的稀释液。正式滴定至少进行2次。 计算总还原糖量,以100 mL样品中含有的葡萄糖克数来表示 五、注意事项: (1) 指示剂美蓝本身具有弱氧化性,要消耗还原糖(所以每次用量应保持一致。 (2) 次甲基蓝被还原为无色后,易被空气氧化又显蓝色,所以滴定过程应保持沸腾状态,使瓶内不断冒出水蒸汽,以防空气进入。 (3) 反应过程中不能摇动锥形瓶,沸腾已可使溶液混匀。 (4) 测定时须严格控制反应液体积,以保持一致的酸碱度。因此要控制电炉火力及滴定速度。 六、思考题:为什么要进行预滴定, 实验十 α–氨基氮含量的测定 62 一、实验目的:学习α–氨基氮含量的测定方法,控制麦汁或啤酒质量。 二、实验原理:α–氨基氮为α–氨基酸分子上的氨基氮。水合茚三酮是一种氧化剂,可使氨基酸脱羧氧化,而本身被还原成还原型水合茚三酮。还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应,生成蓝紫色缩合物,颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比,可在570nm下比色测定。 三、实验器材与试剂:分光光度计,电炉等 (1)显色剂 称取10g NaHPO?12HO ,6g KHPO,0.5g水合茚三酮,0.3g果24224 糖,用水溶解并定容至100mL(pH 6.6~6.8),棕色瓶低温保存,可用两周。 (2)碘酸钾稀释液 溶0.2g碘酸钾于60mL水中,加40mL 95,乙醇。 (3)标准甘氨酸贮备溶液 准确称取0.1072g甘氨酸,用水溶解并定容至100 mL,0?保存。用时100倍稀释。 四、实验步骤 (1)样品稀释 适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL(麦汁一般稀释100倍,啤酒50倍,啤酒应先除气)。 (2)测定 取9支10mL比色管,其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液,另3支各吸入2mL试样稀释液,剩下3支吸入2mL蒸馏水。然后各加显色剂1 mL,盖玻塞,摇匀,在沸水浴中加热l 6分钟。取出,在20?冷水中冷却20分钟,分别加5mL碘酸钾稀释液,摇匀。在30分钟内,以水样管为空白,在570nm波长下测各管的光密度。 计算: α–氨基氮含量(μg/mL)=(样品管平均O.D./标准管平均O.D.)×2×稀释倍数 说明:式中 (样品管平均O.D./标准管平均O.D.):表示样品管与标准管之间的α– 氨基氮之比; 2:标准管的α–氨基氮浓度(μg/mL),即(0.1072×14/75)×100; 五、注意事项: (1)必须严防任何外界痕量氨基酸的引入,所用比色管必须仔细洗涤,洗净后 63 的手只能接触管壁外部,移液管不可用嘴吸。 (2)测定时加入果糖作为还原性发色剂,碘酸钾稀释液的作用是使茚三酮保持氧化态,以阻止进一步发生不希望的生色反应。 (3)深色麦汁或深色啤酒应对吸光度作校正:取2mL样品稀释液,加1mL蒸馏水和5mL碘酸钾稀释液在570n m波长下以空白做对照测吸光度,将此值从测定样品吸光度中减去。 一、 思考题:啤酒色泽是否会对结果产生影响, 附:分光光度计的使用:现以SP-2000UV紫外可见分光光度计为例介绍使用方法。 a) 接通电源,预热20分钟,使仪器进入热稳定状态,仪器开始自检; b) 自检结束后,仪器自动停留在546nm处,并自动调100%T和0%T, 当仪器显示“546”“100%T”,即进入测试状态; c) 按方式键(MODE),将测试方式设定为吸光度方式,仪器显示 “XXXnm,X.XXXAbs” d) 按波长设置键至所需要波长,如570nm; e) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色杯中,插入比色槽中,盖上样品 室盖; f) 将参比溶液推入光路中,按“100%T”键调整 “0Abs”; g) 将被测溶液推入光路中,读取显示器上的吸光度值; h) 搞好清洁卫生工作。 注意:比色杯贵重,应格外小心。 实验十一 酸度和pH的测定 一、实验目的:掌握酸度和pH的测定方法,监测啤酒发酵的进程。 二、实验原理:总酸是指样品中能与强碱(NaOH)作用的所有物质的总量,用中和每升样品(滴定至pH 9.0)所消耗的1N NaOH的毫升数来表示,但在啤酒发酵液的测定过程中常用中和100mL除气发酵液所需的1N NaOH的毫升数来表示。 啤酒中含有各种酸类约100种以上,生产原料、糖化方法、发酵条件、酵 64 母菌种都会影响啤酒中的酸含量。其中包括挥发性的(甲酸、乙酸),低挥发性的(C、C 、异C、异C、C、C、C 等脂肪酸)和不挥发性的(乳酸,柠34456810 檬酸,琥珀酸,苹果酸以及氨基酸,核酸,酚酸等)各种酸类。适宜的pH和适量的可滴定总酸,能赋于啤酒以柔和清爽的口感;同时这些酸及其盐类也是酒中重要的缓冲物质,有利于各种酶的作用。 由于样品有多种弱酸和弱酸盐,有较大的缓冲能力,滴定终点pH变化不明显,再加上样品有色泽,用酚酞做指示剂效果不是太好,最好采用电位滴定法。 三、实验器材与试剂:自动电位滴定仪,或普通碱式滴定管,pH计。 (1) 0.1 mol/L NaOH 标准溶液(精确至0.0001 mol/L) (2)0.05,酚酞指示剂:0.05g酚酞溶于50%的中性酒精(普通酒精常含有微 量的酸,可用0.1mol/L NaOH溶液滴定至微红色即为中性酒精)中,定容至 100mL。 四、实验步骤 1(酸度测定 取50mL除气发酵液,置于烧杯中,加入磁力搅拌棒,放于自动电位滴定仪上,插入pH探头,逐滴滴入0.1 mol/L NaOH 标准溶液,直至pH 9.0,记下耗去的NaOH毫升数。 若无自动电位滴定仪,可用下述酸碱滴定方法。 取5mL除气发酵液,置于250mL三角瓶中,加50mL蒸馏水,再加1滴酚汰指示剂,用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色(不可过量)经摇动后不消失为止,记下消耗的氢氧化钠溶液的体积VmL, 计算 总酸(1 mol/L NaOH 毫升数,100mL样品)= 20MV 式中 M为 NaOH的实际摩尔浓度,V为消耗的氢氧化钠溶液的体积 2(pH测定 现以PHS-3C型精密pH计为例来说明pH的测定方法。 PHS-3C型pH计是一种精密数字显示pH计,它采用3位半十进制LED数字 65 显示。在使用前应在蒸馏水中浸泡24小时。接通电源后,先预热30分钟,然后进行标定。一般说来,仪器在连续使用时,每天要标定一次。 (1) 选择开关旋至pH档; (2)调节温度补偿至室温; (3)把斜率调节旋纽顺时针旋到底(即调到100%位置) (4)将洗净擦干的电极插入pH6.86的缓冲液中,调节定位旋纽至6.86; (5)用蒸馏水清洗电极,擦干,再插入pH4.00的标准缓冲液中,调节斜 率至pH4.00; (6)重复(4),(5),直至不用再调节定位和斜率两旋纽为止。 (7)清洗电极,擦干,将电极插入发酵液中,摇动烧杯,使均匀接触,在 显示屏中读出被测溶液的pH值。 (8)关闭电源,清洗电极,并将电极保护套套上,套内应放少量补充液以 保持电极球泡的湿润,切忌浸泡于蒸馏水中。 五、注意事项 发酵液中的二氧化碳必须彻底去除。 0.1mol/L NaOH必须经过标定,保留4位有效数。 六、思考题:酸碱滴定时为什么要用水稀释,水的酸碱度对滴定结果有什么影响, 实验十二 比重的测定 一、实验目的:了解比重的测定方法,监测发酵过程中浸出物浓度的变化。 二、实验原理:在一定温度下,各种物质都有一定的比重。当物质纯度改变时,比重也随着改变,故测定比重可检验物质的纯度或溶液的浓度。如在啤酒发酵中,随着糖分的消耗、酒精和CO的产生,比重会逐渐下降,因此可通过2 测定发酵液的比重来了解发酵过程。 66 溶解于水中的固体物质称为固形物,以重量百分浓度表示。在啤酒发酵液中,固形物的含量常以蔗糖的重量百分比来表示。但是发酵液固形物还包括许多非糖成分,这些非糖成分对溶液比重的影响与蔗糖不一样,但为了方便起见,可假定非糖物质对溶液比重的影响程度和蔗糖相等。因此,根据比重查知的固形物含量实际上只是一个近似值。 麦汁和啤酒发酵液样品20?的比重规定为:在空气中,20?样品与同体积20?水的重量之比值。 三、实验仪器:测定比重常用的是比重瓶和比重计。比重计方便,但精确度低(见实验四),比重瓶精确,但测定很费时。比重瓶有多种的形状,常用的规格为25mL,比较好的一种是带有特制温度计并具有磨口帽小支管的比重瓶(见图)。比重以相同温度下,同体积的溶液和纯水之间的重量比来表示。 比重瓶示意图 四、实验步骤: (1)空瓶称重:将比重瓶洗干净后,吹干或低温烘干(可用少量酒精或乙醚洗涤),冷却至室温,精确称重至0.1mg。 (2)称水重:将煮沸30分钟并冷却至15~18?的蒸馏水装满比重瓶 (注意瓶内不要有气饱)。装上温度计。立即浸入20?0.1?的恒温水浴中,让瓶内温度计 67 在20?下保持20分钟,取出比重瓶用滤纸吸去溢出支管外的水,立即盖上小帽,室温下平衡温度后,擦干瓶壁上的水,精确称重。 (3)样品称重:倒出蒸馏水,用少量除气样品洗涤后,加入冷却至15~19?的样品,按(2)测得样品重量。 (4)比重计算: 比重瓶和样品重 — 空瓶重 样品比重 = —————————————— 比重瓶和蒸馏水重 — 空瓶重 (5)查表:查阅比重-浸出物对照表。 啤酒外观浓度和实际浓度的测定 成品啤酒或发酵液中所含的浸出物的重量百分数称为浓度。由于啤酒和发酵液中有—部分酒精,酒精比水轻,故采用比重法测得的浓度,要稍低于实际浓度,习惯上称为外观浓度。将酒精分和CO除去后测得的浓度称为实际浓2 度。因此实际浓度较为准确,并可以此来计算原麦芽汁浓度。 (1) 外观浓度的测定:同上。 (2) 实际浓度的测定:在普通天平上用干燥的烧怀称取已除CO的发酵液2或啤酒样品100.0g,置80?水浴中蒸发酒精,蒸至原体积的1,3时,冷却,加蒸馏水至内容物100.0g,充分混匀,用比重瓶准确测定20?时的比重,查表求得实际浓度。加热过程中可能有蛋白质沉淀,测定比重时不必滤出。有时为简化操作,常将测定酒精分时蒸馏下的残液加水至原重量,作测定实际浓度之用(见实验十)。该法由于沸腾时间较长,对测定结果有一定影响。 我国部颁标准规定:11度啤酒实际浓度不低于3.9,,12度啤酒不低于4.0,。 表3-2-7 比重-浸出物浓度对照表(部分) 比重 浸出物 比重 浸出物 比重 浸出物 比重 浸出物 1.0120 3.067 1.0130 3.331 1.0140 3.573 1.0150 3.826 1.0160 4.077 1.0170 4.329 1.0180 4.580 1.0190 4.830 68 1.0200 5.08 1.0210 5.330 1.0220 5.580 1.0230 5.828 1.0240 6.077 1.0250 6.325 1.0260 6.572 1.0270 6.819 1.0280 7.066 1.0290 7.312 1.0300 7.558 1.0310 7.803 1.0320 8.048 1.0330 8.293 1.0340 8.537 1.0350 8.781 1.0360 9.024 1.0370 9.267 1.0380 9.509 1.0390 9.751 1.0400 9.993 1.0410 10.234 1.0420 10.475 1.0430 10.716 1.0440 10.995 1.0450 11.195 1.0460 11.435 1.0770 11.673 注:比重为20?时测得,浸出物指100克样品中的克数。 五、注意事项: 1、 比重瓶易碎,请格外小心,特别是小帽。 2、 要檫干比重瓶外壁,特别是连接处的水分 六、思考题:若无20?恒温水浴,怎样尽可能测准比重, 实验十三 酒精度的测定及原麦汁浓度的计算 一、实验目的:掌握酒精含量的测定方法,监测啤酒质量 二、实验原理:用小火将发酵液或啤酒中的酒精蒸馏出来,收集馏出液,测定其比重,根据比重-酒精度对照表,可查得酒精含量。 三、实验器材:电炉,调压变压器,铁架台,500mL锥形瓶,冷凝管,100mL量筒或容量瓶。 四、实验步骤: 1、酒精度的测定 (1) 在已精确称重至0.05g的500mL三角烧瓶中,称取l00.0g除气啤酒,再加50mL水, (2) 按上冷凝器,冷凝器下端用一已知重量的100mL容量瓶或量筒接收馏出液。若室温较高,为了防止酒精蒸发,可将容量瓶浸于冷水或冰水中。 69 (3) 开始蒸馏时用文火加热,沸腾后可加强火力,蒸馏至馏出液接近100mL时停止加热。 (4) 取下容量瓶,于普通天平上加蒸馏水至馏出液重100.0g,混匀。 (5) 用比重瓶精确测定溜出液比重。 (6) 查比重和酒精对照表,求得酒精含量。 我国部颁标准规定11度啤酒的酒精含量不低于3.2%,12度啤酒的酒精含量不低于3.5,。 2、实际浓度的测定 (1) 将上述蒸去酒精的500mL三角烧瓶冷却至室温。 (2) 加蒸馏水将蒸馏残液调整至100.0g。 (3) 按实验九测定蒸馏残液在20?时的比重。 (4) 查比重-浸出物对照表,得出实际浓度。 3、原麦芽汁浓度的计算 原麦芽汁浓度是指发酵之前的麦芽汁浓度。生产中为检查发酵是否正常,常根据啤酒的实际浓度来推算原麦汁浓度和发酵度。 根据巴林氏的研究,在完全发酵时,每2.0665g浸出物可生成1g酒精,0.9565g CO和0.11g酵母。若测得啤酒的酒精含量(重量百分比)为A(实际2 浓度为n,则100克啤酒发酵前含有浸出物的克数应为: A×2(0665十n 生成A克酒精,即从原麦汁中减少A ×1.0665克浸出物(CO和酵母沉淀2物)。 要生成100克啤酒,需原麦汁为: (100十A × 1(0665)克 原麦汁浓度P为: P=( A×2(0665十n)/(100十A × 1(0665) 我国部颁标准规定:11度啤酒原麦汁浓度为10.8~11(2,,12度啤酒为11.8~12.2%。 若计算所得的原麦汁浓度与发酵之前的麦汁浓度相符,说明发酵正常; 若计算所得的原麦汁浓度与发酵之前的麦汁浓度不符,说明发酵不正常,可能有野生酵母或细菌污染。 70 4、发酵度的计算 麦芽汁发酵后浸出物减少的百分数称为发酵度。有两种: (1)外观发酵度,(P - m)/P ×100, 式中 P——原麦芽汁浓度 m——啤酒的外观浓度 (2)实际发酵度,(P - n)/P ×100,, ? n——啤酒的实际浓度 浅色啤酒根据其实际发酵度可分为三个类型 低发酵度 : 50,左右。往往使啤酒保存性差。 中发酵度 : 60,左右。较合适。 高发酵度 : 65,左右。较合适。 表3-2-8 比重-酒精度对照表 比重 酒精度 比重 酒精度 比重 酒精度 比重 酒精度 1.0000 0.000 0.9970 1.620 0.9940 3.320 0.9910 5.130 0.9999 0.055 0.9969 1.675 0.9939 3.375 0.9909 5.190 0.9998 0.110 0.9968 1.730 0.9938 3.435 0.9908 5.255 0.9997 0.165 0.9967 1.785 0.9937 3.490 0.9907 5.315 0.9996 0.220 0.9966 1.840 0.9936 3.550 0.9906 5.375 0.9995 0.270 0.9965 1.890 0.9935 3.610 0.9905 5.445 0.9994 0.325 0.9964 1.950 0.9934 3.670 0.9904 5.510 0.9993 0.380 0.9963 2.005 0.9933 3.730 0.9903 5.570 0.9992 0.435 0.9962 2.060 0.9932 3.785 0.9902 5.635 0.9991 0.485 0.9961 2.120 0.9931 3.845 0.9901 5.700 71 0.9990 0.540 0.9960 2.170 0.9930 3.905 0.9900 5.760 0.9989 0.590 0.9959 2.225 0.9929 3.965 0.9899 5.820 0.9988 0.645 0.9958 2.280 0.9928 4.030 0.9898 5.890 0.9987 0.700 0.9957 2.335 0.9927 4.090 0.9897 5.950 0.9986 0.750 0.9956 2.390 0.9926 4.150 0.9896 6.015 0.9985 0.805 0.9955 2.450 0.9925 4.215 0.9895 6.080 0.9984 0.855 0.9954 2.505 0.9924 4.275 0.9894 6.150 0.9983 0.910 0.9953 2.560 0.9923 4.335 0.9893 6.025 0.9982 0.965 0.9952 2.620 0.9922 4.400 0.9892 6.270 0.9981 1.115 0.9951 2.675 0.9921 4.460 0.9891 6.330 0.9980 1.070 0.9950 2.730 0.9920 4.520 0.9890 6.395 0.9979 1.125 0.9949 2.790 0.9919 4.580 0.9889 6.455 0.9978 1.180 0.9948 2.850 0.9918 4.640 0.9888 6.520 0.9977 1.235 0.9947 2.910 0.9917 4.700 0.9887 6.580 0.9976 1.285 0.9946 2970 0.9916 4.760 0.9886 6.645 0.9975 1.345 0.9945 3.030 0.9915 4.825 0.9885 6.710 0.9974 1.400 0.9944 3.090 0.9914 4.885 0.9884 6.780 0.9973 1.455 0.9943 3.150 0.9913 4.945 0.9883 6.840 0.9972 1.510 0.9942 3.205 0.9912 5.005 0.9882 6.910 0.9971 1.565 0.9941 3.265 0.9911 5.070 0.9881 6.980 五、注意事项: 1、 蒸馏时火力不要太旺,最好有调压器调节电压。 2、 测真正浓度时,最好用80?水浴将酒精蒸去。 72 六、思考题:是否可以在馏出液接近90mL时停止蒸馏,如果馏出液大于100mL,会对结果产生怎样的影响, 实验十四 双乙酰含量的测定 一、实验目的:了解双乙酰的测定方法,监测啤酒质量。 二、实验原理:双乙酰(丁二酮)是赋予啤酒风味的重要物质。但含量过大,能使啤酒有一种馊饭味。轻工部部颁标推规定成品啤酒中双乙酰含量,0(2ppm。 双乙酰的测定方法有气相色谱法、极谱法和比色法等等。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法,所以,此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量,结果偏高。但此法快速简便,是轻工部部颁标准规定的方法。 用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来,加邻苯二胺,形成2,3—二甲基喹喔琳,其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸收峰,可进行定量测定。 三、实验仪器与试剂 (1)紫外分光光度计。 (2)双乙酰蒸馏装置(见下图) 73 双乙酰蒸馏装置示意图 1、夹套蒸馏器 2、蒸汽发生器 3、冷凝器 4、25mL容量瓶(或量筒) 5、加样口 6、电炉 (1)4N盐酸 (2)1,邻苯二胺 精密称取分析纯邻苯二胺250.0mg,溶于4N盐酸中,并定容至25mL,贮于棕色瓶中,限当日使用。 (3)消泡剂 有机硅消泡剂或甘油聚醚。 四、实验步骤: (1) 按上图把双乙酰蒸馏器安装好,把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。 (2) 将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下,使出口尖端浸没在水面下,外加冰水冷却。 (3) 加热蒸汽发生器至沸,通汽加热夹套,备用。 (4) 于100mL量筒中加入2~4滴消泡剂,再注入5?左右未除气啤酒100mL。 (5) 待夹套蒸馏器下端冒大汽时,打开进样口瓶塞,将啤酒迅速注入蒸馏器内,再用约10mL蒸馏水冲洗量筒,同时倒入,迅速盖好进样口塞子,用水封口。 (6) 待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时,将排气夹子夹住,开始蒸馏,到馏出液接近25mL时取下容量瓶,用水定容至25mL,摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。 (7) 分别吸取馏出液10mL于两支比色管中。一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液,另一管不加作空白,充分摇匀后,同时置于暗处放置20~30分钟,然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液,于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖,混匀。 (8) 在335nm波长处,用2cm比色皿以空白作对照测定样品吸光度。 (9) 计算:双乙酰(mg,L),A×1.2 335 五、注意事项: (1) 蒸馏时加入试样要迅速,勿使双乙酰损失。蒸馏要求在3分钟内完成。 (2) 严格控制蒸汽量,勿使泡沫过高,被蒸汽带走而导致蒸馏失败。 (3) 显色反应在暗处进行,否则导致结果偏高。 六、思考题:是否可以用1cm比色杯比色,结果应怎样计算, 实验十五 色度的测定 74 一、实验目的:了解用目视比色法测定啤酒色度的方法,监测发酵液的质量。 二、实验原理:色泽与啤酒的清亮程度有关,是啤酒的感官指标之一。啤酒依色泽可分为淡色、浓色和黑色等几种类型,每种类型又有深浅之分。淡色啤酒以浅黄色稍带绿色为好,给入以愉快的感觉。 形成啤酒颜色的物质主要是类黑精、酒花色素、多酚、黄色素以及各种氧化物,浓黑啤酒中还有多量的焦糖。淡色啤酒的色素主要取决于原料麦芽和酿造工艺,深色啤酒的色泽来源于麦芽,另外也需添加部分着色麦芽或糖色;黑啤酒的色泽则主要依靠焦香麦芽、黑麦芽或糖色所形成。 造成啤酒色深的因素有如下几种:(1)麦芽煮沸色度深,(2)糖化用水pH偏高,(3)糖化、煮沸时间过长(4)洗糟时间过长,(5)酒花添加量大、单宁多,酒花陈旧,(6)啤酒含氧量高((7)啤酒中铁离子偏高。 对淡色啤酒来说,其颜色与稀碘液的颜色比较接近,因此可用稀碘液的浓度来表示。色度的Brand单位就是指滴定到与啤酒颜色相同时100mL蒸馏水中需添加的0.1mol/L碘液的毫升数。 淡色啤酒的色度最好在5~9.5 E.B.C之间,要控制好啤酒的色度,应注意以下几点: (1)选择麦汁煮沸色度低的优质麦芽,适当增加大米用量,使用新鲜酒花,选用软水,对暂硬高的水应预先处理。 (2)糖化时适当添加甲醛,调酸控制pH,尤其煮沸时应控制pH5.2。 (3)严格控制糖化、过滤、麦汁煮沸时间,不得延长,冷却时间宜在60分钟。 (4)防止啤酒吸氧过多,严格控制瓶颈空气含量,巴氏灭菌时间不能太长。 三、实验器材:100mL比色管,白瓷板,吸管等 0.1N 碘标准溶液:经标定,精确至0.0001N。 四、实验步骤: (1) 取2支比色管,一支中加入100mL蒸馏水,另一支中加入100mL除气啤酒发酵液(或麦芽汁,或啤酒),面向光亮处,立于白瓷板上。 (2) 用1mL移液管吸取1.00mL碘液,逐滴滴入装水比色管中,并不断用玻棒 75 搅拌均匀,直至从轴线方向观察其颜色与样品比色管相同为止,记下所消耗的碘液毫升数(准确至小数后第二位)V。 (3) 样品的色度=10NV。 五、注意事项:(1)若用50mL比色管,结果乘以2; (1) 不同样品须在同等光强下测定,最好用日光灯或北部光线,不可在 阳光下测定。 (2) 麦汁应澄清,可经过滤或离心后测定。 六、思考题:对色泽较深的麦汁,应怎样处理, 附表:EBC法与Brand法色度单位的比较(部分) EBC Brand EBC Brand EBC Brand EBC Brand EBC Brand 2.0 0.11 2.5 0.14 3.0 0.17 3.5 0.21 4.0 0.23 4.5 0.27 5.0 0.30 5.2 0.31 5.4 0.32 5.6 0.34 5.8 0.35 6.0 0.36 6.2 0.37 6.4 0.39 6.6 0.40 6.8 0.41 7.0 0.43 7.2 0.44 7.4 0.45 7.6 0.47 7.8 0.48 8.0 0.49 8.2 0.51 8.4 0.52 8.6 0.53 9.0 0.56 9.2 0.58 9.4 0.59 9.6 0.60 10 0.62 12 0.78 14 0.93 16 1.1 18 1.3 20 1.4 实验十六 苦味质的测定 一、实验目的:了解用分光光度计测定苦味质的方法,监测发酵液的质量。 二、实验原理:发酵液或啤酒中苦味物质的主要成分是异α-酸,在酸性条件下可被异辛烷萃取,在275 nm波长下有最大吸收值,可用紫外分光光度计测定。 三、实验器材:紫外分光光度计,离心机,回旋振荡器等 76 试剂:6N HCl:270mL HCl用重蒸馏水稀释至500mL. 异辛烷:光谱级,要求在275nm下的吸光度低于0.010,否则应按下法提纯后再用:在异辛烷中加入1%(w/v)氢氧化钠颗粒,静置过夜,而后在通风柜中蒸馏,注意防火。 四、实验步骤: (1)取5.00mL 20?麦汁或10.00mL除气啤酒(混浊样品须先通过离心澄清),放入35mL离心管中; (2)加入0.5mL 6N HCl和20mL异辛烷,防入2-3个玻璃珠,盖上盖子,在20?回旋振荡器(130转/分钟)中振荡15分钟; (3)3000转/分钟离心3分钟 (4)以异辛烷作对照,在275nm下用1cm石英比色杯测上层清液的吸光度。 计算:苦味质=A*50 (个单位) 275 五、注意事项:(1)异辛烷提纯时,要在通风柜中蒸馏,注意防火,切勿蒸干; (2)啤酒或发酵液应将气除尽。 六、思考题:对浑浊样品是否可通过过滤来澄清, 实验十 二氧化碳含量的测定 一、实验目的:熟悉测定啤酒及发酵液中CO含量的方法。 2 二、实验原理:二氧化碳是赋予啤酒起泡性和杀口力的重要物质,发酵液或啤酒中CO含量的测定方法有压力表法、水银测压计法及电位滴定法等几种。电2 位滴定法是利用CO可被 NaOH吸收生成NaCO这一原理,用HCl来滴定生成23 的NaCO。滴定至pH 8.31时,NaCO转变成NaHCO: 333 NaCO + HCl ?NaHCO + NaCl 33 滴定终点用酸度计来指示。 77 三、实验器材:电位滴定计或附有电磁搅拌器的酸度计。 试剂:0.1mol/L NaOH溶液(不用准确标定)及 0.1mol/L HCl(需用无水NaCO准确标定)。 3 三、 实验步骤 (1) 取冷啤酒或发酵液20.00mL,边搅拌边加至盛有30~40mL NaOH的烧杯中; (2) 将电极浸入溶液中,用0.1mol/L HCl标准溶液滴定至pH 8.31,记录酸用量V1; (3) 取100mL酒样在沸水浴中短时煮沸以赶走CO,冷却后同样取20.00mL,2 用0.1mol/L HCl标准溶液滴定至pH 8.31,记录酸用量V2; (4) 用20.00mL无CO的蒸馏水代替样品,同样滴定至pH 8.31,记录酸用量2 V; (5) 计算:二氧化碳(CO,%)= (V-V1-V2)N×0.044×100?20 2 0.044:每毫摩尔二氧化碳之克数。 四、注意事项 发酵液中的CO在温度高时易蒸发,实验尽可能在低温下进行。特别是在加2 样品时移液管应浸入NaOH溶液中。 实验十六 后发酵 一、实验目的:了解啤酒后发酵的工艺操作特点。 二、实验原理:主发酵结束后的啤酒尚未成熟,称为嫩啤酒,必须经过后发酵过程才能饮用。后发酵在0~2?下利用酵母菌本身的特性去除嫩啤酒的异味,使啤酒成熟。 三、实验步骤 当发酵罐中的糖度下降至4.0~4.5BX时,开始封罐,并将发酵温度降至2?左右,8~12天后,罐压升至0.1Mpa,说明已有较多CO产生并溶入酒中,即可饮2 用。若要酿制更加可口的啤酒,后发酵温度应降低,时间应延长。 如果没有后酵罐,可用下述办法处理。 78 (6) 选取耐压瓶子,清洗,消毒灭菌。 (7) 将嫩啤酒虹吸灌入,装量约为容积的90%,注意不要进入太多氧气。 (8) 盖紧盖子,放于0~2?冰箱中后酵3个月。 四、注意事项 (1) 因后酵会产生大量气体,不能选用不耐压的玻璃瓶,以免危险。 (2) 不要吸入太多氧气,瓶子上端不要留有太多空气,否则啤酒会带严重氧 化味。 五、思考题:酵母凝聚性会对后酵产生怎样的影响, 实验十七 啤酒质量品评 一、实验目的:了解品酒方法,品评各种类型啤酒。 二、实验原理:啤酒是一个成分非常复杂的胶体溶液。啤酒的感官性品质同其组成有密切的关系。啤酒中的成分除了水以外,主要由两大类物质组成:一类是浸出物,另一类是挥发性成分。浸出物主要包括碳水化合物、含氮化合物、甘油、矿物质、多酚物质、苦味物质、有机酸、维生素等;挥发性组分包括乙醇、CO、空气、高级醇类、酸类、醛类,连二酮类等。由于这些成分的不同和2 工艺条件的差别,造成了啤酒感官性品质的异同。所谓评酒就是通过对啤酒的滋味、口感以及气味的整体感觉来鉴别啤酒的风味质量。评酒的要求很高,如统一用内径60mm,高120mm的毛玻璃杯,酒温以10~12?为宜,一般从距杯口3cm处倒入,倒酒速度适中。评酒以百分制计分:外观10分,气味20分,泡沫15分,口味55分。 良好的啤酒,除理化指标必须符合质量标准外,还必须满足以下的感官性品质要求(这些感官特性,只能抽象地加以表达)。 1(爽快。指有清凉感,利落的良好味道。即爽快、轻快、新鲜。 2(纯正。指无杂味。亦表现为轻松、愉快、纯正、细腻、无杂臭味、干净等。 3(柔和。指口感柔和,亦指表现力温和。 4(醇厚。指香味丰满,有浓度,给人以满足感。亦表现为芳醇、丰满、浓 79 醇等。啤酒的醇厚,主要由胶体的分散度决定,因此醇厚性在很大程度上与原麦汁浓度有关。但浸出物低的啤酒有时会比含量高的啤酒口味更丰满,发酵度低的啤酒并不醇厚,而发酵度高的啤酒多是醇厚的(其酒精含量高也参与了醇厚性。泡持性好的啤酒,同时也是醇厚的啤酒。 5(澄清有光泽,色度适中。无论何种啤酒应该澄清有光泽,无混浊,不沉淀。色度是确定酒型的重要指标,如淡色啤酒、黄啤酒、黑啤酒等,可以外观直接分类。不同类型的啤酒有一定的色度范围。 6(泡沫性能良好。淡色啤酒倒入杯中时应升起洁白细腻的泡沫,并保持一定的时间(如果是含铁多或过度氧化的啤酒,有时泡沫会出现褐色或红色。 7(有再饮性。啤酒是供人类饮用的液体营养食品,好的啤酒会让人感到易饮,无论怎么饮都饮不腻。 三、实验器材:啤酒,玻璃杯等 四、实验步骤: (1) 将啤酒冷冻至10~12?; (2) 开启瓶盖,将啤酒自3cm高处缓慢倒入玻璃杯内; (3) 在干净、安静的室内按表3-2-9进行啤酒品评。 表3-2-9 淡色啤酒的给分扣分标准 类别 项目 满分要求 缺点 扣分标准 样品 0 外观10分 透明度5分 迎光检查 清亮透明 清亮透明, 1 光泽略差 无悬浮物 2 轻微失光 或沉淀物 3~4 有悬浮物或沉淀 5 严重失光 0 色泽5分 呈淡黄绿色 色泽符合要求 80 1~3 或淡黄色 色泽较差 4~5 色泽很差 评语 0 泡沫性能 起泡2分 气足,起泡好 气足,倒入杯 中有明显泡沫15分 1 起泡较差 升起 2 不起泡沫 0 形态4分 泡沫洁白 洁白 1 不太洁白 2 不洁白 0 泡沫细腻 细腻 1 泡沫较粗 2 泡沫粗大 0 持久6分 泡沫持久, 持久4min以上 缓慢下落 3~4min 1 2~3min 3 1~2min 5 6 1min以下 0 挂杯3分 挂杯好 杯壁上附有泡 沫 1 略不挂杯 2~3 不挂杯 0 喷酒缺陷 开启瓶盖时, 没有喷酒 无喷涌现象 1~2 略有喷酒 81 3~5 有喷酒 6~8 严重喷酒 评语 0 啤酒香气 酒花香气 有明显的 明显酒花香气 20分 4分 酒花香气 1~2 酒花香不明显 3~4 没有酒花香气 0 香气纯正 酒花香纯正 酒花香气纯正 12分 无生酒花香 1~2 略有生酒花味 3~4 有生酒花味 0 香气纯正 纯正无异香 无异香 1~4 稍有异香味 5~8 有明显异香 0 无老化味 新鲜, 新鲜无老化味 4分 无老化味 1~2 略有老化味 3~4 有明显老化味 评语 0 酒体口味 纯正 应有纯正 口味纯正,无杂味 55分 5分 口味 1~2 有轻微的杂味 3~5 有较明显的杂味 0 杀口力 有二氧化碳 杀口力强 5分 刺激感 1~4 杀口力差 5 没有杀口力 82 0 苦味 苦味爽口 苦味适口,消失快 5分 适宜,无 1 苦味消失慢 异常苦味 2~3 有明显的后苦味 4~5 苦味粗糙 0 淡爽或醇厚 口味淡爽 淡爽,不单调 5分 或醇厚, 0 醇厚丰满 具有风味 1~2 酒体较淡薄 特征 3~5 酒体太淡,似水样 1~5 酒体腻厚 0 柔和协调 酒体柔和、 柔和、爽口、谐调 10分 爽口、谐调, 1~2 柔和、谐调较差 无明显异味 1~2 有不成熟生青味 1~2 口味粗糙 1~2 有甜味、不爽口 1~2 稍有其它异杂味 0 口味缺陷 不应有明显 没有口味缺陷 25分 口味缺陷 1~5 有酸味 (缺陷扣分 1~5 酵母味或酵母臭 原则:各种 1~5 焦糊味或焦糖味 口味缺陷分 1~5 双乙酰味 轻微、有、 1~5 污染臭味 严重三等酌 1~3 高级醇味 83 1~3 情扣分) 异脂味 1~3 麦皮味 1~3 硫化物味 1~3 日光臭味 1~3 醛味 1~3 涩味 评语 总体评价 总计减分 总计得分 五、注意事项: 1、 评酒时室内应保持干净,不允许杂味存在; 2、 品评人员应保持良好心态,不能吸烟,不能吃零食。 附1:啤酒品评训练 (1)稀释比较法:使用冷却的蒸馏水或无杂味的自来水,通入二氧化碳以排除空气,并溶入二氧化碳。将此水加入啤酒中,使之稀释l0%。将稀释的啤酒与末稀释的同一种啤酒装瓶,密封于暗处,存放过夜,使达平衡。然后进行品评。连续3天重复品评,将结果填入表内。 (2)甜度比较:取定量纯蔗糖,全部溶解在一小部分啤酒中,并在不大量损失CO的条件下,与其它大部分啤酒混合,使其含糖浓度为4克,升。事先2 告知有一种是加糖酒,连续品评3天,将结果填入表内。 (3)苦味比较:在一部分啤酒中,加入4ppm溶解于90,乙醇的异α-酸,使呈苦味,并将此处理过的啤酒放置过夜,然后如上所述品评,连续3天,将结果填入表中。 84 附2:评酒员考选办法 (1) 三杯法 三只杯中有两只装入同一种酒,另一杯为不同酒,判断正确得10分,否则得0分,考2次,取平均值。 (2) 五杯对号法 用五杯不同啤酒二次品评,找出相同的酒,正确一对得4分。 (3) 五杯选优排名对号法 基本同上法,增加排序,即品评人员根据判断,排出优劣次序。 (4) 口味特点考评法 要求参评人员指出标准酒样的最突出的一个特点。答对一只酒样得3分,共15分。 (5) 气味特点考评法 参评人员根据嗅觉判断酒样的香气和不良气味,不能饮用样品 实验十八 固定化啤酒发酵 一、实验目的:了解啤酒酵母的固定化方法,尝试用固定化酵母发酵啤酒。 二、实验原理: 分批发酵过程中每次主发酵前都要进行酵母菌种的准备工作,费时费力,如过将酵母细胞固定在某一合适载体上,从理论上将,只要酵母细胞死亡率不太高,就可以一直使用下去。而且,固定化发酵过程中,酵母培养和发酵分开进行,因此可以采用高密度发酵的方法,使发酵周期大大缩短。本实验用海藻酸钙包埋法固定啤酒酵母,在填充式生物反应器中进行分批式发酵。 三、实验器材: 填充式生物反应器或帘式生物反应器,固定化酵母细胞成珠器,海藻酸钠,氯化钙等。 四、实验步骤: 1. 酵母细胞的培养 85 用常规方法培养酵母(见实验四)或用发酵结束后的沉淀酵母,但必须保证酵母活力,死亡率不超过1%。 2. 酵母细胞的浓缩 将酵母细胞离心浓缩,或直接用发酵结束后的酵母泥,加适量无菌水成 91*10个细胞/mL。 3. 固定化凝胶珠的制备 海藻酸钠用无菌水吸涨调匀,通入水蒸汽升温至80?,充分搅拌,冷却至 8室温,加入酵母悬液,使成2%海藻酸钠,10个酵母细胞/mL的溶胶液。经 成珠头滴入2% CaCl水溶液中,固化2小时,无菌水漂洗后可供主发酵用。 2 4. 用固定化酵母凝胶珠进行分批式啤酒发酵 将固定化凝胶珠按5%的比例(接种量,W/V)在填充式生物反应器中进行主发酵,有关操作同实验八。 若要用吸附包埋法固定酵母细胞,在帘式生物反应器中进行分批式啤酒发 8酵,可将用不锈纲丝网加固的纤维织物浸于含10个酵母细胞/mL的2%海藻酸钠溶胶液中,充分吸涨后浸至2% CaCl水溶液中固化2小时,无菌水漂洗后挂2 于帘式生物反应器中进行主发酵。 图:填充式生物反应器示意图 图:帘式生物反应器示意图 主要参考文献 1.管敦仪。啤酒工业手册。轻工出版社。1998。 2.顾国贤。新世纪中国啤酒工业发展展望。酿酒科技,2002(4):28~30 3.刘震东。把脉啤酒产业。酿酒科技,2002(3):105~107 4.吴根福。几个啤酒酵母菌株的性能比较。科技通报,1995(2):107~110 5.吴根福等。使用固定化酵母凝胶珠的分批式啤酒发酵。生命科学论文集。杭州大学出版社,1992:134~139 6.吴根福等。固定化细胞帘式生物反应器用于啤酒发酵的研究。生命科学论文集。杭州大学出版社,1992:207~209 86 87
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