包涵体蛋白纯化方法的探讨

包涵体蛋白纯化方法的探讨 按临床分期分组,,T4期NF—KB阳性表达明显岛于Tis, T1期,这与NF—KB在鼻咽癌组织中的表达情况类似.提 示,NF.KB的高阳性表达率对膀胱肿瘤细胞向深层组织浸润 有一定的促进作用,而不大影响肿瘤细胞的组织分化.因 此,栋床在手术之前,即可通过膀胱镜取组织活检,通过检测 NF—KB在膀胱移行细胞癌组织中的表达情况,判断膀胱肿瘤 细胞向深层组织浸润的大致情况,为下_”步制定治疗方案提 供依据.同时,临床若能采取某种干预 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 干预NF—KB在膀 胱移行细胞癌组织中的表达,有可能改变膀胱移行细胞癌术 后易复发的现状,从而改变今后膀胱肿瘤治疗的方向. 参考文献 [1]张薇,项永兵,刘振伟,等.1973,1999年上海市区老年人恶性肿 瘤发病趋势分析[J].中华老年医学杂志,2005,24(9):701-704. [2]魏矿荣,陈振雄,粱智恒,等.中山市1970,1999年膀胱癌发病 趋势分析[J.中国肿瘤,2004,14(4):235-237. [3]OrnsteinDL,ZacharskiLR.Ironstimulatesurokinaseplasminogen activatorexpressionandactivatesNF—kappaBinhumanprostateeallcer ? 论着? cellsllNutrCatlcer,2007,58(1):115-126. [4]ZhangJ,PengB.Invitroangiogenesisandexpressionofnuclearfac— torkappaBandVEGFinhighandlowmetastasiscelllinesofsalivary g1.ndadenoidcysticcarcinoma[J].BMCCancer,2007,7(1):95. [5]KarlnM,IAnA.NF—KBatthecrossroadsoflifeanddeath[J].Nat Iranmnol,2002,3(3):221-227. [6]Mayoj,】,BaldwinAS.ThetranscriptionfactorNF—kappaB:Control ofoneogenesisandcancertherapyresistance[J].BiochimBiophysActa, 2000,1470(2):55-62. [7]LimJW,KimH,KimKH.Nuclearfactor—kappaBregulatescy— clooxygenase-2expressionandcellprolffemfioninhumangastriccancer cells[J].LabInvest,2001,81(3):349-360. [8]黄方,康瑞,吴春林.VEGF—C,NF—KBp65及Survivin在鼻咽癌中 的表达及临床意义[J].山东大学(医学版),2009,47(6):83— 87. [9]RamdassB,MaliekalTr,IakshmiS,eta1.CoexpressionofNotehl andNF—kappaBsi~dingpathwaycomponentsinhumancervicalealleer progression[J].GynecolOncol,2OO7,i04(2):352-361. (2010一O8—23收稿) 包涵体蛋白纯化方法的探讨 陈颖,沈敏刘宝林 摘要目的:探讨包涵体蛋白的表达条件及纯化方法.方法:将PQE30 一Cysmfin转化大肠杆菌M15,通过 IPrc诱导蛋白表达.为了能够获得可溶的且有活性的 Cys~finC(CysC),本文摸索了CysC包涵体的复性条 件及蛋白表达条件.结果:改变缓冲体系pH值及离子强度等多种方 法均不能减少蛋白在复性过程中的沉淀; 同时,改变蛋白表达的OD600,培养基pH值,表达时间等均未得到可 溶性的表达蛋白;而改变诱导蛋白表达所 用的IPTG浓度后发现在低浓度(0.005raM)的IPTG诱导条件下,该蛋 白有少量的表达,但是表达量明显低于 1mMIPTG的诱导条件.结论:对于包涵体蛋白进行方法摸索的过程 中,既要对包涵体蛋白本身进行研究,更 要对蛋白表达条件进行进一步的优化,以表达可溶的蛋白. 关键词半胱氨酸蛋白酶抑制剂C包涵体可溶性表达 StudyonMethodofPurificationofInclusionBodyProtein ChenYing,ShenMin,LiuBao—lin .ShanghaiLigongUniversitySchoolofMedicalEquimentandFood,Shangh ai(200093),China DepartmentofClinicalLaboratory,AutuHospital,Shanghai(2ooo93),Chin a AbstractObjectiveTo~tudytheoptimalconditionsforexpressionofinclusio nbodyproteinandmethodofpurificationofthe protein.MethodsPQE30一 CysmtinCwastransformedintoE—ColiM15andproteinexpreasionWasindu cedwitll/PTC.Opfion9for betterrenaturafionoftheobtainedinclusionbodyproteinwerestudied.ResultsWeedvariouswaysincludingchangesofbuffer systempHandionicstrength,aswellasOD6OOforproteinexpression,e~turemediapH,expressiontime……butfailedtoobtain solubleexpressionprotein.However,weloweredtheconcentrationofIPTGsolutionfrom1mmol/Lto0.005mmol/Landfinallyoh- talnedaslightanaountofexpressedsolublefusionCystatinCprotein.ConclusionPresently,theamountofsolubleproteinobtained witlllowconcentrationofIPTGistoolittleforpracticaltLseandfurtherstudyisneeded. KeyWordsCysmfinC(CysC),inclusionbody,solubleexpression 上海理工大学医疗器械与食品学院; 上海杨浦区安图医院检验科(2ooo92) 1983年Anastasi等首次从鸡蛋清中分离纯化出高纯度 的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,尔后命名为半胱氨酸蛋白酶抑制 剂C(CystatinC,Cysc)J.它由120个氨基酸残基组成,等 电点为9.3,是一种碱性非糖化的低分子蛋白质,相对分子质 量为13300_2J.CysC又名一痕迹蛋白或球蛋白,是半肌氨 酸蛋白酶抑制剂(cP1s)家族中的一员,由所有的有核细胞以 恒定的速率产生,在人体内可自由通过肾小球滤过,在近曲 小管上皮细胞被分解代谢,不被肾小管重吸收和分泌,可用 大肠杆菌(E.c0u)进行表达J.目前,对于包涵体蛋白的 纯化方法主要有:?将表达获得的包涵体进行变性,获得再 折叠的可溶性蛋白,并采用亲和柱(如:M柱)对其进行纯 化,将纯化得到的目的蛋白再复性使其重新折叠;?蛋白在 重新折叠过程中容易受一些复性条件的影响而发生沉淀,那 么对于这些蛋白可以对其表达条件进行摸索,找到其可溶表 达的条件,然后再进行直接纯化.目前对CysC的表达方式 还是以融合表达为主,我们成功地构建了CysC原核表达质 粒,并在大肠杆菌M15中稳定表达.现对其蛋白的表达及纯 化方法进行以下探索. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1重组质粒与菌种:含CysC基因片段的重组质粒 PQE30.CysC为本实验室制备,大肠杆菌M15为本实验室保 存. 1.1.2其它试剂:丙稀酰胺,甲叉双丙烯酰胺,CBBR250购 自Biorad公司;]PTG,SDS,AP,TEMED等购自华美公司;溶 菌酶:Promaga公司;DNaseI:Sigma公司;透析袋,超滤膜, 超滤管等购自美国Milhpore公司;蛋白纯化试剂盒及Ni- NTAAgaros柱料:QIAGEN公司;JY92一?型超声波细胞粉碎 仪来自宁波新芝生物科技公司;PCA一3000型电泳仪来自 Bio-Rad公司o 1.2方法 1.2.1方法一:?重组蛋白的表达:质粒PQE30/KOX12转入 大肠杆菌M15感受态细胞中.挑取单菌落进行培养(LB,含 氨苄青霉素100ml,卡那霉素25m1),37?摇动 (250r/rain)培养,细菌生长在对数中期(OD600值0.5,0.6)时 加入异丙基.B.D.硫代半乳糖苷(1FrG,终浓度0.1mmol/L)诱 导,每隔1h取适量菌液进行电泳分析(SDS—PAGE),诱导表达 3h.?表达产物的纯化和复性:诱导表达的菌液于6000r/min, 离心5min,沉淀加入LysisBuffer后,按照QIAGEN公司的Ni— NTAagarose使用说明书进行目的蛋白纯化.将纯化后的样品 装入透trr’~中,在PBS(含1mmolDTF)中透析3次.用SDS— PAGE鉴定分子量及纯度. 1.2.2方法二:?重组蛋白的表达:方法同上,诱导时加入 IPTG的终浓度为0.005mmol/L.37?振摇170r/mln,培养 4h,菌液于4’E,6000r/min离心30min,弃上清,收集沉淀. ?洗涤:CysC表达菌在LB培养基中培养并诱导表达后,离 心收集菌体,超声破菌.冰浴条件下超声粉碎细菌条件:工 作4s或4s间歇48,全程时间20min,功率700W.超声后的 裂解液3000r/rain,离心15min,取上清. 1.2.3纯化蛋白的鉴定:采用15%SDS—PAGE电泳分析鉴 定,用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度. 一 63 2结果 经研究发现,方法一CysC蛋白在IPTG浓度为1mmol/L 时,CysC蛋白表达量最高,但是CysC蛋白在透析复性的过 程中发生沉淀,这可能主要因为透析过程中CysC蛋白所处 的离子环境的变化而发生再折叠,从而发生沉淀. 而方法二,表明在IPTG浓度为0.005mmol/L时,获得了 少量可溶表达的融合CysC蛋白.说明IPTG浓度的改变能 明显影响融合CysC蛋白的可溶性表达. 3讨论 大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的一种基因表 达系统,它具有很多优点,如遗传背景清楚,基因操作方便, 表达水平高,试验成本低等.本文在成功构建CysC基 因原核表达载体的基础上,利用大肠杆菌表达系统对CysC 进行原核表达与纯化研究,以便为将来进一步探讨CysC的 活性. 以大肠杆菌菌株为代表的原核表达系统,在短时问内能 以低成本获得大量表达蛋白,表达载体带有强的启动子,在 IFrG诱导下可高效表达,快速的蛋白合成使产物大量堆积,以 至于没有足够的时间进行正确的折叠和二硫键的配对,形成 包涵体沉淀J.包涵体的提取方法已较为成熟,但是它却引 入了一个变性.复性过程.影响复性的因素很多,首先是蛋白 分子自身的理化特性,其次是目的蛋白质的浓度及复性体系 的离子强度,pH值,温度,另外从变性体系到复性体系的转换 速度也是重要的影响因素J.很多蛋白质的复性过程很难控 制,往往会形成蛋白沉淀,一些蛋白质甚至通过稀释或透析方 法完全转换为复性体系后,由于环境的改变,而再次出现沉 淀.本文在进行Cysc融合蛋白的变性一复性过程中就出现过 这种情况,在本文的透析复性阶段发现透析袋内出现一些蛋 白沉淀,严重影响下一步工作.在实验中,我们尝试改变缓冲 体系pH值及离子强度等多种方法来减少蛋白在复性过程中 的条件变化,但是仍然无法解决问题.为了解决这个问题,我 们把问题的关键放在蛋白的可溶性表达中,试探性地摸索了 蛋白表达的OD600,培养基pH值,表达时间等均未得到可溶 性的融合蛋白,最后对诱导蛋白表达所用的IPTG进行进一步 的摸索,结果发现在低浓度(0.005mmol/L)的IFrG诱导条件 下,该蛋白有少量的融合表达,但是表达量明显低于1mmol/L WrG的诱导条件.但是表达产生的少量的融合表达给以后 的实验打下了基础. 参考文献 [1]周剑波,张廷,胡宏.Cysmfinc在评价慢性肾病患者肾小球滤过 功能中的作用[J].江苏大学(医学版),2008,18(4):348D51. [2]覃文周.血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测对诊断早期肾功能 损害的价值[J].广西医科大学,2008,25(3):4_45446. [3]陆焰,武建,宋朝辉.半胱氨酸蛋白酶抑制剂c在早期肾功能损 害诊断中的应用价值[J].中国卫生检验杂志,2007,17(3):485486. [4]李进春,侯振.半胱氨酸蛋白酶抑制剂C及其在肾脏疾病中的研 究进展[J].现代预防医学,2008,35(1):15—17. [5]王蕾,陈凌燕,高锋.半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在肿瘤研究中的 进展[J].2008,23(2):199-201. [6]XiaL//,BingXG,AnXT,eta】.SerumCp~tinc8ayfortl1ede— tecfi0nnfearlyrenalimpmrmentindiabeticpafien~[J].Jc1inLabA. 64———— hal,2004,18(1):31-35. [7]He~et-RosenthalS,FetdkampT,Vo~mchtL,eta1.Messurerment ofurinalCystafinCbyparticle—enhancednephelometrlcirrmmnoassay: precision,interferencer,stabilityandreferencerange[J].ArmClinBio— chem,20O4,41(2):11卜118. [8]黄琦,谢芝勋,庞耀珊,等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIA基 ? 论着? 因在大肠杆菌中的融合表达与纯化[J].微生物学通报,2008,35 (7):1063—1067. [9]孙强明,刘红岩,戴长柏,等.huGM—CSF(9-127),IL-6(29—184)融 合蛋白的复性及纯化研究[J].生物工程,2002,18(3):291-294. (2010—07—22收稿,2010—08—18惨回) H1N1患者心肌标志物及常规生化检测的临床意义 上海市公共卫生临床中心医学检验科(201508)韩蓉周毅杨吉康王宏萍 摘要目的:探讨心肌标志物及部分生化项目检测对于H1N1甲型流行性感冒患者(简称”甲流”)的临床 意义.方法:对54例H1N1甲流患者(包括4例重症甲流死亡患者)和50例正常对照者用电发光免疫分析,全 自动临床化学分析检测HlN1甲流患者心肌标志物及常规生化项目.结果:与正常对照组相比,甲型H1N1感 染者在治疗前血清肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH),肌酸激酶同工酶-Mb(CK—Mb),肌红蛋白(Mb),B型钠 尿肽(pro—BNP),丙氨酸氨基转移酶(ALT),碱性磷酸酶(ALP),谷氨酰转肽酶(GGT),门冬氨酸氨基转移酶 (AST)水平偏高(P<0.05),总蛋白(TP),白蛋白(Alb)偏低(P<0.05).H1N1甲流患者治疗前,后相比,CK, LDH,CK—Mb及Mb,AST治疗前水平偏高(P<0.05),TP水平偏低(P<0.05).死亡病例的心肌标志物指标: CK,LDH,CK-Mb,心肌肌钙蛋白(cTnT),Mb,pro-BNP及AST,TP,Alb,CREA均严重异常于其他比较组.结论: H1N1甲流患者的心肌标志物及常规生化指标检测结果及其变化对 于其诊疗及预后状况具有临床意义. 关键词新型甲型流行性感冒H1N1心肌标志物 ClinicalSignificanceofSerumCardiacMarkersDetectionand RoutineBiochemistryTestsinPatientswithInfluenzaTypeAH1N1VirusInfection HarIRong,ZhouYi’,YangJi-kang,eta1. DepartmentofClinicallaboratory,ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,Shanghai(201508),China Abstract0biectiveTostudytheclinicalsignificanceofcardiacmfll’kel’fldetectionandroutinebiochemistrytestsinpailents thinfluenzatypeAH1N1Virusinfection.MethodsSerumcardiacmarker8detection(wi血ECLIA)androutinebiochemistrytests wereperformedin54patientsthH1N1influenzafincluding4deaths)and50controls.ResultsIepre—therapylevelsofserunl CK,IJ)H,CK-Mb,Mb,pro-BNP,ALT,ALP,GGTandAsTinH1N1influenzapatientsweresignificantlyhigherthanthoseinthe controls(P<0.05),and11P,ALBlevelsweresignificantlylower(P<0.05).,nlepre-thempylevelsof8eDllnCK,LDH,CK—Mb, MbandASTinH1N1influenzapatientsweresignificantlyhigherthanthelevelsaftertreatment(P<0.05)butTPlevelsweresii矗. eanflydecreased(P<0.05).Thelevelsofallcardiacmal’ker$(CK,LDH,CK—Mb,cTnT,Mbandpro—BNP)andAsT,11P,Alb, CREAintlle4deathswereverysignificantlydifferentfromthoseinothergrou ps.ConclusionChangesof8enllncardiacmarkersIcy- elsandroutinebiechemistrytestswerefdiagnosticandprognosticsignificanc e. KeyWordsnewtypeinfluenzaA.H1N1.cardiacmfll’ker8 2009年在全球范围出现了一种新型甲型流行性感冒病 毒H1N1(简称”甲流”),人体感染后主要表现为流感样症 状,包括发热,流涕,咽痛,头痛和腹泻等.流感病毒亦是 导致患者心肌损害常见因素之一,而重症甲流患者则会出现 多脏器功能不全或衰竭甚至死亡.为了配合临床常规诊疗 及预防,实验室对甲型H1N1感染者治疗前后的心肌标志物 指标,肝,肾功能等常规生化项目做了检测和比较,从而为甲 型H1N1患者的实验室检测诊断提供参考. ‘通讯作者 1材料和方法 1.1对象 1.1.1病例组:上海市公共卫生临床中心2009年4月,12 月住院隔离的54例(男40,女14)H1N1甲流患者(4例为重 症死亡者).诊断主要依据:有流行病学史,有发热,流涕, 咽痛等流感样症状,咽拭子标本反转录聚合酶链反应 (1’cversctranscfiptase—polymerasechainreaction,RT—PeR)结果 阳性.年龄(20—68)岁,平均4o岁,均服用抗病毒药物奥司 他韦,75rag一日两次,疗程5d. 1.1.2正常对照组:50例体检健康者,年龄(I7—50)岁,平