胃蛋白酶法提取草鱼鳞胶原蛋白的工艺研究

胃蛋白酶法提取草鱼鳞胶原蛋白的工艺研究 胃蛋白酶法提取草鱼鳞胶原蛋白的工艺研 究 .===132o07.Vol,28.NO04食品研究与开发食吕工艺 胃蛋白酶法提取草鱼鳞胶原蛋白 的工艺研究 王咳,刘剑虹.李可伟 (天津商学院生物技术与食品科学学院,天津300134) 摘要:以胃蛋白酶,在酸性条件下对鱼鳞中胶原蛋白进行提取,研究加酶量(E/S),底 物浓度和提取时间3个因素 对提取效果的影响.分别通过混合均匀 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 和正交实验设计法,最终确定出最佳酶 提取条件为:胃蛋白酶30mS/S,3% 醋酸80mUs,恒温(18?)摇床提取48h. 关键词:鱼鳞;脱钙;胃蛋白酶;胶原蛋白 THESTUDYONI'HEEXTRACTIONOFFISHSCALECOLLAGENWITHPEPSIN WANGHong,LIUJian—hong,LIKe—wei (SchoolofBiotechnologyandFoodScience,TianjinUniversityofCommerce, Tianjin300134,China) Abstract:Intheexperiments,theextractionofthefishscalecollagenwithpepsinundertheacid condition,concerningwiththreefactors:E/S,fishscalesproteinconcentrationandextraction timeina mixeduniformdesignoraorthogonaldesignwasstudied.Finallythebestconditionofextracti onwith pepsinwasdetermined:30mgpepsinto1gfishscale,3%aceticacid80mL,shakingatthe constanttemperature(18oC)for48h. Keywords~fishscale;decalcification;pepsin;collagen 胶原蛋白(Collagen)是一种高分子蛋白质,丝状 的胶原蛋白纤维,能使皮肤保持结实而有弹性.它 存在于人体皮肤,骨骼,牙齿,肌腱等部位,主要生理 机能是粘合结缔组织.胶原具有很强的生物活性和 生物功能,能参与细胞的迁移,分化和增殖,使骨骼, 肌腱,软骨和皮肤具有一定的机械强度.胶原因为 其较弱的抗原性和良好的生物相容性,在烧伤,创 伤,眼角膜疾病,美容,矫形,硬组织修复,创面止血 等医药卫生领域用途广泛.胶原蛋白在食品方面应 用主要有食品包装,肉制品添加剂,胶原小食品,保 健食品等【. 胶原或称胶原蛋白是组成细胞间质 (extrace11ularmatrix,ECM)的最重要功能蛋白质,几 乎存在于动物机体一切组织中,主要富含于皮,骨, 作者简介:王咳(1966一),男(汉),学士,实验师,研究方向:食品科 学. 肌腱,韧带,血管及其它结缔组织.目前已证实的脊 椎动物胶原达l3种,彼此从遗传学到分子结构均不 相同,最常见的是I型,?型,?型胶原,其中I型胶 原所占比例最大,有关它的研究及开发利用深受化 学家关注[61.目前生产胶原蛋白制品的原料基本上 是猪,牛等陆生动物的皮和骨,由于陆生动物的生存 环境恶化导致疯牛病等流行病的发生,使得从陆生 动物的皮,骨中提取的胶原蛋白的危险性增大,从而 使其制品的使用受到限制.不少发达国家已经禁止 使用从牛皮和牛骨中提取的胶原蛋白.因此,从水生 动物中提取安全,卫生,无害的胶原蛋白成为这几年 各国研究的一项热门课题. 本研究选用胃蛋白酶,在酸性条件下进行胶原 蛋白的提取,分别通过混合均匀设计和正交实验设 计法,主要研究了加酶量,底物浓度和提取时间三个 因素对提取效果的影响. 食品工艺食品研究与开发2oo7Vo1.28NO04 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料 草鱼鱼鳞:市售;胃蛋白酶(比活为1:3000):中 国医药集团上海化学试剂公司. 1.2方法 1.2.1基本成分测定f7] 水分的测定:直接干燥法(GB,1r14769—1993); 总灰分的测定:高温灼烧法(GB5009.4—1985); 总蛋白含量的测定:凯氏定氮法(GB,1r14771— 1993); 钙含量的测定:采用EDTA滴定法EEl(GB12398 — 1990); 蛋白质含量的测定:考马斯亮蓝(Coomassie BrilliantBlue)染色法嘲. 1.2.2胶原蛋白含量的测定(以羟脯氨酸计) 羟脯氨酸(Hyp)含量换算为胶原蛋白含量,对 水产生物多采用11.1的换算系数唧.羟脯氨酸(Hyp) 含量的测定采用比色法【0】经改进如下. 1.2.2.1试剂配制 显色剂(1/5Ehrlish试剂【n】):取无水乙醇50mL, 慢慢加人浓硫酸lI37mL作为A液;取对二甲基氨 基苯甲醛6.0g,缓慢加人无水乙醇50mL,水浴加热 使其完全溶解并冷却至室温,作为B液.然后将A 液慢慢加人B,混合均匀.(冷藏下配液) 1.2.2.2羟脯氨酸 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的绘制 准确吸取羟脯氨酸标准工作液1.0,2.0,2.5, 3.0,3.5,4.0,4.5mL,分别用蒸馏水定容到100mL. 取E述标准液1mL于试管中,分别加人1mL柠檬酸 缓冲液和1mLO.05mol/L氯胺T溶液,室温(25?)氧 化10min后,加人高氯酸1mL,放置10min,最后加 人对二甲基氨基苯甲醛显色剂lI2mL,在65?水浴 显色10min,冷却后在561nm处测吸光度(蒸馏水 为空白对照).以羟脯氨酸质量浓度为横坐标,吸光 度为纵坐标绘制标准曲线. 1.3工艺流程 草鱼鱼鳞洗净粉碎EDTA脱钙NaCL脱 除杂蛋白胃蛋白酶提取胶原蛋白得提取液叶调 pH至中性沉淀,离 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 胶原蛋白粗提取液酸水 解测定Hyp含量胶原蛋白 1.4处理方法 1.4.1前处理 从市场收集草鱼鱼鳞,洗净晾干,粉碎后,得絮 状样品,冷藏备用. 1.4.2EDTA脱钙 将絮状鱼鳞(1g)JJI^预先配制I~JEDTA(0.18mol/L, 30mL溶液中,提取时间12h.鱼鳞中的金属离子不 断与溶液中的EDTA发生络合反应,达到脱除鱼鳞中 金属离子的目的.鱼鳞中总钙含量通过鱼鳞灰化后, 原子吸收法测定,鱼鳞中钙的脱出率通过二者之比确定. 通过均匀设汁方法,研究不同ED溶液浓度,不同料液 比及不同浸泡时间列鱼鳞中钙脱除的影响. 1.4.3氯化钠脱除杂蛋白 取脱钙后的鱼鳞(1g),利用氯化钠(3%)溶液 来除去其中的盐溶性和水溶性杂蛋白. 1.4.4胃蛋白酶提取胶原蛋白 经上述处理后的样品,在酸性条件下进行胃蛋 白酶提取,研究酶加量(E/S),底物浓度及提取时间 三因素对胶原蛋白提取率的影响,进而确定最佳提 取条件. 2结果与分析 2.1EDTA脱钙最佳条件的确定 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1为EDTA脱钙实验结果. 表1EDTA脱钙实验结果 Table1ResultsofremovingCaldumbyEDTA 实验号EDTA浓度(mol/L)加液量(mL)提取时间(h)脱钙率(%) No.EDTAconcert.(mol/L)Vo1.(mE)Exacttime(h)Caremoverate(%) 用SAS软件在计算机上对表1数据进行逐步 回归分析,得回归方程: Y=3.5368+0.8933x1-0.0025x12+0.0OO87x~+0.2909x3(1) 式中:Y为脱钙率,x为因素A,x:为因素B,x, 为因素c.由回归分析可知:A,B,c三因素对脱钙率 均有影响,其中EDTA浓度对脱钙率影响最大,其次 为加液量,而提取时间在6h以上无较大影响.故确 定最佳脱钙条件为:EDTA浓度0.18m0l几,加液量 30mL,提取时间12h. 2.2NaC1浓度对草鱼鱼鳞中杂蛋白去除的影响 表2为Nacl去除杂蛋白条件研究试验结果.由 表2可知,随着Nacl浓度由0.5%增加到3%,杂蛋 白的溶出率由0增加到2.67%,Nacl浓度增加到 2.5%时,杂蛋白溶出率不再大幅增加,因此NaC1去 除杂蛋白浓度确定为2.5%. 2oo7.Vo1.28.NO.04食品iif究与羿发 一==.136'—-========================== 表2?a去除杂蛋白实验结果 Table2Resultsofnon-targetproteins(NTP)withNaC! 食晶工艺 2.3酶法提取胶原蛋白 酶法提取胶原蛋白采用三因素二水平:r,'SOSm~'g, 30mg/g),时间(24h,48h),酸量(40mL,80mE)均 以产率为指标,优化提取条件.设计了L4(2,)正交表 设计实验,见表3,实验结果见表4. 表3酶法提取胶原蛋白正交实验设计表L4(23) Table3Orthogonalexperimentdesignofextractingof collagenbypepsin 由表4可知,酶法提取草鱼鱼鳞胶原蛋白的最 佳工艺为:胃蛋白酶加量30mg/g,3%醋酸80m, 恒温(18?)摇床提取48h. 3结论 鱼鳞的粉碎处理是脱除鱼鳞中主要无机盐—— 羟基磷灰石的很有效方法,羟基磷灰石的脱除率达 到了70%,鱼鳞絮状物进行EDTA脱钙的最佳条件 为:0.18mol/L的EDTA溶液30mL/g,振荡12h.该 条件可将鱼鳞中的钙脱除.胶原蛋白提取最佳条件 为:胃蛋白酶加量30mg/g,3%醋酸80mL/g,恒温 …I?川.?川.?川.?川'?川.?川'?…?川 表4酶法提取胶原蛋白正交实验结果 Table4Res.1ltsofexactingofcollagenbypeps~ 实验号E,sm N0(mg/g) (18?)摇床提取48h. 参考文献: [1]钟朝辉,李春美,梁晋鄂.鱼鳞胶原蛋白的提取优化叨,食品科 学,2006,27(7):162166. 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