细菌DNA提取方法

细菌DNA提取方法 细菌dna提取 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 细菌DNA提取方案 细菌DNA提取方案:革兰氏阴性菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。 一、水煮模板法——主要用于PCR反应 1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18,24小时。 2、刮取1,2接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。 3、12000转/分钟 离心10分钟，取上清，,20摄氏度保存备用。 操作最简便，对试剂条件 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。 有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。编者建议:此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。 二、CTAB/NaCl 法 1、接种一单菌落于5mlLB中,30?培养过夜, 2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37?、220r/min培养16小时; 3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。 4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20?保存备用。 5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37?温育1小时 6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65?温育10分钟。 7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。 8、上清中加入等体积的酚?氯仿?异戊醇(25?24?1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。 9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。 10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4?保存。 CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southern blot。 编者建议:长时间保存DNA可放于-20?，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。 第1页 共3页 细菌dna提取方案 三、盐析法 1、1.5ml对数期菌液 2、12000rpm 30 s 3、200ul裂解液(同CTAB/NaCl法)，37c,1hr 4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min 5、上清用粗枪头取至新管 6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层 7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min 8、上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇 9、-20C，20min，14000rpm， 15min 10、400ul 70%冷乙醇洗涤 11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min 12、2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤 13、干燥，溶于100ul TE 介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。 革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。 实验注意:提基因组最好要将枪头尖剪掉(剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑)。以免枪头损伤基因组～抽干时最好是风干～ 细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。 1 快速微量提取法 A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4?保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备 第2页 共3页 细菌dna提取方案 先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE (50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中， 先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50?放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯 酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA 沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养:细菌接种于5ml液体培养基中，37?摇床(300rpm)培养过液。2) 细菌收集:取1ml培养物于 1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。3) 菌 体裂解:加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37?作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶 K 3μl，50?作用3h或37?过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)4) 抽提:菌液均分到两个1.5ml EP管，加等 体积的酚?氯仿?异戊醇(25?24?1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很 粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去)5) 沉淀:加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm 离心10min。6)洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽(凉)干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR 模板用。 4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 5 1) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。2) 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37?保温1小时。3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65?保温20分钟。5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将 上清液移至干净离心管。6) 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。7) 加1倍体积异丙醇, 颠 倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。8) 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20? 保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中 操作步骤处理。 注:1)CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2)氯仿:异戊醇 (24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一:仪器:同方法一 二:试剂:TE、TAE 缓冲液;10%SDS;,,NaCL;20mg/ml蛋白酶,;CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于 80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解);25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇;异丙醇;,,,及100% 乙醇三:操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀 溶于500μl TE缓冲液中混匀 30μl 10%SDS,3μL蛋白酶,，混匀，37?,1小时 100μl NaCL(5M) 混匀 80μl的CTAB/NaCL,*混匀;65? 10min(可 不做) 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心12000rpm,4-5min 取上清，以下操作与方法一中有机溶 剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。注意 ,，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于 0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。 2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此 流程,•可以获得较为完整的DNA分子。 第3页 共3页