免疫学实验设计
七年制 96K1B
107102
史晓洋
免疫学创新实验设计
——用动物模型验证类风湿性关节炎与IL-2的关系 一、 立题依据
(一)、类风湿性关节炎的概念和发病机制
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以侵犯关节及关节周围组织为主的自身免疫病。
RA的发病机制为:病毒或其他微生物感染导致关节滑膜腔变性，从而刺激机体产生自身抗体，这种自身抗体本身也是变性的IgG，又诱发产生抗变性IgG Fc段(CH2，CH3)抗体，后者即为类风湿因子(rheumatoid factor, RF),有IgM ，IgG和IgA 3种类型。RF与变性的IgG结合，形成免疫复合物，沉积于关节滑膜腔，引起关节及关节周围组织损伤(?型超敏反应)。IgM类RF主要存在于血液中，而引起关节损伤的主要是IgG类RF。RA患者的RF检出率为80%，正常人只有2%，在各种微生物感染性疾病或胶原性疾病中也可出现RF。然而，持续的高滴度RF提示疾病处于活动期，且骨侵蚀发病率高。
RA也可由?型超敏反应引起:由于Treg细胞功能低下或缺失，CD4+T(Th1) 细胞识别关节滑膜未知的抗原而介导炎症反应。在RA动物模型和患者的关节内均存在Th1细胞和巨噬细胞，以Th1细胞作为靶细胞的免疫治疗可显著改善患者的临床症状。在RA患者的关节滑膜液中也检出CD8+T细胞，其含量多于外周血中，但其识别的抗原为自身抗原还是外源抗原(如巨细胞病毒，EB病毒，流感病毒等)还不清楚，这些细胞在关节内分泌的IFN-γ可持续引起关节的炎症反应。然而，在CD4+T细胞或CD8+T细胞缺失的动物实验证明，CD8+T细胞在引起和维持关节炎并不重要，而CD4+T细胞更为重要。
(二)、IL-2
IL-2 主要由T细胞产生，特别是CD4+T细胞。IL-2R包含α、β、和γ3条多肽链:α链的胞内区较短，不能向细胞内传递信号，而β链和γ链的胞内区较长，具有传递信号的能力。3种肽链单独与IL-2结合亲和力较低，只有同时
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达才能产生高度亲和力。IL-2具有广泛的生物学作用:促进T细胞的增值，增强T细胞的杀伤活性;IL-2可促进NK细胞的增殖，维持NK细胞的长期生长;可促进LAK细胞的体外存活、扩增及活化淋巴因子激活的杀伤细胞;IL-2可促进B细胞表达IL-2R，促进B细胞增殖和产生免疫球蛋白;刺激巨噬细胞，提高其吞噬能力。
(三)、自身免疫病患者血液中含有高效价自身抗体或自身反应性淋巴细胞，通过患者血液中的血清或淋巴细胞可以被动转移疾病，我们可以应用自身抗原或自身抗体可在动物身上建立疾病模型，通过患病动物的血清或淋巴细胞可以将疾病被动转移至健康动物，患者或患病动物病变组织中有Ig沉积或淋巴细胞浸润，一种自身免疫病常常跟其他自身免疫病共存。
二、 实验目的
通过动物模型的建立验证在患有类风湿性关节炎的机体内，IL-2活性显著降低。
三、 实验方法和技术路线
使用ELISA法定量
检测
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模拟关节炎大鼠体内IL-2的含量。
(一) 原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体??聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)步骤
1、分组:实验组小鼠(自身免疫病品系小鼠)10只，对照组小鼠(正常小鼠)10只，在相同条件下培养若干月
2、取各组小鼠淋巴结细胞，加入刀豆球蛋白A 川(ConA) 进行培养，得到IL 2 粗制品.分别标注好实验组与对照组待测样品，同时准备好IL-2
标准
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品。
3、按照 抗原包被—洗涤—封闭—洗涤—加待测血清—洗涤—加酶标抗体—加底物显色 的实验顺序定量测定实验组与对照组IL-2的含量并且对比其含量不同分析实验结果
抗原包被法:
1) 用包被液(0.5 mol/L PBS,pH9.6)将待测IL-2样品或标准品稀释后，包被聚乙烯板，
4?C过夜。
2) 用PBS-Tween20洗涤液洗3次，每次30min，再以含10%小牛血清的PBS-Tween20 封闭，
37?C孵育2h。
3) 同上洗涤，加酶标抗Ril—2抗体，37?C孵育2h。
4) 同上洗涤加底物TMB，显色20min后，用5mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪450nm波长
测吸光度
四、预期实验结果
通过本次实验，预计将出现以下结果:实验组小鼠的IL-2含量明显低于对照组小鼠IL-2含量，这可能是类风湿性关节炎机体异常的结果，免疫系统遭受破坏的临床表现。
参考文献
1. 吕昌龙 李殿俊 李一.医学免疫学 第七版2012.4
2. 吕昌龙 李一. 医学免疫学常用实验技术 2011.7
3. 北京市儿科研究所陈燕.白细胞介素H 与自身免疫病. 首都医学院学报 1989年第十卷第三期
4. 金蕊 1，马雪梅1，曾毅1,2
1 北京工业大学生命科学和生物工程学院～北京,100124,
2 中国疾病预防控制中心～北京,100050,
EB 病毒和自身免疫病1中国科技论文在线
5. 邹薇薇倡，李 欣
(新疆库尔勒市巴州人民医院医学检验科，新疆 库尔勒 ,,,,,,)AKA 、CCP 、类风湿因子在诊断类风湿性关节炎中的应用新疆医科大学学报 JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY ,,,, Sep (，,,(,) ,,,,
6. 马田瑞 综述，韩 捷，陈海燕 审校 (同济大学附属东方医院风湿免疫科，上海200120) .Thl7细胞在类风湿性关节炎发病机制中的作用 . 第31卷第4期 2010年8月 同济大学学报(医学版) JOURNAL OF TONGH UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE) VO1(31 NO(4 Aug(，2010
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史晓洋
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