蛋白质的提取与分离

蛋白质提取与制备具体操作方法 1、原料的选择 早年为了研究的方便,尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小,如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料,因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑,注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难,或含量 来源均理想,但分离纯化操作繁琐,反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系,如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶,马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性,对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性,用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时,原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质(本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白)时,不但 使用种属一定的原料,而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异(如饥饿时脂肪和糖类相对减少),采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验,则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分,对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎,使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织,其细胞破坏难 易不一,使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软,作普通匀浆器磨研即 可,肌肉及心组织较韧,需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有:①高速组织捣碎机(转速可达 10000rpm,具高速转动的锋利的刀片),宜用于动物内脏组织的破碎;②玻璃匀浆器(用两 个磨砂面相互摩擦,将细胞磨碎),适用于少量材料,也可用不锈钢或硬质塑料等,两面间 隔只有十分之几毫米,对细胞破碎程度较高速捣碎机高,机械切力对分子破坏较小。小量的 也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取,也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局 部往往生热导致变性或pH显著变化,尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损 失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用,使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15~20℃使之冻固,然后缓慢地融解,如此反复操作,使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化,使结合水冻结产生组织的变性,冰片将细胞膜破碎,使蛋白质可溶化,成为粘稠的浓溶液,但脂蛋白冻结变性。 Ⅱ冷热变替法 将材料投入沸水中,于90℃左右维持数分钟,立即置于冰浴中使之迅速冷却,绝大部分细胞被破坏。Ⅲ超声波法 暴露于9~10千周声波或10~500千周超声波所产生的机械振动,只要有设备该法方便且效果也好,但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。 Ⅳ加压破碎法 加一定气压或水压也可使细胞破碎。 ⑶化学及生物化学方法 Ⅰ有机溶媒法 粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5~10倍量的丙酮,迅速搅拌均匀,可破碎细胞膜,破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性,被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗,经滤纸干燥,如脱氢酶等可保存数月不失去活性。 Ⅱ自溶法 将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下,利用自身的蛋白酶将细胞破坏,使细胞内含物释放出来。比较稳定,变性较难,蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间,需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化,随时要调节pH。自溶温度选在0~4℃,因自溶时间较长,不易控制,所以制备活性蛋白质时较少用。 Ⅲ酶法 与前述的自体融法同理,用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时,它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高,而多易结晶化。1g 菌体加1~10mg溶菌酶,pH6.2~7.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌,虽失去细胞膜,但原形质没有脱出。除溶菌酶外,蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。 表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。此外一些细胞膜较脆弱的细胞,可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。 b、细胞器的分离 制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料,或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子,防止其他细胞组分的干扰,细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离,对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 等学科和技术的发展,对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多,分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA 几乎全部集中在细胞核内。RNA则大部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时,预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后,在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同,沉降于离心管内不同区域,分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状,沉淀分离效果不理想,现一般改用蔗糖、Ficoll(一种蔗糖多聚物)或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。 蛋白质(包括酶)的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。 蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的 水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升; 0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。 影响盐析的因素有: (1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。 (2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。 蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。如细胞色素C属碱性蛋白质,常用稀酸提取,肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质,用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在,选择PH3~6范围对于分离提取是有利的。 (3) 蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。 (4) 盐浓度 等渗盐溶液尤以0.02~0.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应 用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合,也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低,如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L以上氯化钠液提取。总之,只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶,细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH,一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的,需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。 盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 (二)有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内(度为10%,40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一使水溶液的介电常数降低。 介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱,水化程度降低,因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似,与蛋白质争夺水化水,致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点 有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。 (二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。 1)表面活性剂的利用: 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶,也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型(如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等),阳离子型(如氧化苄烷基二甲基铵等)及非离子型(Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60及吐温80)等。非离子型表面活性剂比离子型温和,不易引起酶失活,使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构,己广泛采用胆酸盐处理,两者形成复合物,并带上净电荷,由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时,较喜欢用非离子型表面活性剂。 2)对提取物的保护: 在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶,提取时要注意防止由它引起的水解。前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水解酶的最适PH在3~5或更高些,因在较低PH条件下可降低蛋白质水解酶引起的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状态,不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用,如以丝氨酸为活性中心的酶加二异丙基氟磷酸,以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有机溶剂时也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很大,上述条件均视具体对象而变化。 有一些蛋白含巯基,这些巯基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带入金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA,后者可加入还原剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护,不要使酸基丢失。