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《乳与乳制品中L羟脯氨酸含量的测定》编制说明

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《乳与乳制品中L羟脯氨酸含量的测定》编制说明《乳与乳制品中L羟脯氨酸含量的测定》编制说明 《乳与乳制品中L羟脯氨酸含量的测定》 编 制 说 明 吉林省疾病预防控制中心 二〇一二年四月 目 录 一、 研究背景 ………………………………………………………… 二、 任务来源 ……………………………………………………… 三、 制定标准的必要性和意义 ……………………………………… 四、 标准制定胡主要过程 ………………………………………… 五、 制定标准的原则和依据………………………………………… 六、 标准主要条款的说明 ………………………………………...

《乳与乳制品中L羟脯氨酸含量的测定》编制说明
《乳与乳制品中L羟脯氨酸含量的测定》编制说明 《乳与乳制品中L羟脯氨酸含量的测定》 编 制 说 明 吉林省疾病预防控制中心 二〇一二年四月 目 录 一、 研究背景 ………………………………………………………… 二、 任务来源 ……………………………………………………… 三、 制定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的必要性和意义 ……………………………………… 四、 标准制定胡主要过程 ………………………………………… 五、 制定标准的原则和依据………………………………………… 六、 标准主要条款的说明 …………………………………………… 1、标准的名称 ……………………………………………………… 2、标准的范围 ……………………………………………………… 3、方法原理 ……………………………………………………… 4、前处理条件 ……………………………………………………… 5、仪器分析条件 …………………………………………………… 6、检出限 ……………………………………………………… 7、线性范围 …………………………………………………… 8、准确度、精密度 …………………………………………… 七、标准验证情况说明 …………………………………………… 八、验证结论 九、本标准作为强制性地方标准的建议………………………………… 十、贯彻标准要求和 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 建议 ………………………………… 十一、参考文献 …………………………………………………… - 2 - 一、 研究背景 当前,国内各大乳品企业的竞争已经将焦点集中在了各地的奶源争夺上。奶农以及部分奶粉生产商出于自身经济利益的考虑,常常会在鲜奶及奶粉中掺假,这严重影响了乳品加工企业产品的内在质量和经济效益,同时也对消费者的身体健康造成严重损害。在各种掺假方法中,蛋白类掺假物,如水解蛋白等是比较常见的一类掺假物,水解动物蛋白(水解明胶)是以动物皮革中的胶原蛋白为原料,进行水解、精制而成的水解产物。水解动物蛋白的蛋白质含量达85%以上,有不法商贩为降低生产成本,将其掺加到奶粉及其他乳制品中以提高蛋白质含量,但是因其氨基酸的组成不合理,且不易消化,所以营养价值低下,导致人体吸收利用率低。L-羟脯氨酸是水解蛋白特有的氨基酸,约占胶原蛋白氨基酸总量的10,,而乳蛋白质中是不含L-羟脯氨酸的,如果乳与乳制品蛋白水解氨基酸中检出L-羟脯氨酸,则可证明乳与乳制品中掺假。 二、 任务来源 任务来源:吉林省卫生厅 任务编号:DBS22/010 - 2012 归口单位:吉林省卫生厅 起草单位:吉林省疾病预防控制中心 三、 制定标准的必要性和意义 国家卫生部最近公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二 - 3 - 批)》的通知明确规定乳及乳制品、含乳饮料中不得添加水解动物蛋白作为蛋白质来源。L-羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,但不属于20 种常见氨基酸,同时,由于这类掺假物在成分上与奶粉本身成分的相似性,利用一些常规的检测方法都不能成功检出。但到目前为止,全国还没有相应的检测方法,各部门都是参考相关文献进行检测,因此为有效控制乳与乳制品的质量,拟建立快速灵敏地测定乳与乳制品中水解动物蛋白—L-羟脯氨酸的方法。 四、 标准制定的主要过程 1、前期工作 实验室在2011年,通过查阅最新的资料和技术文献,确定了测定L-羟脯氨酸的技术路线,对方法的检出限、回收率、精密度进行了系统研究,建立了一个操作简便、灵敏度高、选择性好、能为我省大多数的检测机构所使用的方法,为食品中L-羟脯氨酸检测提供了技术依据。由于目前国家标准和地方标准中没有测定食品中L-羟脯氨酸的方法,据此向吉林省卫生厅提出食品安全地方标准制定 申请 关于撤销行政处分的申请关于工程延期监理费的申请报告关于减免管理费的申请关于减租申请书的范文关于解除警告处分的申请 。 2、实验室间的验证工作 2012年5月,进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个 实验室的检测数据,验证了方法的准确度和精密度、检出限等。参 加验证的实验室一致认为:该方法适用于测定食品中L-羟脯氨酸的 含量,具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。 五、 制定标准的原则和依据 本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则,尽可能 - 4 - 与国际通行标准接轨,注重标准的可操作性,严格按照GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则》和GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分:化学分析方法》的要求进行编写。 六、 标准主要条款的说明 1、 标准的名称 乳与乳制品中L-羟脯氨酸含量的测定 2、 标准的范围 本标准规定了乳与乳制品中L-羟脯氨酸含量的测定方法,适用于乳与乳制品的测定。 3、 方法原理 第一法 分光光度法:试样用硫酸水解,L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后,与对二甲氨基甲醛放映生成红色化合物,在波长558nm处测定吸光度并与标准比较定量。 第二法 高效液相色谱法:试样经蛋白水解后,取上清液用丹磺酰氯在避光条件下衍生反应,生成具有荧光基团的稳定化合物,以乙腈和乙酸钠缓冲液为流动相,经ODS-C18 色谱柱分离,荧光检测器(激发波长330 nm,发射波长530 nm)检测,外标法测定试样中L-羟脯氨酸的含量。 第三法 超高效液相色谱质谱法:试样经蛋白水解后,取上清液用丹磺酰氯在避光条件下衍生反应,生成具有荧光基团的稳定化合物,以乙腈和甲酸水溶液为流动相,经ODS-C18 色谱柱分离,多离子反应方式(MRM)检测,外标法定量。应用子离子扫描方式对阳性样品进行定性确认。 - 5 - 4、前处理条件 4.1第一法 分光光度法:取液体乳样10.0g (乳粉1.0g加水至10.0g左右)至100ml具塞比色管中,加入30ml硫酸溶液,盖上塞子,置于恒温干燥箱中, 105?水解6h。趁热将水解产物用滤纸过滤至250ml容量瓶中,用10ml硫酸溶液分3次洗涤比色管和滤纸,滤干后,再用10ml水洗涤滤纸,合并上述溶液,用水定容至刻度,摇匀,所得溶液为水解液。用移液管移取10ml水解液至100ml容量瓶中,加水50 ml,然后用氢氧化钠溶液( 4.5)将pH调至中性再用水定容至刻度,所得溶液为待测液。 4.1.1 测定时间的影响。对不同浓度的溶液室温放置48h,测定其浓度,考察重复性或稳定性。1h内测定吸光度值变化不显著,结果见表1。 表1 显色后放置时间对L-羟脯氨酸待测溶液吸光度的影响 浓度 0μg/mL 0.5μg/mL 1.0μg/mL 1.5μg/mL 2.0μg/mL 显色后现测 0.059 0.158 0.276 0.381 0.486 显色后20min 0.061 0.159 0.272 0.379 0.484 显色后60min 0.062 0.156 0.263 0.376 0.480 显色后24h 0.058 0.121 0.157 0.188 0.346 显色后48h 0.060 0.082 0.116 0.121 0.166 4.1.2 反应液的影响。临用现配和放置许久的氯胺T反应液对测定结果影响较大,结果见表2。 表2 氯胺T反应液对L-羟脯氨酸待测溶液吸光度的影响 浓度 0μg/mL 0.5μg/mL 1.0μg/mL 1.5μg/mL 2.0μg/mL 反应液临用现配 0.059 0.163 0.274 0.379 0.482 反应液配制6h 后使用 0.062 0.159 0.221 0.266 0.315 反应液配制24h 后使用 0.061 0.104 0.133 0.149 0.212 用UV 法测定乳与乳制品中L-羟脯氨酸含量,显色后吸收值测定应在1h 内完成,随着放置时间的延长,测定值逐渐减小且不稳定;氯胺T反应液配制后的 - 6 - 放置时间对试验结果影响较大,要做到临用现配;样品酸化水解6h、12h、24h 对L-羟脯氨酸回收率测定无显著差异,证明酸化6h可以满足完全水解的目的。 本方法测定乳与乳制品中的L-羟脯氨酸含量,检测条件稳定,加标回收率高,RSD较小,仪器要求低,应用简单方便。该方法适合于基层实验室开展。 对基层开展乳与乳制品中的L-羟脯氨酸含量检测工作具有现实指导意义。 第二法 高效液相色谱法和第三法超高效液相色谱质谱法:准确称取固体乳粉0.1 g,液态乳0.5 g于安培瓶中,加入3 mL蛋白水解剂,充分混匀,有酒精喷灯封口,置于恒温干燥箱中, 110?水解24h。吸取1.00mL样液到10 mL具塞玻璃试管中,加入1.00 mL碳酸钠缓冲液,1.00mL丹磺酰氯溶液,充分混合,室温避光衍生反应90-120min,加入0.10mL 盐酸甲胺溶液涡旋混合,以终止反应,避光静置至沉淀完全。取上清液经0.22 µm微孔滤膜过滤,取滤液备用。衍生物在4?可避光保存48h。 4、 仪器分析条件 第一法 分光光度法:用空白管做参比,在波长558nm处以紫外分光光度计测定其吸光度值。 第二法 高效液相色谱法 色谱参考条件 色谱柱: C18 250×4.6 mm,5μm或相当者。 流动相:水相:10 mmol/L乙酸钠(pH=4.8); 有机相:乙腈。 流速:1.0 mL/min。 柱温:35?。 进样量:10 μL。 荧光检测波长:Ex=330nm,Em=530 nm。 - 7 - 梯度洗脱参考条件:见表1 表1(色谱分离)梯度洗脱条件 时间有机梯度变化 水相 (min) 相 曲线 0.0 95% 5% 0 2.0 95% 5% 1 30.0 65% 35% 6 35.5 65% 35% 1 100 40.0 0% 6 % 100 55.0 0% 1 % 5 60.0 95% 6 % 注:流动相比例可根据情况适当调节 L-羟脯氨酸分子质量较小,极性较大,与丹磺酰氯反应后能生成具有强烈荧光的物质,并且通过梯度调节,减少流动相中乙腈的比例,可以和其他的氨基酸很好的分离。实验表明,L-羟脯氨酸在激发波长(Ex)=330nm,发射波长(Em)=530nm下有强烈的荧光吸收。 同时我们对不同的pH值、不同浓度的乙酸钠为流动相进行了实验,结果发现流动相A的pH值越低,样品出峰的时间越晚;乙酸钠的浓度过低则样品峰的峰形较宽,分离越差,综合各方面的情况后选择0.03mol/L的乙酸钠(pH=4.8)作为流动相A。此方法比分光光度法的灵敏度高,检出限低。 - 8 - 第三法 超高效液相色谱质谱法 参考色谱条件 色谱柱:UPLC BEH T3 2.1×100 mm,1.8μm或相当者。 流动相:水相:0.1%甲酸;有机相:乙腈 流速:0.3 mL/min。 柱温:35?。 进样量:5 μL。 梯度洗脱参考条件:见表2 表2 (色谱分离)梯度洗脱条件 时间(min) 水相 有机相 梯度变化曲线 0.0 90% 10% 0 1.0 90% 10% 1 3.5 40% 60% 6 3.7 0% 100% 6 4.8 0% 100% 1 5.0 90% 10% 6 注:流动相比例可根据情况适当调节 检测离子参数选择:见表3。 表3 L-羟脯氨酸离子选择参数表 化合物 母离子 定量子离子 碰撞能量 定性子离子 碰撞能量 离子化方式 L-羟脯氨酸 365.16 170.15 24 86.04 14 ESI+ 此方法可用于在用高效液相色谱仪检出样品中L-羟脯氨酸后进行确认试 验,避免出现假阳性。 6、 检出限 - 9 - 分光光度法为2.0mg/100g;高效液相色谱法为0.5mg/kg;超高效液相色谱质谱法为5.0μg/kg。 7、 线性范围 分光光度法为0-10.0μg/mL;高效液相色谱法为线性范围为1.0-100.0μg/mL;超高效液相色谱质谱法为1.0ng/mL—200.0ng/mL。 8、 准确度、精密度 第一法:称取已知含量的同一样品4份 ,每份10 g,分别添加浓度为500μg/ml的L-羟脯氨酸标准溶液 1 . 0、 2 . 0、 3 . 0、4 . 0 ml。 按照本方法的样品处理方法处理后测定,分别测定6次,实验结果见表4。 表4 方法的精密度和准确度实验结果 样品 加入量(μg) 平均检出量(μg) 加标回收率(% ) 相对标准偏差(% ) 1 500 447.6 89.5 3.46 2 1000 909.8 91.0 2.89 3 1500 1379.4 92.0 3.12 4 2000 1806.6 90.3 2.54 从表中结果上可以看出 ,本方法添加水平在500,2000μg的范围内 ,其加标回收率在 89.5% ,92.0%之间 ,平均为90.7% ,相对标准偏差为3.0% ,满足乳及乳制品中羟脯氨酸的分光光度测定方法的要求。 第二法:在样品中加入L-羟脯氨酸标准物质,进行准确度与精密度实验,结果为L-羟脯氨酸回收率为93.5%-111.0%,相对标准偏差为1.46%-7.56%;实验结果见表5。 表5 L-羟脯氨酸准确度与精密度试验(n=6) RSD(%) 样品 本底值(μg) 添加量(μg) 测定值(μg) 回收率% - 10 - 1 0 20.0 21.9 109.5 7.56 0 20.0 18.7 93.5 0 20.0 21.6 108.0 0 20.0 19.0 95.0 0 20.0 22.2 111.0 0 20.0 19.8 99.0 2 0 160.0 158.3 98.9 1.46 0 160.0 162.5 101.6 0 160.0 157.9 98.7 0 160.0 159.0 99.4 0 160.0 161.6 101.0 0 160.0 163.4 102.1 3 0 320.0 316.3 98.8 1.64 0 320.0 310.5 97.0 0 320.0 312.9 97.8 0 320.0 315.8 98.7 0 320.0 325.7 101.8 0 320.0 316.8 99.0 第三法:在样品中加入L-羟脯氨酸标准物质,进行准确度与精密度实验,结果为L-羟脯氨酸回收率为91.5%-109.0%,相对标准偏差为2.59%-8.06%;实验结果见表6。 表6 L-羟脯氨酸准确度与精密度试验(n=6) RSD(%) 样品 本底值(μg) 添加量(μg) 测定值(μg) 回收率% 1 0 20.0 18.9 94.5 8.06 0 20.0 18.0 90.0 0 20.0 20.9 104.5 0 20.0 18.3 91.5 - 11 - 0 20.0 21.8 109.0 0 20.0 18.5 92.5 2 0 60.0 57.8 96.3 3.65 0 60.0 59.1 98.5 0 60.0 57.2 95.3 0 60.0 61.5 102.5 0 60.0 62.3 103.8 0 60.0 57.6 96.0 3 0 80.0 77.1 96.4 2.59 0 80.0 75.9 94.9 0 80.0 82.7 103.4 0 80.0 81.5 101.9 0 80.0 79.0 98.8 0 80.0 78.4 98.0 七、 方法验证 本方法经三个实验室的技术人员进行了方法验证试验。 八、 验证结论 经验证该检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定食品中L-羟脯氨酸的检测要求,其方法方便、快捷,应推广应用。 九、本标准作为强制性地方标准的建议 通过以上一系列的实验研究,建立了乳与乳制品中L-羟脯氨酸检测方法。该方法准确可靠。建议把《食品安全地方标准乳与乳制品中L-羟脯氨酸的测定 》作为强制性地方标准批准发布。 十、 贯彻标准要求和措施建议 - 12 - 1、技术措施 要求熟练掌握前处理技术,了解仪器性能、原理,且能熟练操作,能对检测结果进行分析。 2、管理措施 本技术标准在实施过程,严格执行检验规范,熟悉检验方法和有关的法规,做到科学、公正、准确、不受其他因素干扰,确保检验结果的准确可靠。 3、实施 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 3.1 本标准由吉林省卫生厅发布, 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 于xxxx年xx月xx日发布实施,由xxxx行政主管部门负责监督实施。 3.2 该标准被批准后,组织力量,进行宣贯实施,通过该标准的贯彻实施,确保食品安全和保障人体健康等方面将产生巨大的经济效益和社会效益。 十一、参考文献 [1]田艳玲.乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定方法. 中国食品添加剂,2008, 19 (3) : 145 - 147. [2] GB /T 9695. 23 - 2008 / ISO 3496 - 1994. 肉与肉制品羟脯氨酸含量测定. [3] 赵娟,夏淑鸿,张向荣等。生鲜乳中L-羟脯氨酸测定方法的研究.中国奶牛,2011,11:55-57. [4] 陈裕华 ,廖仕成 ,李瑞园等. 乳及乳制品中羟脯氨酸测定方法的研究. - 13 - 职业与健康, 2010, 26(3):283-285. [5] 张笑,刘杰,黄明娟. 乳及乳制品中L-羟脯氨酸的测定. 中国乳品工业, 2010,38(10):52-54. [6]肖雪花,陶保华,任一平.超高效液相色谱柱前衍生法测定奶粉及其他乳制品中L-羟脯氨酸. 中国职业医学,2011,38(8):66-67. [7]王一红,冯加力,潘振球等.液相色谱-质谱/质谱联用技术分析18种游离氨基酸. 中国卫生检验杂志,2006,16(2):161-163. - 14 -
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