雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中的表达

雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁 淤积孕鼠胎鼠肝脏中的表达 2011年 第32卷 4月 第2期 首都医科大学 JournalofCapitalMedicalUniversity Apr.2011 Vo1.32No.2 [doi:10.3969/j.issn.1006-7795.2011.02.021]?临床研究? 雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中 的表达 时青云赵晋林宇庚闰时.周新林颖奇. (1.首都医科大学附属北京世纪坛医院妇产科;2.首都医科大学附属北京友谊医院妇产科;3.四川大学华西临床医学院) 【摘要】目的探讨雌激素受体(estrogenreceptor,ERa)与胆汁酸代谢相关基因胆固醇7羟化酶(cholesterol7-hydroxylase, CYPTA1),胆固醇27羟化酶(cholesterol27-hydroxylase,CYP27A1),胆固醇12a羟化酶(cholesterol12a—hydroxylase,CYP8B1)mRNA 在妊娠期肝内胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中的表达及其意义.方法将60只清洁级sD孕鼠自孕第13天均分为2组:对照组孕鼠皮 下注射精制植物油2.0mL?,?d,;研究组孕鼠皮下注射17一ot一乙炔雌二醇1.25mg?kg,?d,.2组孕鼠分别于妊娠第13, l7,21天断尾采母鼠血2mL检测血清生物化学指标,于妊娠第21天处死.抽取母鼠,胎鼠血并提取母鼠,胎鼠肝脏组织.应用酶 联免疫吸附试验检测2组孕鼠以及胎鼠血清中胆酸浓度;应用实时定量PCR技术 检测各组胎鼠肝脏ERa,CYP7A1,CYP27A1, CYP8B1的mRNA表达量.结果?胆酸指标比较:在妊娠第17天时对照组,研究组 母鼠胆汁酸浓度分别为(24.6?1.3)I~mol/L, (58.7?3.2)p~mo]/L,研究组母鼠胆汁酸浓度明显高于对照组(t=2.462,P<0.05); 在妊娠第21天时对照组,研究组母鼠胆汁酸浓 度分别为(26.5?3.1)~xmol/L,(66.4?2.7)~mol/L,研究组母鼠胆汁酸浓度与妊娠第 17天时研究组以及对照组相比(F=5.43, P<0.05),差异有统计学意义.?胎鼠肝脏 CYPTA1mRNA,CYP27A1mRNA,CYP8B1mRNA表达:研究组中CYP7A1mRNA (1.25?0.01),CYP27A1mRNA(2.05?0.03),CYP8B1mRNA明显高于对照组(0.35? 0.02,0.75?0.03,0.85?0.02),P值均< 0.05,差异有统计学意义.?胎鼠肝脏雌激素受体的表达:研究组中ERdmRNA(0.75 ?0.02)明显高于对照组ERamRNA (0.45?0.01).结论妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepaticcholestasisofpregnancy,ICP)孕鼠胎鼠肝细胞ER,CYP7A1,CYP27A1, CYP8B1的表达升高,胆汁酸的合成与代谢调节机制存在障碍,可能是导致ICP胎 儿围生期死亡发生的原因之一. 【关键词】胆汁淤积;肝脏;胎鼠;雌激素受体;胆固醇7羟化酶;胆固醇12仪羟化酶 【中图分类号】R714.147 ExpressionofEstrogenReceptormRNAandGenesRelatedtoRegulationofBile acidMetabolisminFetalRatLiverofPregnantRatswithIntrahepaticCholestasis SHIQing—yun,ZHAOJin,LINYun.geng,YANShi,ZHOUXin,LINYing.qi (1.DepartmentofObstetricsandGynecology,BeijingShiJiTanHospital,CapitalMedicalUniversity;2.DepartmentofObstetricsand Gynecology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity;3.WestChinaMedicalSchool,SichuanUniversity) 【ABSTRACT】 ObjectiveTostudytheexpressionofestrogenreceptor(ER)andgenerelatedtoregulationofbileacidmetabolismin fetalratliverofpregnantratswithintrahepaticcholestasis.MethodsSixtycleanSDpregnantr atswereselectedanddividedintotwo groupsatrandom.? Sincethe13thdayofpregnancyaftertakingblood,theratsincontrolgroupwereinjectedsubcu taneouslywith refinedvegetableoil2.5mL?kg一?d 一,studygroupwasinjectedsubcutaneouslywiththe17一仅一 ethynylestradiol(EE)1.25mg?kg一 ? dtil1the17thday.? Onthe21day,allratswerekilled.Thenthefetusliverswerecollectedforstudy.? Thelevelsofserum totalbileacid(TBA)wereexaminedbyELISA.TheexpressionofER,CYPTA1,CYP27A1, CYP8B1(mRNA)infetalratliverwas examinedbyreal-timePCR.Results? ThelevelsofTBAweresignificantlyhigherinstudygroupmotherrats(58.7?3.2)ixmoL/L thanthatofcontrolgroup(24.64-1.3)p~mol/Lonthe17day(P<0.05);ThelevelsofTBAwe rehigherinstudygroupmotherrats (66.4? 2.7)b~molfLthanthatofcontrolgroup(26.54-3.1)p~mol/Lonthe21day(P<0.05).Thelev elsofTBAwerehigherinstudy groupfetusrats(28.4?2.6)p~moVLthanthatofcontrolgroup(10.5? 3.1)Ixmol/Lonthe21day.?TheexpressionofCYP"/A1 mRNA(1.25?0.01),CYP27A1mRNA(2.05?0.03),CYP8B1mRNA(1.85? 0.01)instudygroupfetus1iverincreasedas comparedtocontrolgroup(0.35?0.02,0.754-0.03,0.85? 0.02,respectively)(P<0.05).3)TheexpressionofERamRNAin studygroup(0.75?0.02)washigherthanthatofcontrolgroup(0.45? 0.01)(P<0.05).ConclusionTheexpressionofERa, 基金项目:国家自然科学基金(30872779)资助项 目,SupposedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(30872779) Correspondingauthor.E-mail:shiqingyunl@163.con 第2期时青云等:雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中 的表达273 CYP7A1,CYF27A1,CYP8B1(mRNA)increasedinthefetalratliverofpregnantratswithint rahepaticcholestasis.resultinginincreased synthesisofbileacids,whichmaybeoneofthemechanismsofperinataldeathofthefetalrats. 【KEYWORDS】cholestasis;liver;pregnantrat;estrogenreceptor;cholesterol7 仪.hydroxylase:cholesterol12cx—hydroxylase 妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepaticcholestasisof pregnancy,ICP)患者的重要特征为其体内胆汁酸浓度高. 围生儿病死率22.5%o,是同期总的围生儿病死率6%o一 8%o的3倍,其中死胎占56%.ICP患者胆汁酸浓度变化 与围生(产)儿不良妊娠结局密切相关_lJ.为进一步了 解围生儿不良结局的原因,本研究应用实时定量PCR测 定雌激素受体(estrogenreceptor,ERa)及胆固醇7o【羟 化酶(cholesterol7仅.hydroxylase,CYP7A1),胆固醇27 羟化酶(cholesterol27一hydroxylase,CYP27A1),胆固醇 l2羟化酶(cholesterol12or.hydroxylase,CYP8B1)在妊娠 肝内胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中的表达. 1材料和方法 1.1实验动物与分组 所有动物由首都医科大学实验动物部(动物 许可 商标使用许可商标使用许可商标使用许可商标使用许可商标使用许可 证号:22081)提供.选择清洁级SD雌性大鼠60只,体 质量300,450g,年龄150,180d,在室温18,25?, 相对湿度60%,70%的屏障系统内饲养,不控制饲料 和饮水.在发情期与雄性大鼠同笼饲养,每天观察阴 ,妊娠后 道栓脱落情况,阴道栓脱落日定为妊娠第1天 的大鼠每隔3d称体质量1次,一直饲养到妊娠第13 天待用.应用随机数字表法将SD孕鼠随机分为2组, 每组30只.对照组自孕13d起每天孕鼠皮下注射精 制植物油2.0mL?kg,?d,;研究组自孕13d起每天 孕鼠皮下注射17一Or.一乙炔雌二醇1.25mg?kg,. 1.2动物模型的建立 SD孕鼠自妊娠第13天开始分别在后肢内侧皮 下注射17—0【一乙炔雌二醇溶液(均购自美国Sigma公 司)或精制植物油溶液,连续5d至孕18d.2组孕鼠 均于用药前(妊娠13d),妊娠第l7天,妊娠第21天 断尾采血2mL,测定血生物化学指标.2组孕鼠均于 妊娠第21天,采血后颈部脱臼法处死母鼠,取母鼠肝 脏进行病理组织学检查.肝脏组织学检查见毛细胆 管内有胆汁淤积,部分肝细胞有空泡样变性,但无肝 细胞坏死,血清总胆酸,转氨酶升高为模型成功. 1.3主要仪器与试剂 TRIzol试剂盒及反转录试剂盒(购自美国Sigma 公司).实时荧光定量PCR试剂盒(购自美国ABI公 司).从GeneBank获得研究基因的全cDNA序列,以 磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphacedehy— drogenase,GAPDH)作为内参照.引物及探针(购自美 国ABI公司),参照PrimerExpress3.0软件,序列由 上海英俊生物科技有限公司合成,见表1.探针5端 标记荧光发光基团6一羧基荧光素,3端标记荧光淬灭 基团6一羧基四甲基若丹明.本研究采用ABI7300实 时定量PCR检测仪(购自美国ABI公司)检测. 表1实时相对定量PCR所用的引物和探针 Tab.1Primerandprobeinreal-timePCR Primernamemersequ…k翟一 ERa:estrogenreceptor;CYP7A1:cholesterol7d-hydroxylase:CYP27A1:cholesterol27 一hydmxylase CYP8BI:cholesterol12d-hydmxylase:GAPDH:glyeeraldehyde-3-phosphacedehydroge nase. 1.4标本采集和处理 处死母鼠后,立即取出胎鼠肝脏组织,取一部分 用于病理检查确定模型;其余部分取肝脏组织约 2cm×2cm大小,用锡纸包裹后,放入编号的冻存管 274首都医科大学第32卷 中,立即置于液氮中保存待测. 1.5实验方法 总RNA提取与cDNA的合成:将标本组织用二 乙基焦碳酸酯冲洗后,加入1mLTRIzol试剂,按说明 书中操作步骤提取RNA,紫外分光光度计(购白美国 Bio.Rad公司)进行浓度测定,确定获得的RNA纯度 及浓度,同一样本测定3次取其均值.操作按说明书 合成cDNA,合成的cDNA置于一20?保存备用. 1.6实时定量PCR 本实验采用实时相对定量PCR方法.反应体系 25L,包括PCR反应液混合物:PCRmastermix12.5 L,cDNA1L,上,下游引物各0.5L,探针0.5L, 用二乙基焦碳酸酯水补足.反应条件:50oC,2rain; 95?,10min;95,1min;60?,1min40个循环. 反应完毕后,将扩增的每份PCR产物同时进行琼脂 糖凝胶电泳分析是否为特异性产物.实时定量PCR 过程中每个样本重复3次,取平均值. 根据各自标准品建立的标准曲线,由软件自动计 算出样本中目的基因的相对mRNA含量.为了减少 差异,以目的基因mRNA相对含量和内参照基因 GAPDHmRNA相对含量的比值作为评价表达的 标准. 较用Student.Newwman.Keuls法检验,2组数据问比较 采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.12组孕鼠血胆汁酸浓度的比较 在妊娠第l3天(用药前),对照组,研究组母鼠胆 汁酸水平分别为(22.4?2.1)txmol/L,(21.3?1.9) I~moYL,2组相比差异无统计学意义(t=1.682,P= 0.1).在妊娠第17天时对照组,研究组母鼠胆汁酸 浓度分别为(24.6?1.3)I,zmol/L,(58.7?3.2)txmol/ L,研究组母鼠胆汁酸水平明显高于对照组,差异有统 计学意义(2.462,P=0.02);在妊娠第21天时对 照组,研究组母鼠胆汁酸浓度分别为(26.5?3.1) I,zmoL/L,(66.4?2.7)~mol/L,研究组母鼠胆汁酸浓 度与妊娠第17天时研究组以及对照组相比,差异有 统计学意义(F=5.43,P=0.000). 2.22组胎鼠肝脏组织中ER,CYP7A1,CYP27A1 及CYP8B1mRNA表达的比较 研究组中ERamRNA(0.75?0.02)明显高于对 照组ERmRNA(0.45?0.01),差异有统计学意义 (P<0.05),研究组中CYP7A1mRNA(1.25?0.01), CYP27A1mRNA(2.05?0.03),CYP8B1mRNA 1.7统计学方法(1.85?0.01)与对照组(0.35?0.02,0.75?0.03, 应用SPSS12.0软件,数据以均数?标准差(面?0.85?0.02)相比,差异有统计学意 义(P值分别为 S)表示,多组问的比较用方差分析,多组的两两间比4.42,4.31,5.41,P值均<0.05), 详见表2. 表2各组孕鼠肝脏CYP7A1mRNA,FXRmRNA,PPAR~,CYP27A1mRNA及 CYP8BlmRNA表达的比较 3讨论 Tab.2ComparisonofexpressionlevelsofCYP7A1mRNA,FXRmRNA,PPARoL, CYP27A1mRNA,CYP8BlmRNAintheliverofthe2groupsofrats(?5) ERc~:estrogenreceptor;CYP7A1:cholesterol7-hydroxylase;CYP27A1:cholesterol27 一hydroxylase CYP8B1:cholesterol12cL—hydroxylase. 大量的研究证实妊娠肝内胆汁淤积症患者血 清中胆汁酸浓度较正常孕妇显着升高.我们前期的 研究结果也是如此.潴留的胆汁酸可通过细胞毒作 用影响胎儿,导致胎儿缺氧,窒息甚至死亡. 我们前期的研究发现,肝内胆汁淤积孕鼠的雌 激素浓度升高,在雌激素的作用下,肝内胆汁淤积孕 鼠的肝脏ER表达增强,同时证明了肝细胞ER的变 化与孕鼠肝内胆汁淤积的发生有关. 胆汁酸在肝脏由胆固醇转变生成.正常情况下, 胆汁酸的合成,转运,代谢受到严格控制,主要是一些 反馈和负反馈机制自动调整的过程.一般认为胆汁 酸合成有2条主要途径:一是经典途径,由胆固醇7 羟化酶(CYP7A1)为限速酶催化,这一过程受到胆汁 酸的负反馈调节;另一条途径是胆固醇27羟化酶 (CYP27A1)催化的替代途径,该途径仅占人体总胆汁 酸合成的18%,并不受到胆汁酸的反馈抑制作用.胆 第2期时青云等:雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中 的表达275 汁酸激活法尼醇x受体后,主要通过调节CYP7A1, CYP27A1,胆固醇12ol羟化酶(CYP8B1)的基因表达, 来实现胆汁酸对其自身的反馈调节J.CYP8B1催化 胆酸生成鹅去氧胆酸,增加胆汁酸池的亲水性. CYP7A1,CYP27A1的异常表达可促进鹅去氧胆酸的 合成,鹅去氧胆酸继续羟化形成高毒性的胆酸J. 以上是对母鼠的胆汁酸浓度以及肝脏胆汁酸代 谢基因进行了研究,为进一步了解母鼠高胆汁酸浓度 是否会影响到胎儿鼠胆汁酸浓度以及肝脏胆汁酸代 谢基因的变化,我们进行了本研究. 本研究结果发现ICP组(研究组)母鼠胆汁酸浓 度升高,胎鼠胆汁酸浓度同样升高.表明母鼠胆汁酸 浓度的异常,同样导致了胎鼠胆汁酸浓度的改变,其 原因可能是母鼠雌激素浓度的升高影响了胎鼠胆汁 酸浓度的改变.本研究测定胎鼠肝脏雌激素受体的 变化,研究显示ICP组(研究组)中ERamRNA表达 明显高于对照组,表明胎鼠肝脏雌激素受体表达同 样发生改变.为了进一步了解胎鼠胆汁酸浓度的变 化,我们研究了胎鼠胆汁酸代谢相关基因的表达,研 究表明:ICP组(研究组)中CYP7A1mRNA,CYP27A1 mRNA,CYP8B1mRNA明显高于对照组(P<0.05). 表明胎鼠胆汁酸代谢以及自身的调节发生改变.研 究表明雌激素受体参与了雌激素介导的脱氢表雄 酮(dehydroepindrosterone,DHEA)在细胞水平的调控, DHEA在胎儿生长发育中对于维持激素水平的均衡 非常关键.本研究的结果表明由于胎鼠受到母鼠高 雌激素浓度的影响,肝脏雌激素受体发生变化,可能 会导致DHEA调控的异常,进而影响胎儿的生长发 育,同时胎鼠胆汁酸代谢基因CYP7A1mRNA, CYP27A1mRNA,CYP8B1mRNA浓度变化导致胎鼠 胆汁酸浓度的升高,而高毒性的胆汁酸与胎儿的不良 结局有关.可能是导致ICP胎儿围生期死亡发生的 原因之一,因此,临床上应积极治疗母体的高胆汁酸 浓度,降低围生儿的病死率. 4参考文献 [1]ReyesH.Sexhormonesandbileacidsinintrahepatiecho— lestasisofpregnancy[J].Hepatology,2008,47:376-379. [2]时青云,孔北华,马开东,等.熊去氧胆酸对肝内胆汁淤 积孕鼠肝脏脂质流动性,组织谷胱甘肽含量,雌孕激素 受体变化的影响[J].实用妇产科杂志,2004,20;2:110— 112. 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