高效液相色谱使用方法

高效液相色谱使用方法 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解 性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至 Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节 省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 1、 打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、 设置检测波长 3、 预热30分钟左右，即可注样测定。 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4?)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多， 则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程 反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素， 将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60?蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35?，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。 一、取样 称取样品（番茄(甜瓜)果肉重1～2 g、叶肉（无大叶脉）2g）?置于试管（带玻璃试管塞）?倒入80％乙醇，浸没样品约1cm?80?水浴1h?冷却后封存。 二、提取 倒出乙醇提取液入25ml容量瓶?再向试管中加入80％乙醇，80?水浴1h，如此反复提取次?合并提取液后定容 三、浓缩 取10-25ml溶液，加入蒸发皿中，放置在水溶锅上蒸干备用。 四、过滤 用1ml超纯水将蒸发皿中的糖全部溶解，吸入1ml注射器，过0.45μm滤膜。若样品色素较多，需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。 C18小柱使用方法： C18柱：甲醇（5ml）-----乙醚（5ml）-------80%乙醇（5ml）-----样品--------80%乙醇（样品量的二倍）------乙醚-------80%乙醇-----样品--------80%乙醇 五、HPLC测定 测定方法及色谱条件为：Water 600E高效液相色谱，碳水化合物柱，柱温30-35?，2410示差检测器，流动相比例为75％乙腈：25％超纯水，流速为1.0ml min -1,Water Millennium软件控制及数据处理 （先溶解、快到1升时调PH值） 1、50m M HePes—NaOH(PH7.5)缓冲液体系配置(1升) 50 m M HePes：11.9150g NaCl:16.0 g kCl::0.74 NaHPO4.12H2O:0.543 2 葡萄糖：2 1m M EDTA:0.3722 10 m M MgCl:2.0330 2.5 m M DTT :0.3856 () 10 m M Vc 1.7614 2 、PVPP:固体 3、0.1M NaHPO4-柠檬酸（PH4.8） 0.2M NaHPO4（35.8/500ml 9.86ml ） 0.1M柠檬酸 (21.01g/L 10.14ml ) 4、0.1M NaHPO4-柠檬酸 PH：7.2 0.2M NaHPO4 17.39 ml 0.1M柠檬酸 2.61 ml 5、0.1M蔗糖：3.4229g定容至100 ml 6、2N NaOH:8g NaOH定容至100 ml 7、30%HCl:39.5ml浓HCL加入到10.5 ml 水中 8、0.1%间苯二酚：95%乙醇+0.1 g 间苯二酚定容至 100 ml 9、0.05M F-6-P 0.2020g F-6-P+5 ml0.1 N HCl + 数滴10%K SO至白色沉淀不在形成，10000g离心10分钟，弃沉24淀，上清夜+1N NaOH调PH=7.0 10 ml 10、UDPG：0.205g/25ml 11、Tris:0.1M ,仅是Tris，无盐酸 12、5 nM MgCl 2 13、0.1N HCl:0.862 ml HC定容至100 ml 14、0.05M 果糖。 15、DNS试剂 将6.3 gDNS和262ml 2 M NaOH溶液，加到500 ml含有185g酒石酸钾钠的热水混液中，在加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。 .1g样品 冰浴研磨(加少量石英沙) 匀浆 四层纱 + 0.5g pvpp + 3mlHePES + 3mlHEPES + 4mlHepes 布过滤 12000g(4?) 弃沉淀 上清夜+6.0g硫酸铵(放置15分钟) 20分钟 使之完全溶解 12000g(4?) 弃上清夜 3mlHepes溶解沉淀 移到透析 20分钟 袋中 用稀释10倍的Hepes(不含pvpp )4?培养箱中透析20小时(以上操作均在 0～4?下进行) -1-1?gFW) ? ?酸性转化酶 0.6ml(0.1M Na (μmol Glucose?hHPO 柠檬酸 PH4.8 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的) 24 ? 中性转化酶 0.6ml(0.1M KHPO 柠檬酸 PH7.2 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的) 24 ?总体积为1ml(放在小离心管中) 37?孵育30分钟后 转到试管中+1ml蒸馏水 +1.5ml 3,5-二硝基水杨酸（DNS） 空白2ml蒸馏水 沸水浴5分钟 流水冷却 每管中加21。5ml蒸馏水 520nm比色。 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS试剂（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 沸水浴5分钟，立即用自来水冷却 蒸馏水（ml） 21．5 21．5 21．5 21．5 21．5 21．5 21．5 21．5 21．5 OD520nm (μmol Sucrose?h-1-1?gFW) ??蔗糖合成酶 0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml(0.0082 g/ml UDPG)+0.1ml(0.1M Tris)+0。1ml(5mM MgCl)+0.2ml酶液 2 ?蔗糖磷酸合成酶 0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml UDPG+0.1ml(0.1M Tris)+0。1ml(5mM MgCl)+0.2ml酶液 2 ?上述反应在37?保温30分钟 100?水浴1分钟 定容至1ml 调零1ml蒸馏水 +0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟 流水冷却 转到试管中 +3.5ml(30%HCl) +1ml(0.1%间苯二酚)（用95%乙醇溶液） 摇匀 80?水浴10分钟 流水冷却 480nm比色 先配制200μg/ml的蔗糖溶液 0 1 2 3 4 5 6 蔗糖标准液（ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 加蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 浓度 0 20.00 40.00 80.00 120.00 160.00 200.00 OD480 0.1202 0.2069 0.3373 0.4572 0.6003 0.7657 每支试管中+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟 流水冷却 +3.5ml(30% HCl) 1ml(0.1%间苯二酚) 摇匀 80?水浴10分钟 流水冷却 540nm比色