bca蛋白浓度测定
化学名称:2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠
CAS号:979-88-4
分子式:C20H10N2Na2O4 ? xH2O
分子量:388.28
化学性质:淡黄色粉末、有吸湿性,溶解于水或者乙醇。
质量
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
外观Appearance
淡黄色粉末
红外光谱鉴别Infrared spectrometry<
符合
纯度Purity
?98.0% (HPLC)
水分Moistrue
?4%
铁Iron(Fe)
<5PPM
重金属Heavy Metals
<5PPM
灼烧残渣Residue On Ignition
?0.1%
水溶性试验Solubility
500mg/ml水
摩尔吸收系数Molar Absorptivity
3.74*104(氧化产物)
应用范围
该复合物在562 nm处有最大吸光值,并与蛋白浓度成正比。以BSA为标准品求得标准曲线,进而计算未知蛋白样品的浓度,故BCA常用于蛋白定量
检测
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,是蛋白定量试剂的重要原料。应用
BCA法是近来广为应用的蛋白定量
方法
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。其原理与Lowery法蛋白定量相似,即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。 器材
1. 7220型分光光度计
2. 比色杯
3. 恒温水浴箱
4. 中试管7支
5. 枪式移液管
试剂
1. 试剂A: 1%BCA二钠盐 2%无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4%氢氧化钠 0.95%碳酸氢钠混合调PH值至11.25。
2. 试剂B:4%硫酸铜。
3. CA工作液:试剂A100ml+试剂B2ml混合。
4. 蛋白质标准液:用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1~5mg/ml的蛋白质标准液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)
5. 待测样品:用双缩脲测定法的样品稀释而成。
注意事项
1) 使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深,并且显色反应的速度和温度有关,因此需注意保持定时和定温,以确保精确定量。
2) 低温或长期保存,若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生。请37ºC温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染,则应丢弃,避免对实验结果造成影响。 3) 实验操作规范,提高上样量的精确度。
4) 每次测定都需做相应的标准曲线,因为显色反应与温度和时间的变化有关,精准的蛋白定量宜每次都做标准曲线。
操作方法
一、配制标准品和工作液
1. 配制BSA标准品体系
注:标准品稀释液为蛋白样品的溶解液,原则上蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。
BSA标准品体系配制可参考
表
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一。
表一BSA标准品体系配制(微孔板检测,线性范围20-2000μg/ml)* 管号 稀释液体积(µL) BSA来源及体积(µL) BSA终浓度(µL/mL)
2000 A 0 300的原液
1500 B 125 375的原液
1000 C 325 325的原液
750 D 175 175的B管稀释液
500 E 325 325的C管稀释液
250 F 325 325的E管稀释液
125 G 325 325的F管稀释液
25 H 400 100的G管稀释液
I 400 0 0=空白 *如用比色皿检测,每管需加100μl标准品,按3个重复计算,每个浓度至少需配制300μl。 加强试管协议的稀释
方案
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(活性范围=5-250µg/mL)可参考表二
表二
管号 稀释液体积(µL) BSA来源及体积(µL) BSA终浓度(µL/mL)
250 A 700 100的原液
125 B 400 400的A管稀释液
50 C 450 300的B管稀释液
25 D 400 400的C管稀释液
5 E 400 100的D管稀释液
F 400 0 0=空白
2. 配制BCA工作液
1) 计算所需要的总BCA工作液体积。
总BCA工作液体积=(标准品+待测样品)×重复数×每个样品所需要的BCA工作液 注:比色皿检测时每个样品加2.0ml BCA工作液,微孔板检测每个样品加200μl BCA工作液。
2) 配制BCA工作液:50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B(A:B=50:1) ,充分混匀。
注:BCA试剂B加入BCA试剂A中后,迅速浑浊,通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内,室温条件24h稳定。
二、检测方法
1. 比色皿检测方法(样品:BCA工作液=1:20)
1) 各取100μl标准品和待测样品加入到反应管中。
2) 每管加入2.0ml BCA工作液,混匀。37?孵育30min。
注意:也可室温孵育2h,或者60?孵育30min。BCA检测蛋白浓度,延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限,以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低,可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。 3) 冷却到室温。在分光光度计上进行检测,设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在10分钟内对所有样品读数。
注意:由于BCA反应达不到真正的反应终点,即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是,由于室温下生色比率相当低,因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试,不会导致明显错误。
4) 根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml;Y-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
2. 微孔板检测方法(样品:BCA工作液=1:8)
1) 各取25μl标准品和待测样品加入到微孔板中。
注:样品与工作液比例为1:8,若样品有限,可使用10μl标准品和待检测样品进行检测(即1:20),这时试剂盒的检测范围为125-2000μg/ml。
2) 每孔加入200μl BCA工作液,振荡30s充分混匀。盖上微孔板,37?孵育30min。 3) 冷却到室温,在酶标仪上的540,595nm波长范围处检测吸光度,其中562nm波长为最佳。
注意:a)由于酶标板的光径比比色皿短,使得酶标板检测需要更好的样品:BCA工作比率来获得相同的检测灵敏度。若使用高于562nm的检测波长,建议延长孵育时间到2h。b)延长孵育时间或者提高样品:BCA工作比会增高每个孔的OD562nm净值,并且降低检测下限和工作线性范围。
4) 根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml;Y-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
附录表:BCA蛋白浓度测定的兼容性耐受浓度
Sodium bicarbonate 100 mM
Sodium phosphate 25 mM
2-Mercaptoethanol 0.01%
Glycercol (pure) 10%
Glycine-HCl, pH 2.8 100 mM
HEPES 100 mM
Hydrochloric acid 100 mM
Leupeptin 10 mg/L
Nickel chloride (in TBS, pH8.0) 10 mM Nonidet P-40 (NP-40) 5% (w/v) Octyl β –glucoside 5% (w/v)
Potassium thiocyanate 3.0 M SDS 5%
Sodium acetate, pH 4.8 200 mM Sodium azide 0.20%
Sodium hydroxide 100 mM Sucrose 40%
Triton X-100 5%
Triton X-114, X-305,X-405 1% Tween-20, Tween-60, Tween-80 5% Zwittergent 1%
ACES, pH 7.8 25 mM
Acetone 10%
Acetonitrile 10%
Ammonium sulfate 1.5 mM
Aprotinin 10 mg/L
Bicine, pH 8.4 20 Mm
Bis-Tris, pH 6.5 33 mM
Borate, pH 8.5 50 mM
Brij-35 5%
Brij-52 1%
Brij-56, Brij-58 1%
BugBuster protein Extraction Reagent (Cat. No. 70584) no interference (undiluted)
Calcium chloride (in TBS, pH 8.0) 10 mM
CelLytic B Reagent no interference (undiluted)
Cesium bicarbonate 100 mM CHAPS 5%
Cobalt chloride (in TBS, pH 8.0) 0.8 mM
CytoBuster Protein Extraction Reagent (Cat. No. 71009) no interference (undiluted)
Deoxycholic acid 5%
Dithioerythritol (DTE) 1 mM Dithiothreitol (DTT) 1 mM DMF 10%
DMSO 10%
EDTA 10 mM
EPPS, pH 8.0 100 mM
Ethanol 10%
Ferric chloride (in TBS, pH 8.0) 10 mM
Glucose 10 mM
Glycerol 10%
Guanidine-HCl 4 M
Imidazole, pH 7.0 50 mM
MES, PH6.1 100mM
Methanol 10%
MOPS, pH7.2 100mM
N-Acetyglucosamine(10mM)in PBS, pH7.2 10mM Octyl β-thioglucpyranoside 5%
PIPES, pH6.8 100mM
PMSF 1 mM
PopCulture Reagent (Cat. No. 71092) no interference (undiluted)
Reportasol Extraction Buffer (Cat. No. 70909) no interference (undiluted)
Sodium chloride 1 M
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 200 mM Sodium ortho-vanadate in PBS, pH7.2 1mM Span 20 1%
TBS (150 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0) no interference (undiluted)
Thimerosal 0.01%
TLCK 0.1mg/L
TPCK 0.1mg/L
Tricine, pH 8.0 25 mM
Triethanolamine, pH 7.8 25 mM
Tris 250 mM
Tris(hydroxypropyl)phosphine (THP) 1 mM Urea 3M
Zinc chloride (in TBS, pH 8.0) 10 mM