DNA提取方法

DNA提取方法 实验十六 真核基因组DNA的分离纯化 核酸的分离与提取是分子生物学研究中最重要的基本技术之一,核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 核酸分离提取的原则 核酸包括DNA、RNA两种分子,在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子,原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子,有些噬菌体DNA为单链环状分子,大多生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点,如真核生物mRNA分子多数在3'端带有Poly A结构。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内,其它5%为细胞器DNA,如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中,约占75%,另有10%在细胞核中,15%在细胞器中。 分离纯化核酸总的原则,?应保证核酸一级结构的完整性,完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求,,?排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染,纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子,蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度,无其它核酸分子的污染,如提DNA分子时,应去除RNA分子。, 为保证分离核酸的完整性及纯度,应尽量简化操作步骤,缩短操作时间,以减少各种不利因素对核酸的破坏,在实验过程中,应注意以下条件及要求,?减少化学因素对核酸的降解,避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操作多在pH4~10条件下进行,?减少物理因素对核酸的降解,强烈振荡、搅拌,细胞突置于低渗液中,细胞裂解,反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子,对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子,威胁相对小一些,?防止核酸的生物降解,细胞内、外各种 2+核酸酶作用于磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构,DNA酶需要Mg、Ca2+的激活,因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA,柠檬酸盐,可基本抑制DNA酶的活性,而RNA酶,不但分布广泛,极易污染,而且耐高温、耐酸碱,不易失活,所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品,若不能马上进行提取,应将材料贮存于液氮中或-70?冰箱中。 核酸提取的主要步骤,无外乎破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其 它不需要的核酸分子,沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质,最后得到纯化的核酸。 应用分子生物学技术分析基因组完整结构和功能,首先必须制备纯化的高分子量DNA,真核生物的一切有核细胞,包括培养细胞,都可以用来制备DNA。 提取真核基因组DNA的方法由两部分组成,先温和裂解细胞及溶解DNA,使DAN与组蛋白分离,完整地以可溶形式独立分离出来,接着采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其它分子。 真核细胞的破碎有各种手段,包括超声波、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法,为获得大分子量的DNA,避免物理操作导致DNA链的断裂,一般多采用后者温和裂解细胞。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提,反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多,因此有人使用80%甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法,可得>200kb的DNA片段。 根据不同的实验要求,可选择不同的实验方法制备真核染色体DNA。 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 一 组织细胞DNA提取(酚抽提法) 【原 理】 将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质。破坏细胞膜、核膜,SDS可使组织蛋白与DNA分子分离,EDTA能抑制细胞中DNase的活性,使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中,再用酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质,,氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染,异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡,得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化,为获得高纯度DNA,操作中常加入RNase除去RNA,此法可获得100~200kb的DNA片段,适用于构建真核基因组文库,Southern blot分析。 【试 剂】 1、组织细胞裂解液 100~200μg/ml 蛋白酶K 10mmol/L Tris,Cl,pH8.0, 0.1mol/L EDTA (pH8.0) 0.5% SDS 20 μg/ml RNase A 2、平衡酚,用0.5mmol/L Tris,Cl饱和,pH8.0,, 3、氯仿/异戊醇,24,1v/v, 4、3mol/L乙酸钠,NaAc,pH5.2, 5、冷无水乙醇,AR, 6、70%乙醇,-20?静置, 7、TE缓冲液,10mmol/L Tris,Cl、1mol/L EDTA (pH8.0) 【操作步骤】 1、根据样品类型,采用以下方法之一作为步骤1, a、细胞样品 贴壁培养细胞约107个,用冰预冷的Tris缓冲液,TBS,见附录,冲洗2次,以细胞刮棒收集于TBS中。离心1500g×10min,弃上清。或用胰酶消化后再离心收集,以TE,pH8.0,重悬细胞离心洗涤1~2次,悬浮生长的细胞,于4?1500g离心10min收获细胞,以TBS重悬细胞离心洗涤1~2次。 3b、组织标本 取新鲜或冰冻组织块0.3~0.5cm,剪碎,加TE缓冲液400μl进行匀浆,转入1.5mlEp管中,加等体积2×组织细胞裂解液混匀。或从液氮中取出组织于陶瓷研钵中,加少许液氮研碎,将粉末转入1.5mlEp管。,液氮操作,应注意保护眼、手以免冻伤,。 c、血液标本 新鲜血液与ACD抗凝剂按6,1进行混匀,0?以下可保存数天或-70?长期冻贮、备用。 ACD抗凝剂配方,柠檬酸 0.45g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 抗凝血离心1500g×10min,弃上清,血浆,,冷藏血液于水浴中融化后用等体积PBS稀释,离心3500g×15min弃上清,。 2、将以上各种来源的组织加组织细胞裂解液400~500μl,混匀于37?温浴12h~24h,或37?温浴1h后转50?水浴3h,裂解细胞、消化蛋白,,并经常摇动。 3、反应液冷却至室温加500μl平衡酚,缓慢颠倒10min混匀。 4、离心5000g×15min,转上层水相于新Ep管中,,必要时重复酚抽提一次,。 5、加氯仿/异戊醇,24:1,450μl,混匀后离心5000g×10min。 6、转上层水相于新Ep管中,加1/10体积3mol/LNaAc和2.5倍体积无水乙醇,混匀,置-20?1h。 7、离心10000g×15min,弃上清。 8、以70%冷乙醇洗涤1~2次,真空抽干或自然吹干,,勿使DNA沉淀完全干燥,否则极难溶解,加热可促其溶解,。 9、沉淀溶于100μl缓冲液,置-20?保存。 【注意事项】 1、所配试剂pH要准确,否则影响结果,酚的pH值必须接近8.0,以防离心后DNA滞留于水酚双相的交界面,主要为蛋白质,上。 2、蛋白酶K在正式使用前应作预试验,明确其活性大小。 3、测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收,A/A之比应大于1.75,低于此值则 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明制备物中260280 存留有显著量的蛋白质。 4、对于细胞裂解中加入较高浓度的胰RNaseA,20μg/ml,是考虑到0.5%SDS的存在,使RNase不处于最高活性状态。在细胞裂解时加入RNase,可省去传统方法中DNA抽提后再加RNase处理的步骤。 5、DNA抽提液中的EDTA浓度宜为0.1mol/L,可有效抑制DNA酶且易与酚分层。 方案二 外周血白细胞DNA提取(NaI法) 【原 理】 从全血制备白细胞DNA,可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜,释放出血红蛋白及细胞核,使核酸处于易提取状态,加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离,用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全,异戊醇去泡沫,,DNA存在于上层水相中,以37%异丙醇沉淀DNA,离心弃去异丙醇,并重复操作一次,即可获得白细胞DNA。用NaI法提取白细胞中的DNA可用于Southern杂交、PCR等。 【试剂及配制】 1、6mol/LNaI 配制,0.75gNaSO溶于40ml ddHO加45gNaI,并搅拌至完全溶解,约30min,,用Whatman滤纸过232 滤,避光保存可达3~4个月。 2、氯仿/异戊醇,24:1V/V,混合液,应装密封瓶中保存。 3、异丙醇,isopropanol,,AR, 4、37%异丙醇 5、双蒸水,ddHO,,高压灭菌, 2 6、1mol/L三羟甲基氨基甲烷,Tris,,pH8.0, 称取121.14克Tris溶于800ml双蒸水中,并加浓HCl约42ml,使溶液冷至室温,调正pH至8.0后,定 容至1L,分装,高压灭菌。 7、0.5mol/L乙二胺四乙酸钠盐,EDTA-Na,,pH8.0, 2 称取186.10克EDTA-Na?2HO溶于800ml水中,用NaOH调至pH8.0后,定容至1L,分装,高压灭菌。 22 8、TE缓冲液,pH8.0,,10mol/L Tris-Cl、2mmol/L EDTA, 取上述试剂6,1mol/L Tris,10ml,试剂7,0.5mol/L EDTA,2ml加双蒸水至1L混匀,高压灭菌。 【操作步骤】 1、取新鲜抗凝血100μl置Eppendorf,Ep,管中,离心10000rpm×1min。 2、弃上清,加ddHO 200μl,摇匀20sec。 2 3、加6mol/L NaI 200μl,缓慢倒置摇匀20sec。 4、于管内加氯仿/异戊醇,24,1,400μl,摇匀20sec,离心12000rpm×12min 5、吸取上层水相360μl置一新Ep管中,加纯异丙醇200μl,摇匀20sec 6、室温放置15min,离心14000rpm×12min 7、小心弃去上清,再加37%异丙醇1ml,勿摇动,,离心14000rpm×12min 8、小心弃去异丙醇,晾干。 9、加50μl TE缓冲液溶解DNA,以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20?保存。 【注意事项】 1、标本必须新鲜,提取前细胞应保持完整。所用Ep管,吸嘴等器物及ddHO、试剂等应高压灭菌,操作2 尽量在4?以下进行。 2、混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动作剧烈。 3、弃异丙醇时动作应轻,切忌甩干,以免DNA丢失。 4、0.54~1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA、rRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀,在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去,所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。 细菌基因组DNA提取 快速微量提取法 1 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Eppendorf管中，13000rpm离心1min, 弃上清液，收集菌体。 2 加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠, 1mMEDTA， 1%SDS,pH7.8)混匀,置于37?水浴1h。 3 然后加入200ul 5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 4 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 5 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾 (3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后，溶于50ul TE溶液中，置4?保存备用。 蛋白酶/SDS法制备 1 取10ml菌体(如:Delftia sp)过夜培养物于一灭菌Eppendorf管中，4000rpm离心10min收集菌体。 2 用Washing TE(50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA pH8.0)洗菌体2次。 3 将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50?放置3h~5h。 4 接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次。 5 氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 酚氯仿 1 细菌收集:取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。 2 菌体裂解:加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37?作用2h。再加2mol/L NaCl50μl，10% SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50?作用3h或37?过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体) 3 抽提:菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚?氯仿?异戊醇(25?24?1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去) 4 沉淀:加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。 5 洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。 6 抽(凉)干后，溶于50μl ddH2O中 通用方法 1 过夜培养细菌。 2 离心后收集菌体，并悬浮在 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.中。 3 重悬菌体放入-20?保存。 4 在冰冻的悬浮物重加入0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml溶菌酶，室温解冻菌体，解冻后置冰上45分钟。 5 加入1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml蛋白酶K，50?水浴60分钟。 6 用6ml Tris-苯酚(1:1)抽提，然后 10000g离心15分钟，将上清转移到新的Ep管中，必要时再重复此步骤。 7 加入1/10体积3M醋酸钠，轻柔混匀。再加入2倍体积95%乙醇，颠倒混匀。 8 将絮状DNA转移到5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase.溶液中，4?摇动溶解过夜。 9 加入等体积氯仿抽提，颠倒混匀，10000g离心5分钟，将上清转移到新的Ep管中。 10 加入1/10体积3M醋酸钠，轻柔混匀。再加入2倍体积95%乙醇，颠倒混匀。 11 将絮状DNA转移到5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA。 12 Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 13 电泳和分光光度计检测基因组DNA纯度。 方法五 1 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS(裂解细胞), 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K(降解蛋白), 混匀, 37?保温1小时。 3 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4 加1.5ml CTAB(去除多糖成分)/NaCl溶液, 混匀, 65?保温20分钟。 5 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20?保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 注: 1 CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2 氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 血液基因组DNA提取 方法1 1 取0(5ml抗凝全血放人一支1(5ml离心管中，加入二倍体积的红细胞裂解液(0(155mol,L NH4Cl，0.01mol/L NaHCO3，0.127mol/L EDTA)，混匀。 2 室温下静置20min，以溶解红细胞，10000r/min 离心10min，使血细胞沉淀下来，弃上清。 3 重复上述操作2-3次，以彻底除去血红蛋白。直至在离心管底出现白色的白细胞沉淀。 4 加入DNA抽提液(10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.1mmol EDTA(pH8.0)，1.0 % SDS)0.5ml，悬起沉淀的白细胞。 5 37?水浴保温1h后，高速振荡10-15s，再沸水浴10min后，10000r/min 离心 10min，使细胞碎片及变性蛋白质沉淀， 6 在上清液中加入2倍体积的95%的冰冻乙醇，静置沉淀20min，12000r/min 离心15min，弃上清，自然晾干，加入30ulTE备用。 改良CTAB法 1 在装有血液的2 ml离心管中加入500 ul预热的4xCTAB提取液和2ul β一巯基乙醇，使材料完全分散在提取液中，65?温浴约1.5 h( 2 待冷却至室温后加入等体积的氯仿—异戊醇(24:1)，上下颠倒离心管，温和混匀5 min。 3 然后离心5 min (1 000 rad,min)(将上清液转管，反复抽提3次(最后一次离心10 min( 4 吸取上清液，加入70 体积的异丙醇，沉降DNA，轻轻颠倒2-3次，可见白色絮状沉淀，室温下静置30 min以上。 5 然后10 000 rad,min离心7 min，弃上清(用200 uL 70%的乙醇和无水乙醇各洗2次，每次离心2 min后，弃上清。 6 然后将离心管放在37? 烘箱中(或室温下)使乙醇挥发(待总DNA 干燥后加50ul TE溶液和1.5ul RNase于37?水浴中温浴2 h，然后于-20?(或4?)冰箱中保存备用( 饱和氯化钠抽提法 1 取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混匀; 2 室温离心，10000rpm ，1分钟; 3 弃上清，加入0.4ml TE(pH 8.0)，混匀，悬浮细胞; 4 加入10mg/ml蛋白酶K 5μl(终浓度100μg/ml),10% SDS 25μl(终浓度0.5%)，混匀; 5 37?水浴消化过夜，或50?消化4小时; 6 加入1/3体积的饱和氯化钠，充分混匀，4?静置10分钟; 7 10000rpm离心10分钟，取上清于另一新管中; 8 加入等体积氯仿，混匀，10000rpm离心10分钟; 9 取上清于另一新管中，加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2)混匀; 10 加入2倍体积无水乙醇轻轻混合，10000rpm离心1分钟; 11弃上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗涤; 12 10000rpm离心1分钟，弃上清，自然干燥DNA约5分钟; 13 加入200-250μl TE，-20?保存; 14 检测浓度及纯度。 酚氯仿抽提法 1 外周血反复冻溶破坏红细胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混匀后，10000rpm 离心10分钟; 2 弃上清，加入180μl TE(pH 8.0)，20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl(终浓度100μg/ml)混匀; 3 37?水浴消化过夜，或50?消化4小时; 4 加入等体积的饱和酚并充分混匀，10000rpm离心10分钟; 5 吸取上清液于另一新管中，重复上一步骤一次; 6 吸取上清液于另一新管中，加入等体积的酚氯仿并充分混匀，10000rpm离心10分钟; 7 吸取上清液于另一新管中，加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2) 混匀后，加入2倍体积无水乙醇并轻轻混合，可见絮状乳白色DNA团块，10000rpm离心10分钟; 8 弃上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗涤; 9 10000rpm离心1分钟，弃上清，自然凉干后加入TE液，-20?保存; 10 检测浓度及纯度 动物组织基因组DNA提取 材料 1 生理盐水 2 十二烷基硫酸钠(SDS) 3 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4 乙二胺四乙酸(EDTA) 5 饱和酚 6 氯仿 7 异戊醇 8 无水乙醇 9 75%乙醇 10 蛋白酶K 11 RNase酶 12 手术剪刀、镊子、吸水纸 13 微量取液器 14 研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔 试剂配制 , Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法: 40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。 , 生理盐水: 0.85%NaCL 100ml 配制方法:在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。 , EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法:将9.08g的EDTA•Na2•2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒(慢慢逐步加入)调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA•Na2•2H2O。 , TES缓冲液(释放DNA) 100ml 配制方法:将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。 , 10% SDS(变性剂 破细胞壁)100ml 配制方法:将10g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于80ml双蒸水于68?加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4?保存备用。 , 蛋白酶K(降解蛋白质):20mg/mL 无菌三蒸水溶解。 , RNA酶 (降解RNA) 配制方法:将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/L的Tris•CL(PH7.5)、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100?加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20?。 , 氯仿:异戊醇=24:1 100ml 按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4?保存备用。 , TE缓冲液(溶解DNA) PH8.0 50ml 配制方法:将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中， 调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4?保存备用。 实验操作方法 一、1 组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5ml离心管中，剪碎。 2 加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS(10%)，5.0ul蛋白酶K(20mg/ml)，充分混匀后，于56?C保温4-6h，每2h摇1次。 3 放置到室温，加入等体积饱和酚(500ul)，颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。 4 加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。 5 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。 6 加入2.5倍体积的-20?C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。 7 12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。 8 -20?C保存的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55?C干燥DNA。 9 加入适量TE溶解DNA(具体依DNA的多少而定)，-20?C保存备用。 二、1 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3)，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl，混匀。在65?恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37?水浴12,24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 2 加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。(可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行) 3 加等量的酚-氯仿-异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4 取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 6 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 7 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。 8 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 9 加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4?或?C20?保存备用。