桂枝挥发油对TLR2、TLR4基因表达及其信号转导通路的影响（可编辑）

桂枝挥发油对TLR2、TLR4基因表达及其信号转导通路的影响（可编辑） 成都中医药大学 博士学位论文 桂枝挥发油对TLR2、TLR4基因表达及其信号转导通路的影响 姓名:徐世军 申请学位级别:博士 专业:中药学 指导教师:沈映君 20060401 要 摘 炎癍足临昧晰多忽慢性火绢钉的、婴稍理过秘之‘,或引起桃体的防御反应 而被消除,或发炎症失控丽造成机体功能紊乩或器官损害。桂枝楚樟科植物 肉 硅的嫩枝,’。以束要应川“表证”等诸多疾病的防治。现代研究表明炎症 , 韪袭证的厦要病理改变之。,桂技挥发 越杜技抗炎 勺三要订效部位群。课题组讨期研究表明对急性、慢 性、免艘:伤:炎症均“良好的卉抗效粜, 抗炎作用与拮抗炎癌网子生成和 释放、抗氧化损伤等自‘芙。近年来认为炎症就足炎症免疫信号转导紊乱所 致, 信转导圮?人嘱?。本研究爱进行了抗炎作川、对急性肿炎模型 忡组织信号通路天键靶分影啊以及多个炎症信:通路“分对话”靶点 。活性澎嘲的晰。 目的:探讨抗炎作?炎瘾信譬转甘通路三受靶点的关系,揭示 机炎作川的分子信机理,为小约“誓蛛”雕沦提供脱代科学依据。 方法:以敛大鼠急性肺炎等模趔为研究载体,采用灾时荧光定量 技术、聃吲兜隆技术、免疫酶:】《吸附技术及病理组织形态学技术等研究手 段。观 察了抗炎作、对肺炎模型肺组织匀浆、、基 “、? 、.、?一 川表达,. 含蹬以及活性的影响, 从炎任号刖内化、胞内转导、易他入核、炎症棚笑旗凶转求、前炎症因子的 产。和、嗣炎疵信号的分对话等舶度树彳 抗炎作的分‘导信号机 制。 结柴: .抗炎作用研究研究表州,对一二”苯致小鼠.胂胀、醋酸致 小鼠腹腔毛细管通透‘陀,进、约义荣胶致犬鼠足肿胀和敛人鼠急性肺损 伤等急性炎疰均钉娃著的拈执作川。 。对、、表达的影响研究表明,正常 人戳帅组织中『少醚的、、表达,尾静脉注射后 肺组织匀浆 、、表达显著高于空自组., 高、中、低:个刺鞋均可以礁著抑制急性肺炎模型肺组织匀浆中的、.,农哒.。 .?、. .对 含量的影响研究嵌纠,常人鼠 .“、? 含鲢较低,尾静脉射后肺组纵 巾白浆『? 一“、? 含鞋疑籍高审彝【.,高、。、 匀浆,。 .、. 均疆著降低.‘模璎组比 低个剂虢甜.,浆,的. 较仃诌著统汁学意义.或.。 .对.、 含量的影响研究表明,建静脉注射后 .“、儿~ 徘升【终匀浆巾『炎症吲 含麓较空阳组显著增商,两行比较彳『 艟并统汁学意义..除高荆鼓对.影响不显著外,其余静 嚣【.、?一】的含缡均艟蒋低:模型组, :者比有娃著统计学意义 .或.。 含精 .对活性的影响研究表:,人鼠常肺组织叶 为.?./;模,弘维含墩为../,较空『组『芬增 商,具有极旺并的统汁学意义.;商、、低个剂鞋甜【 禽髓均较模,魁组硅籍降低.,彳’定的.醛效天系。 结论: .结合题组河期究成粜,对急性、慢性和免疫损伤雌炎症反应均 聪订砸的拈抗作川,晚叫执炎作川确游。 .埘急。炎模型帅组织小地和农达均钉娃并的 抑制作?、对. .、? 含量增高办订锃并的拈抗效应,嗣时能够 移并抑制漪炎症陶..。、一 的含凝的歹高,况叫对/、炎 弼翁弓转导通路媳仃多荦巴点的抑制或/拈抗作用,不仪可以抑制炎症信呼 的 别内化、纠胞内的转吁、辨似入饮和启动炎症免疫棚荚琏闲的转泵,谢可以 抑 制丽炎珏协的表达、,成和,。或释陂,敞抑制了继发性炎症倒予的产生、: 调, 截断了炎症俯譬的“缎联”放人,抑制炎症的“呼吸爆发”效应。 .能抑制急性肺炎模型肿组?活性,截断或减弱了酪氨酸激酶 信譬转皆通路、通路和信号通路的“分对话”,抑制了炎症反成的 放大。 关键词: 信;,转导途径活性分子对话机理研究 ‘. ?. ’ .、,?. ?. . 、 ;‘’ . .” ‘’啪“。““’ 、九 ‰。?“。 。 . ’ ’ 、。 ’ “ . ’ :.、 ’ .、..: ? ’ : ?. 、.. ? .?. . 、、 、 . ?一;【、?: 、一、.一 . ? . .. . ?,.?. 、. ? : ? . ? ‘ ’ . ’ . .. 、、 ; .、、 . ’.,,、.、 ‘ .、、. ’. . ..??、? .、?一?、 , 一? ’、“、? ’ ’、 . 。, ’ .. .:士 , 曲 / 。 . .主./ ,‘:、 . 、 【.. : , 、 . .、、 . . 二.’ ‘/ , 一“、?一 .、、/, 、 ?. . .?、. .?. 【 ?“, . . ’. . ’ ’ 、、, 、.. . :,’ 、’,、, 划, 成都中医药大学级博士学位论文 英文缩略词表 缩略词 英文全称 中文名称 花生四烯酸 氨苄青霉素 获得性免疫缺陷综合症急性呼吸窘追综合症角叉菜胶 ’ 互补循环域值 . 自细胞分化抗原 环氧化酶变异系数? 趋化因子受体树突状细胞死亡结构域二乙基焦磷酰胶 地塞米松 脱氧核苷三磷酸 ? 酶联免疫吸附试验 一羧基.荧光素 田末自然科学曩叠资助项目?【成都中医药大学级博士学位论文 甘油醛一一磷酸脱氢酶糖基磷脂酰肌醇 “ 热休克蛋白 白细胞介素 一? 白介素受体相关激酶 异丙基一?一硫代半乳糖苷 ? 脂多糖结合蛋白 % 半数致死量 ? ? 内毒素脂多糖亮氨酸重复基序丝裂原激活的蛋白激酶 膜性 . 髓样分化蛋白 一 多脏器功能障碍综合征信使 一 髓样分化蛋白 . 核因子 非甾体类抗炎镇痛药 光密度 病原相关分子模式 ? 磷酸盐缓冲液 固末自然科学基仝资助项目.成柞中医药走学扭博士学住论支 聚合酶链式反应模式识别受体 蛋白酪氨酸激酶反转录 可溶性 系统性炎症反应综合痘 一一受体同源结构域相关蛋白 ? ? 样受体? 样受体 ? 样受体 ? 肿瘤坏死因子一。【 认 ’肿瘤坏死因子相关因子 桂枝挥发油 ? .溴一.氢一一吲哚半乳糖苷 一一?一?? 回车女拣辑擘基奎量精堆氇《《““、成都中医药大学级博士学位论文 ?上. 和’ 西 研究背景 .炎症的研究概括 炎症是机体对外界伤害性刺激的一种防御性反应,也是机体发出“求救”的主 要信号。伤害性刺激强度、持续时间长短与机体免疫功能之间的平筏决定了炎症的 发生与否,当机体的免疫功能正常,外界伤害因子的“毒力”较小时,机体通过一 系列免疫反应保持机体基本处于健康状态;反之,机体便处于炎症状态、甚至由于 失控性炎症的发生而导取危急重症的发生。天然免疫是保持机体免受感染的第一道 屏障。 炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应,炎症反应从进 化角度看是以血管反应为中心、以白细胞和中性粒细胞的激活为特征?。在对炎症 反应及抗炎机制研究中发现,在炎症过程中发挥重要作用的不仅有我们熟知的炎症 、信号转导通路, 相关酶、炎症介质、细胞因子、黏附因子等,还涉及? 相关细胞不仅包括白细胞、巨噬细胞、内皮细胞,还涉及成纤维细胞;炎症过程与 受体是 神经内分泌系统的一黑色细胞刺激素亦有密切关系。近年来研究证明 联系天然免疫和获得性免疫的桥梁与纽带”““;年代后期提出、、、 等重症炎性疾患统属于“炎症免疫信号转导紊乱疾患“”;上世纪年代末炎 症信号转导领域取得了几大突破:样受体的发现、通路的初步阐明、? 活性调控机制及免疫细胞凋亡机制等,涉及到从胞膜一胞质一胞核信号转导 的全过程,使得对炎症的研究和认识上升了一个很大的台阶。所有研究取得的结果 表明全身各系统的绝大多数疾患均是一种炎症性疾患或存在炎症反应,如心血管疾 病、肿瘤、肾病、哮喘、、高脂血症、糖尿病、肝炎、风湿病、软组织损伤、 过敏反应等,几乎涵盖了临床所见的全部疾病:并认为炎症反应就是炎症免 疫信号 转导紊乱引起的级联“瀑布”反应;失控性炎症就是炎症免疫信号转导紊乱引起的 级联“呼吸爆发”效应。 中医古籍没有炎症之名,但对炎症相似的论述颇丰,如痈、疽、疮、疖等。中 皿末盘然科学童奎膏齄项目《,?成都中医药大学级博士学位论文 医的整体观念体系和特别强调“正气”对疾病的影响、以及因人、因时、因地制宜 的动态灵活的辨证法思想,对炎症性疾病、特别是耐药抗生素的、急性细菌、 病毒性及慢性生物及理化性炎症性疾病具有独特的治疗优势,尤其是病毒感 染所引起的各种炎症性疾病。中医认为病原微生物、机体代谢产物等各种不良刺激 因子均属于“六淫外邪”等病因范畴,这些不良刺激因子侵袭机体,是否导致炎症 的发生与机体的正气密切相关,正气强则不良刺激可以被机体“自稳”体系清除而 不致病,正气弱则机体受到损伤,导致炎症的发生,甚至恶化。 目前西医抗炎药除经典的甾体类、非甾体类外,还发展了细胞因子、抗细胞因 子单克隆抗体、抗黏附分子单克隆抗体等新型抗炎药。甾体类抗炎药与下丘脑一垂体 一肾上腺皮质轴密切相关;非甾体抗炎药抗炎作用除传统认为与抑 制外周前列腺素的合成相关外,还包括对环氧合酶的抑制、对脂氧合酶的抑制、干 扰细胞膜过程和部分中枢机理。目前非甾体类抗炎药的研究主要集中在选择性。 抑制剂、释放型非甾体抗炎药和选择性:/一脂氧合酶双重抑制剂三类上。 的中枢抗损害作用可能部分是通过内源性类阿片活性肽或阻断的释放或 抑制兴奋性氨基酸及受体产生的”。以往的中药抗炎机理研究一般从对 的影响、干扰花生四烯酸代谢及抗组胺效应、免疫抑制等几个方面进行,此外还有从 抑制白细胞活化、抗血小板聚集等方面的阐释,课题组的前期工作对】信号通路 ? 及其下游的环节进行了研究,发现多种解表药挥发油都对? 活化及其 下游炎症因子有显著的抑制作用。当前炎症研究进入胞内信号和细胞周期调控的新 阶段,对信号转导机制研究成为炎症研究的热点。但药物对基因表达和 信号转导关键环节干预作用的研究目前才处于起步阶段,目前研究主要集中在抑制 ? 活化上,如抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐和一乙酰一半胱 氨酸等、产生的化合物硝酸甘油、硝基呋喃妥英等、免疫抑制剂糖 皮质激素、水杨酸盐、非甾体类抗感染药等、 突变体、反义及诱捕寡核甘 酸、 多巴胺等。 中药对信号转导途径的研究亦集中在? 及其下游环节,如雷公藤内酯 醇、蓝桉油、多种中药多糖如桔梗多糖、刺五加多糖、茯苓多糖、板蓝根多糖等、 解表药挥发油如鹅不食草挥发油、紫苏挥发油、辛夷挥发油、荆芥防风挥发油等、 苷类如黄芩苷、三七总皂苷等、丹参酚、斛皮素、姜黄素、银杏提取物等能够 田末自然科学基坌膏助项目成都中医药大学级博士学位论文 抑制? 的活化或产生。但对? 上游关键转导分子影响的研究尚未见报 道。 .桂枝研究现状 桂枝为樟科植物肉桂 .的干燥嫩枝,性温,味甘辛, 具有发汗解表,温经通阳的功效,主要用于风寒表证,风寒湿痹证,胸痹心悸,月经 不调,瘸瘕等证。 ..桂枝简考 桂枝一名,始载于《伤寒论》,汉唐以前的本草著作中均无此名,但在《山海 经》、《离骚》、《五十二病方》、史游《急就章》、《武威汉简》等文献甲均有“桂”一 字。现存最早的本草学专著《神农本草经》载有“牡桂”、“菌桂”,历代本草学中有 关桂枝的药名、药用部住油不统一,明清以前桂枝与肉桂多混淆,《伤寒论》中桂枝 有“去皮”之说,所以与现代桂枝不是同一药用部位;清代《本草述》指出:“桂枝 乃细嫩枝条”,首次明确了桂枝即为肉桂的干燥嫩枝,但直到上世纪年代初,桂 枝仍有“枝上皮”和“枝梢”的混乱,上世纪年代末以后,枝梢作为桂枝的药用 部位才占据完全地位。总括而言,历史上“菌桂”、“筒桂”、“官桂”均是枝皮,与 今“筒桂”一致,“牡桂”、“板桂”即今之“板桂”,历史上的桂枝与肉桂同出一物, 药用部位古代用桂皮,清代起改用桂梢,现代所用桂枝为干燥的嫩枝”“。 ..桂枝化学成分研究概况 桂枝主要含挥发油、酚类、有机酸、多糖、苷、甾体、香豆精等,不含生物碱、 氨基酸、多肽、蛋白质、黄酮等。有学者利用各种色谱技术从桂枝%乙醇浸膏的 氯仿和乙酸乙酯部分中共分离得到个化合物,分别为肉桂酸、一甲氧基肉桂酸、 ,二苯基一丁二酮、香豆素、一谷甾醇、丁香醛、 , 一过氧化麦角甾醇、一 甲氧基苯甲酸、 一羟基~一烯一一豆甾酮、原儿茶酸、胡萝苷“”。桂枝具有发汗 解肌、温阳通脉的功效,主要治疗外感风寒或寒凝经脉证,故挥发油是其主要有效 部位群之一。桂枝中挥发油含量为.%~.%也有%~%之说??”;挥 发油中含有多种成份,主要成份包括烃类、醛酮类、醇酯醚类、酚类等,所有成 份中桂皮醛含量最高,含量因检测手段、药用部位、贮存年限等不同而有差异,介 于.%~.%,其次是桂皮酸“”?。 ..桂枝药理作用研究概况 田末自然科学基童膏助项目成都中医药大学级博士学位论文 抗病原微生物作用 体外研究显示,桂枝及其提取物体外可以抑制多种细菌的生长,不同提取工艺 产物的抑菌效果不同,其中蒸馏液效果较好,提示其抗菌的主要有效成份是挥发油; 均有抑制作用”””; 桂枝水煎液对流感病毒亚甲京科一株和孤儿病毒 桂枝蒸馏液不同浓度、与微生物作用时间的长短不同,体外杀灭微生物效果亦有差 别”’“。 解热抗炎作用 桂枝对体温有双向调节作用。水煎剂和桂皮醛能降低发热家兔的体温,并能使 正常小鼠的体温降低。桂枝及其提取物能拮抗多种急性、慢性炎症反应,表现出较 好的抗炎作用,此作用与抑制代谢、提高过氧化酶活性等有关“”。 抗过敏作用 桂枝能抑制矿抗体所引起的肥大细胞脱颗粒,还能抑制补体活性,有抗过敏 作用“?。 镶痛、镇静、抗惊厥作用 桂枝及其提取物对热刺激和化学刺激性疼痛具有较好的拮抗作用,桂枝、柴胡 醇提取液镇痛作用与颅痛定相当,而水提取液作用不及颅痛定,二者配伍比例并不 影响镇痛效果‘?一“。桂皮醛能使小鼠自主活动减少、巴比妥类催眠药的睡眠作用增 强,且对抗苯丙胺所致中枢兴奋以及延长士的宁番木鳖碱所致惊厥的死亡时间 和抑制小鼠听源性惊厥。?。此外,桂枝注射液具有良好的抗癫痫作用。?。 其它 桂枝能双向调节免疫功能。“;增强小鼠腹腔巨噬细胞内 表达,表 现出一定的抗肿瘤活性”:桂皮醛可以显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖,具有 一定的降血糖作用。?。此外,桂枝及含桂枝复方具有较强的抗氧化作用,桂枝炮制 品水提物和醇提取物对清除超氧阴离子和羟自由基?能力不同,提示不 同的炮制方法抗氧化能力存在一定的差异性?“?。 对心脑血管、血液系统的影响”””” 桂枝水煎剂能使小鼠心肌营养性血流量增加,扩张外周血管,与芳香水的混合 液能显著改善“寒凝血瘀”所致的微循环障碍;桂枝蒸馏液能降低大鼠离体心脏再 灌注室颤发生率,改善心功能,恢复心率,提高心室最大收缩率及左室功能指数, 禹末由焦科学矗奢青霸礓目‘档船成都中医药大学投博士学位论文 同时伴心肌摄氧量增加。桂皮醛体外能抑制血小板聚集,并有抗凝血酶作用。 桂枝的药动学研究”” 以?测定小鼠和桂皮酸后的血药浓度及其在小鼠体内的药代动力 学和生物利用度,结果显示桂皮酸的线性范围.~,垤/.,最 低检测浓度为./。在小鼠体内的药动学过程符合二室模型,绝对生物利用度 为.%。 陟急性毒性研究”” 桂枝挥发油以./ 小鼠的。及其可信限为.?.%,即 .?./:小鼠的及其可信限为.?.%,即. ?./:灌胃给药的最大耐受量为.~,为体重成人用量的 倍。 ..桂枝的中医临床应用 桂枝传统临床应用概况 桂枝辛温发散,能“散风寒,逐表邪、发邪汗”,缶床主要用于风寒表证和风寒 喘咳证。挂枝辛温通阳,能解表达里,临床亦多用于里寒实证,如风湿痹症和寒凝 血瘀证等。此外,本品临床也可用治阳虚证。 桂技的现代临床应用概况“” 桂枝经合理配伍后,广泛应用于临床各科疾病的治疗。如预防流行性感冒、风 湿性关节炎、癫痫、妇女卵巢囊肿、雷诺综合症、血栓闭塞性脉管炎、骨质增生、 阳痿、牙痛、小儿哮喘、低血压、小儿高热、神经性皮炎、脚癣、遗尿、阑尾炎、 低钾周期性麻痹、白细胞减少症、冠心病等。 立题依据 .前期扎实的工作基础奠定了深入研究的条件 本研究是导师几十年研究方向的延续和深化,是国家自然科学基金的组成部分。 以导师为首的课题组通过几十年的探索和工作,发现桂枝挥发油 。等解表药的挥发油均有显著的抗炎作用,不仅对多静细 及其下游环 胞因子和炎症介质有良好的抑制作用,而且发现对信号通路? 信号通路密切相 节有显著的拮抗效应,提示解表药挥发油抗炎作用与/? 关,但解表药挥发油对病原相关模式分子的识别、内化和信号在细胞内的 皿謇自捕科学蠢尘量助项目..成都中医药走学级博士学位论支 转导等? 上游环节是否有影响昵因此探讨对/? 信号通路关键 靶分子的影响对于揭示抗炎作用的信号转导机制和丰富中药“辛味”理论具有 现实意义。 . 信号通路为炎症研究提供新的着眼点 受体的发现是上世纪末生物学重大发现之一,。架起了天然免疫和获得 性免疫联系的桥梁,通过其对的识别,启动了信号转导过程,通过活化 特异性炎症免疫相关基因转录达到病原微生物的局限、消除或刺激炎症介质和细胞 因子大量释放导致炎症的发生、发展和放大。可见 信号转导通路在炎症的发生 发展中起着极其重要的作用。不同亚型的发现和信号转导通路的阐明为炎症的 深入研究提供了新的着眼点。 .实时荧光定量技术问世为研究提供了技术保障 基因表达研究过去多采用逆转录半定量技术,由于半定量技术不能准确实 时的反映基因扩增的过程,同时操作过程中极易导致样品的交叉污染而影响扩增结 果,所以半定量的结果并不十分可靠,但实时荧光定量技术为基因袭达的准确 定量提供了可靠的研究手段,可以动态的、实时的观察基因扩增量变的过程和表达 情况。 问题与本研究的切入点 现有研究缺乏对样受体基因表达和信号转导关键靶分子环节的研究。 炎症是多种疾病共有的病理,“表证”过程均有炎症存在。随着医学科学的发展,对 疾病的认识也在不断深化,原来那些不被看作是炎症的疾病,现代研究证实其基本 病理是炎症或存在炎症反应,如哮喘、心血管疾病、肿瘤等。近年提出炎症就是“炎 症免疫信号转导系统调节紊乱疾患”的新观点,使炎症信号转导通路的研究成为关 注的焦点和研究热点,信号转导通路是炎症信号通路中最为重要的一条, 是否是通过调整炎症信号转导通路紊乱而发挥抗炎作用的目前尚未见报道。 本研究以为研究对象,采用。,致大鼠急性肺炎模型为载体,考察 对信号转导通路中、表达、表达、 ?、? 、 及一 水平的影响,从炎症信号识别内化、细胞内转导、易位入核和前 炎症因子产生等层次探讨抗炎的分子信号转导机制。同时观察对的 影响,初步揭示对酪氨酸信号转导通路、 信号通路与信号通路等炎 皿末自燕科学基奎青动项目?成都中医药大学级博士学位论文 症信号通路之间分子对话的影响。 拟解决的关键问题 初步揭示对急性肺炎模型信号通路关键分子的调节作用,明确 抗炎作用的主要作用靶点和作用层次,初步阐明对不同炎症信号通路分子对 话 的影响。 实验设计思路及技术路线 .实验设计思路 对急性、慢性利免疫性等多种炎症具有良好的拮抗作用,前期研究表明, 抗炎作用与抑制从代谢、炎症介质、细胞因子和脂质过氧化等有关。本研究 在前期研究的基础上,观察对依赖性。/ /? 信号通路的影响, ? /? 籍以阐释抗炎作用的信号转导分子机制。。./ 信号通路涉及 的细胞外识别、内化过程、信号在细胞中的转导过程、信号易位入核过程、 炎症相 关基因转录活化过程和前炎症因子的生成过程等几个环节,由于缺乏跨膜段 和 胞内段,不能直接传递信号,.识别后主要通过内化入核,因此以和 表达来反映刺激后信号内化过程;是信号入胞后向下游转 导的关键转接蛋白, 是? 的抑制蛋白,故以表达和 一?活 异源二聚体易 性来反映信号在细胞内的转导过程:? 被解除抑制后, 位入核,与特异位点 结合后启动炎症免疫相关基因的转录,生成前炎症因 子,故以? 反映信号核易位和启动炎症免疫相关基因转录过程;炎症相关 基因转录后主要生成一?和。 ,二者又通过其特异性的受体和一 继续活化? ,生成继发性炎症介质,如,一、..等,导致炎症信号的“级 联”放大,产生“呼吸爆发”效应,故以?和? 来反映信号“级联”放大 过程。是信号通路、酪氨酸激酶信号通路和信号通路等炎症信号通 路分子对话的主要靶点,故以活性初步反映炎症信号通路之间的分子对话。 .实验采用的技术路线 固术自然科学基空膏劢项目.羹革社峰雌肇矗丑譬 肛等寺鲰警斗慷?簦眸十慷禽串拇成都中医药走学缓博士学位论叉 实验研究 第一部分桂枝挥发油的制备、.测定及急性毒性研究 的制备 桂枝为樟科乔本植物肉桂/// .的干燥嫩枝,购自成 都市血块石中药材市场,经成都巾医药大学生药学王光志博士餐定为中药桂 枝 ?,符合现行中国药典药用标准。 按版《中华人民共和国药典》一部附录“挥发油测定项”中 乙法提取.得橘黄色灌明油状液体,气味浓郁芳香,得率为.%,介于文献报道 】.%和.%之脚““”,一?冰箱保存备用。;临用时加.%的吐温助溶, 配成适当浓度药液备用。 实验中所用剂量约为急性毒性试验的/、/和/。 的/鉴定 .仪器与供试药 美国惠普/?气帽色谱仪; 检测器;质谱数据库: 川.;无水乙醇:自制。 .溶液铆备 样品溶液的配制精密量耿挥发油,置于容量瓶中,加无水乙醇稀释 至刻度,援匀,作为供试品溶液。 .气质联用系统条件 ?毛细管杠. ;载气:氦气,分流比脉冲不分流 :】,流量:.~./ ,柱温:起始。保持后以。/升温 至】 保持,后以。/升温至 / 保持 ,后以 升温 至。;检测质荷比范嗣~,离子源温度。,倍增电压。 固末自然科:基尘奇肋项目 成都中医药大学级博士学位论文 .气质联用分析及结果 取精油.,按气质联用条件直接进样,结果见表,总离子流图见图。在上 述条件下,从桂枝油中分得个成分,鉴定了个成分,占全精油的,%,其中 含量在.%以上的有个成分,占全精油的.%,占已鉴定成分含量的. %,尤其是桂皮醛含量最高,含量为全精油的.%。 .国隶自然科学垫盎寄助项目成都中医药大学级博士学位论文 . / ,二 . ; ; ’”?; ,一. 量 . ; 睁 ; 添蛱躲菇.?羹?魏爨基黧:蕊磊溢云篱嘉 的急性毒性研究 一次给药,经口服或腹腔注射,观察动物死亡及中毒情况。经预试验, 寻找到受试药物引起%和%死亡率的致死量范围后,安排正式试验。实验 时室温~?。 实验动物为小鼠,体重~,早各半,由四川省医学科学院实验 动物研究所提供,动物合格证号:川实动管质川 . 给药的测定用改进寇氏法进行 经预试验,每次只小鼠,雌雄各半,找到引起%死亡率的剂量为%的 乳化剂./,%死亡率的剂量为%单位同前。剂量安排 见表卜。 取小鼠只,雌雄各半,随机分为组,每组只,以./, 田末电燕科学鲞奢青助项茸?啪趔】皇垦苎苎兰竺璺堡?兰堡垒圭 一次,观察动物死亡率及中毒情况。结果见表?:’ 卜 ,‘ % / .. . . . . ., . . . . . .. , . . . . . 一. . , 。 , . 一. . . ? ?‖. 王. ?. 从表中可知:一. 。。,??????。?????????‘?,??????????。‘?????????????。‘?‘?‘??“‘‘。 ‘??一 。? .一.一’ ?。”?./ 。?兰?。。。 氏的可信限。?.。../。 ;。. /,相当于原生药./,的可信限 ./~. /,相当于原生药./. /。 原生 结果,以./ 小鼠的‰及其可信限分别为. 药/和为.~. 原生药/。死亡动物在给药后很快出现 烦躁不安,竖毛.惊跳。耳廓血管充血。后渐趋安静,呼吸深慢,行动迟 缓,四肢抽搐,翻正反射消失,后开始死亡。死亡后立即解音肉眼观察,心 跳仍存在,说明呼吸衰竭先于循环衰竭,其它脏器末见异常。 。 给药的的测定用改进寇氏法进行 经预试验,每次只小鼠,雌雄各半,找到引起%死亡率的剂量为.% 圈謇自感科荦基量资助疆日苎苎主垦苎苎兰竺竺:圭竺竺兰兰 的乳化剂./,%死亡率的剂量为.%单位同前。方法 ./。挥发油乳化剂经无菌 同给药。的测定,给药途径为,每鼠 处理。组距为.,组数为组。给药剂量及结果见表?:‘ %/ . . ?. . . . . . . . ?. . . . . . 一. . . . . . 一. . , . . . 一. . . . .?. ????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????一一??????????‘??????一 ?. ?矿. ?‖. 从表中可知一. ??.一. 。:/‘三。.。:。。。 。的可信限;“‰?.。。.~./ 。. /,相当于原生药./,的可信限.~ ./,相当于原生药./~./。 原生 结果,以./ 小鼠的及其可信限分别为. 药/和为./~. 原生药/。死亡动物在 给药后很快出现 烦躁不安,竖毛,惊跳,耳廓血管充血,~后渐趋安静,呼吸深慢,行动 迟缓,四肢抽搐,翻正反射消失,后开始死亡。死亡后立即解剖肉眼观察, 心跳仍存在,说明呼吸衰竭先于循环衰竭,其它脏器未见异常。 四末自然科学基仝贵助项日成都中医药大学级博士学位论文 小结 .本实验中桂枝挥发油的提取得率约为.%。 . 的/结果显示:桂枝油中分得个成分.鉴定了个成分, 占全精油的.%,其中含量在.%以上的有个成分,占全精油的.%, 占己鉴定成分含量的.%,尤其是桂皮醛含量最高,含量为全精油的. %。 . 的急性毒性测定: 以./ 小鼠的。及其可信限分别为. 原生药/和 为.~. 原生药/。 原生药/ 以./‘小鼠的及其可信限分别为. 和为./~. 原生药/。 第二部分的抗炎作用研究 .实验材料 .主要试剂 角叉菜胶型,公司产品 伊文思蓝,上海化学试剂采购供应站, 冰乙酸,成都天华科技股份有限公司, 大肠杆菌内毒素.,?.:融公司产品 .主要仪器 型电子天平万分之一,天平公司 一紫外一可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司 一超声波清洗器,浙江海天电子仪器厂 ??型电热恒温水浴箱,上海医用恒温设备厂 型酶联免疫检测仪,国营华东电子管厂 田末自拣科学毫尘量舫项日挪成都中医药大学级博士学位论文 倒置显微镜,日本 .实验动物 小鼠,体重~,大鼠,体重~,级,全,由四 川省医学科学院实验动物研究所提供,动物合格证号:川实动管质 一 统计方法 数据采用相对标准曲线法计算,结果用“均数?标准差”?表示,统 计采用单因素方差分析,方差齐性时采用检验,方差不齐时采用基于检验成 对比较检验;组间比较粲用独立样本检验。 实验方法与结果 . 对二甲苯致小曩耳廓肿胀的影响“”删 取健康雄性小鼠只,按体重随机分为组,每组只。备组动物每 日一次,每次./.模型对照组给予等体积的.%吐温溶液,每组动 物连续灌胃给药,地塞米松组实验当天腹腔注射给药一次,分组及剂量见表 一。末次给药后,将“二甲苯均匀涂于小鼠右耳廓两面致炎,左耳作为 对照,致炎后处死动物,用直径的打孔器取下左右耳片称重,以左右 耳片重量差作为肿胀度,按下式计算肿胀度和肿胀抑制率。 结果见表?和图?。 肿胀度致炎侧耳片重一非致炎侧耳片重 模型对照组肿胀度一给药组肿胀度 ×% 肿胀抑制率 对照组肿胀度 田末自然聿挚基奎量蝣礓 ‘.成都中医药大学毁博士学位论文 一 ?【 ? / % ?? .?. . .?.“ . . .?.” . . .?.’ . . .?.’.,,,. : 结果表明:与模型对照组比较,高、中、低剂量组均有明显的抑制二 甲苯所致小鼠的耳廓肿胀作用.;各剂量组间比较无统计学意义 .。 ? . 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的影响””“’ 取健康雄性小鼠只,按体重随机分为组,分组及给药剂量见表? 。各组动物每日一次,每次./,模型对照组给予等体积的.%吐温 溶液,每组动物连续灌胃给药,地塞米松组实验当天腹腔注射给药一次,末次 嘎謇自然娉掌基尘黄齄项再成都中医药大学级博士学位论文 给药后,小鼠尾静脉注射%伊文思蓝./体重,同时腹腔注射.% 醋酸溶液./只,后处死小鼠,用蒸馏水冲洗腹腔,收集冲洗液,离 心,取上清液于分光光度计比色,以吸光度值判断小鼠腹腔毛细血管的 通透性,结果见表?和图。 : 料... 结果显示,高、中、低剂量均对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进有显 著的抑制作用.;各剂量组间比较无统计学意义.小剂量的 拮抗作用较强。 . 口 国柬自然科学基金赉助项目 成都中医药大学级博士学位论文 . 对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响“”? 取健康雄性大鼠只,体重?,按体重随机分为组,每组动物连 续给药,阳性组实验当天腹腔注射给药一次,分组及给药剂量见表?。实 验前在各鼠右后足蹀关节处作标记,用足容积测定仪测定各鼠足容积两次, 取甲均 值作为正常足容积。术次给药后 ,每只大鼠右后足跖部皮下进针至踝关节附 近 皮下,注射%角叉菜胶溶液.致炎,分别于致炎后、、、、、测定 致炎足容积,计算各大鼠致炎前后右后足跖容积变化值,以足肿胀度和足肿 抑制百 分率表示药物的抗炎效应,结果见表?和图~。 对照组足肿胀度一给药组足肿胀度 ×% 足肿胀抑制卣分率 对照组足肿胀度 一屯 ??”? ? 旷”“ ? 梆 蛀 吐 吐 埔帅 忙 性 一 啉 盯 嘶 舱 钔 ? ? 四 一: ... 代表足肿胀抑制阿分率 结果表明:与模型对照组比较,高、中剂量组./、./均 有显著的抑制大鼠角又菜胶性足肿胀的作用.。 国家自然科学基空资助项目 成都中医药大学级博士学位论文 ?? . 对所致大鼠急性肺炎模型的影响““ 取健康级雄性大鼠只,体重?按体重随机分为组,即正常对 照组、模型对照组、地塞米松阳性对照组、高、中、低剂量组。动物分组及 给 药剂量见表?,各组动物连续给药天,正常对照组和模型组给予等体积生 理盐水,阳性对照组于正式试验前注射地塞米松/。末次给药后,各组 动物由尾静脉注射大肠杆菌内毒素/,正常对照组注射等体积生理盐水。 小时后处死,取血做外周血炎性细胞计数及分类,结果见表?和图?:取左 肺称湿重,按下式计算肺含水量和肺指数,结果见表?和图?;右肺用于病 理形态学检查。 肺含水量肺湿重一肺干重 肺湿重一肺干重 × 肺指数 体重 国柬目蚪科学基金资助项目成都中医药是学投博士学位论文 ’? % ×/ / / /等体积 .?.‘”.?. .?.”.?. .?。 .?。 等体积 .?.~.?.” .?.“ .’ .?.“.?.” .?.” . .?..?.” .?.“ . .?.”.?.” .?.“: 丰..丰丰 . 丰术术 ? ‘阁末自然刊学基金资助项目成都中医药走学衄博士学位论文 结果表明,模型对照组大鼠白细胞总数、淋巴细胞百分数和淋巴细胞计数均 显著高于正常对照组.,说明造模成功。高、中、低剂量对致 大鼠急性肺炎所致的白细胞、淋巴细胞百分数和淋巴细胞计数升高均有极显 著对 抗作用.,说明对所致的大鼠急性肺炎有抑制作用。 ’】 ?丰丰.。 木木. : 团家自然科学基金费鼻项目..蚺?成都中医药走学级博士学位论文 结果表明,模型对照组大鼠肺含水量和肿指数均显著高于正常对照组 .,高、中、低剂量对致大鼠肺急性炎性水肿有显著的对抗作 用,说明对所致的大鼠急性肺水肿有抑制作用。 . 对所致大鼠肺急性炎症模型的病理形态学的影响”“” 实验.大鼠处死后,无菌工作台上取下右肺,%中性福尔马林灌注 固定?后,换掉固定液,再固定,石蜡包埋切片,染色,常规光镜检 查。根据肺组织水肿、出血、炎细胞浸润、细小支气管损伤等对肺损伤进行 评分, 评分标准见表。:? 仅有少量红细 红细胞几乎充满 毛细血管淤血 无红细胞 红细胞较多 胞 管腔 肺胞腔纤维蛋白 无纤维蛋白 仅有少量纤维 %以上肺胞腔有 %以上肺胞腔 渗出 渗出 蛋白渗出 纤维蛋白渗出 有纤维蛋白渗出 ..........................................................::::::: ::..................。............................................... .......................................一一 气管粘膜上皮细 无上皮细胞 可疑上皮细胞 管腔局部上皮细胞 管腔内上皮细胞 胞脱落 脱落 脱落 脱落 大面积脱落 失去正常肺泡结 肺泡间隔增宽 相对正常 稍有增宽 显著增宽 构 肺泡萎陷与气肿 相对正常 少数出现 成片出现 弥漫出现 散在间质、肺泡水 肺水肿 无 仅见问质水肿 弥漫性水肿 肿 以上/,甚至 中性粒细胞浸润 无浸润 ~个/ ~个/ 形成脓肿 淋巴细胞浸润 无浸润 少量散在 小灶状存在 大片存在 实验结果 田末自然科学基奎费助项目.威椰巾医药赶肇丑’’巩博士学位论丈 ..各组大鼠光镜下病理改变 空组【:肿结构清楚,小支’”铃、细支‘管:皮究整,周阳光炎细胞浸润:个 别较人支 管蒯阿仃淋巴小结,肺泡形念常,肺泡腔内呒纤常发现,见阁?。 祓慢组:小盘’钨’、翱正‘静镜‘见娃炎症反应,:皮脱淳坏死,肿泡睃 变窄,肺泡避增厚:订较多的炎性渗出物取犬量炎细胞浸澜.个别地方发生宴变或篓 陷融合,结构无法辨认,斋;分球,泡现代倏性酾‘肿,炎细胞以淋巴细胞、浆纽陋为 町见巾性牲细胞:支‘管质明水肿,管腔内较多炎性分泌物,分泌物小 夫墩?性拳迁朔胞,址圈。 地寒米松组:肺结构完整清晰,部分支‘管阍嘲轻度水肿,个别管腔硎围订少 虢淋巴细胞浸润,分泌物见少最一性札细胞:肿泡形态结构丛小正常,个脚肺 泡叮.日泡间隙轻微变脬.并订少齄炎性细胞渗出,见蹦。 高剂舒:肺结构完整清晰.小支管、细支气管炎症反应较模型组镀 暑减轻,部分小史‘钠‘、细史铃腔内有少疑炎性分泌物:支铃;心嘲轻度水肿. 』剐嘲订少精炎惟细胞浸润;绝大部分肿泡结构究褴,腔内分泌物较少,见蝌。 。嗣:【:肿结构完整清晰,小支管、细支气管可见轻微炎症反心。 史‘截’脚【啊轻艘水,周嘲钉少齄炎性细胞浸涧:肿泡结构宠糕,腔内无分泌物, 地图一》。 ;低剞.髓组:肺皇;构完整清晰,小支气管、细支 铽’可见轻微炎稚及应, 支‘落’心目轻度水肿,个剐管赕内一见少餐分泌物。躜溺彳『少鹫炎性细粒浸涧:帅 泡结:究糕,腔内无分泌物,见图~“。 ~ ’‘ ?~: ,西蕾自然抖擘基奎费蝻项屿【’抑垦型垦堑苎兰竺竺堡主兰竺堡圭 人鼠肺病理形态学照片 × 国家自然科学基金资助’女目成都中医药太学圭呸博士学位论文 ?× ? / × 固术自然抖学基仝首助确日 ?.口. 一?】时 ,、 档 嘏 窨 窨 蓄 詈 茹 茹 、/ 【巾?日口?厶毛一墨。巳?叫,口 一 ? 出 ? ? ? 耸 丁??,口?一???。 卜卜 卜卜 卜卜 卜卜 胃 目 哺 ? ” ? 裁 咆 一 ? ?? 卜卜 卜卜 . 卜卜 笛 叼. 蚋 叶?】?了】?.匕? “ 电? 蒜 ? 潘 』耸 磷 卜卜 卜卜 卜卜 卜卜 卜卜 卜卜 蔷 蔷 。 。 蒜 囊 号 吣 葫 : ?群汁硼雾静溶乏渐瓣瞳蜜瞄赔平碜辉湘习渐?上省哩? ? ? 婶 霉 ? 口】 ? ? 。 蔷 卜卜 件 卜卜 卜卜 潞 虱、?一??一了。口】一 竹口津蕈嶂峥牛誊尚珥一寸馨 嗣 脚鲁哥雨饕汁嶂?声车士恃禽牟净 吧叽 ? 遗 ? :一 ?? ? “ 卜卜 卜卜 十 什 卜 。 。 ’ 蚤 ’ 叶 吣 盯 ? ? ? ? ? 尊 卜卜 卜卜 卜卜 十 卜卜 卜卜 霉 ?: ? 七 ? 时 ? 】?,??????,匕口弓。一一。 卜卜 卜卜 什 沛 囊 卜卜 卜卜 卜卜 。 。 。 菌 鐾 畸 咛 。 离 崎 :: 一怍?? ? ? ? 『 ? 萋 ? ? 口 件 卜卜 卜卜 ? 盖 曾蔷 . ” 潞:成都中医药大学衄博士学位论文 小结 对二甲苯所致小鼠耳肿胀、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进、角叉 菜胶所致大鼠足肿胀和。导致的大鼠急性肺炎均有显著的抑制作用。结合前 期课 题组的工作基础,证实对急性炎症、慢性炎症和免疫损伤性炎症均具有良好 的抑制效果,说明抗炎作用确凿。 珥霉电燕耕学董奎量助项日积成都中医药太学级博士学位论文 第三部分对信号转导通路的影响 通过第二部分四种急性炎症模型研究,结合课题组前期的研究基础,表明 对急性炎症、慢性炎症和免疫性炎症具有确切的抗炎作用,在此基础上以急 性肺炎 模型为载体进行了抗炎作用与 信号转导通路关系研究,即抗炎作 用的信号转导机制研究。 分题一致大鼠急性肺炎模型的复制及标本的制备 实验材料 。 : 公司产品。 醋酸地塞米松注射液西南药业股份有限公司产品,批号:。 成都中医药大学药理室制备。 健康大鼠,级。全,体重:由成都中医药大学药实验动 物中心提供,实验动物合格证号为:川?。 显微镜一:。 实验方法与结果 .预实验 致大鼠急性肺炎模型的复制嘲 ..预实验一 取级雄性大鼠只,按体重随机分为组,每组只,其中组为 ./实验组,另外组为./实验组,平行设计空白组,尾静脉 注射.后、、处死组,空白组尾静脉注射等体积的注射用生理盐水。注 射后到相应时间点脱颈椎处死动物,无菌条件下取出肺脏,%中性福尔马林液固 定,染色,常规病理检查,判断肺脏炎症情况。结果表明./尾静脉注 回謇自燃科学基仝贵助螽日.成都中医药大学级博士学位论文 射、处死时肺部炎症损伤明显,符合实验设计的要求。故本研究模型制各选择 ./尾静脉注射、处死。 .预实验二 取级雄性大鼠只,按体重随机分为组,每组只,即空白对照组、 模型组、组。每只动物按/体重灌胃给药天,空白组和模型组 给予等体积的生理盐水。末次给药后尾静脉注射./,空白组注射等体 积的注射用生理盐水。后脱颈椎处死动物,无菌条件下取出肺脏,%中性福尔 马林液固定,染色,常规病理检查。结果显示:空白组肺脏结构清楚,无炎细胞 浸润,个别较大支气管分支周围有淋巴小结,肺泡形态正常,肺泡腔无异常发现 模型组细支气管、小支气管见明显炎症反应,肺泡间隔变厚,肺泡腔变小,有大量 炎细胞渗出,以淋巴细胞翻浆细胞为主,可见中性粒细胞,个别部位发生实变;支 气管间质明显水肿,管腔内有较多炎性分泌物,内有大量中性粒细胞。 组较模型组比较,炎症反应显著减轻。结果见图一~图? 固末自然科学基仝资助项目、苎塑主墨苎查兰竺竺苎主兰竺兰兰 肺组织痫理学照片 一 ×× ;× 田末自然科学基士费助项目.